口腔粘膜肥大细胞介质对成纤维细胞超微结构的影响
作者：苏葵 刘蜀凡 沈子华 彭隆祥
单位：苏葵(广东省中山市人民医院口腔科 528403)；刘蜀凡(湖南医科大学口腔系)；沈子华(湖南医科大学口腔系)；彭隆祥(电镜室)
关键词：肥大细胞；成纤维细胞；形态学；口腔粘膜下纤维化
实用口腔医学杂志000312〔摘要〕 目的：研究口腔粘膜下纤维性变(OSF)组织中胶原纤维增生的原因。 方法：采用分离纯化人胚口腔粘膜肥大细胞的介质溶液(OMMCC)与体外培养的人胚口腔粘膜成 纤维细胞(OMFb)共同培养，对OMFb进行形态计量分析。结果：OMFb 内粗面内质 网(RER)和线粒体(Mi)体密度、面密质和Mi的数密度增大，RER和Mi的比表面减小。结论：OM MCC可促进OMFb分泌胶原蛋白的功能，肥大细胞可能参与了OSF胶原增生的病理过程。
中图分类号：R781.9 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1001-3733(2000)03-0208-03
The effects of mast cells on the ultrastructure
of fibroblasts derived from oral mucosa
Su Kui,Liu Shufan,Shen Zihua,et al.
(The People's Hospital of Zhongshan City, Gua ngdong Province,Zhongshan 528403)
〔Abstract〕Objective:To study the effects of mast cells on the ultra structure o f fibroblasts derived from oral mucosa.Method:Mast cells w ere isolated and purif ied from human embryo oral mucosa (OMMCC) and were co-cultured with the fibrobl asts from human embryo oral mucosa (OMFb).The rough endoplasmic reticula (RER) a nd mitchondria (Mi) of OMFb were observed and analyzed.Results:The volume densit y and surface density of RER and Mi,the numerical density of Mi in co-cultured OMFb increased significantly (P<0.01),the specific surface of RER and Mi de crea sed significantly.(P<0.01).Conclusion:The OMMCC can p romote proliferation of OM Fb, and the function of proliferative OMFb is active,the mast cells might be rel ated to the oral submucous fibrosis.
, 百拇医药
Key words Mast cells;Fibroblasts;Morphology;Oral submucous fibr osis▲
口腔粘膜下纤维性变(oral submucous fibrosis, OSF)主要表现在粘膜固有层和粘膜下 层胶原纤维增生，其病因尚不清楚。本课题组在OSF早期病变组织中观察到肥大细胞(mast c ell, MC)数量增多，并观察到MC与成纤维细胞(fibro blast,Fb)紧密相嵌，Fb吞噬MC 颗粒的 现象，同时发现吞噬了MC颗粒的Fb分泌胶原蛋白功能活跃〔1〕。为进一步了解MC对F b的作用和MC在OSF中所起的作用，本研究采用分离纯化的MC介质溶液与体外培养的Fb共同培 养，观察MC能否促进Fb分泌胶原蛋白，以探讨OSF胶原增生的机制。
1 材料与方法
1.1 人胚口腔粘膜成纤维细胞(oral mucous fibroblast,OMFb)培养
, http://www.100md.com
取胎龄3～4月胎儿的口腔颊粘膜，按鄂征〔2〕组织消化原代细胞培养方法进行 OMFb原代培养，经5～6次传代，OMFb自然纯化。
1.2 人胚口腔粘膜肥大细胞内容物(oral mucous mast cell contents,OMMCC)提取
按Larence 〔3〕 的肥大细胞提取法，取胎龄3～4月胎儿的口腔粘膜，在Han k液中反复漂洗，剪成0.5～1.0 mm的碎片，加入I型胶原酶1 g/L，透明质酸酶1 g/L(二者 均为Sigma公司产品)，37 ℃消化30 min，尼龙网(150 μm)过滤，残渣再消化一次，滤液离 心(1 000 r/min)10 min去上清，加入RPMI-1 640细胞培养基(Sigma公司产品)，含 体积分数为10%小牛血清(杭州 四季清生物制品厂)、青霉素10 U、链霉素100 g/L，配成有核细胞悬液。用比重为1 0 7 7 g/L的淋巴细胞分离液和比重为1 140 g/L的Ficoll液(均为上海试剂二厂产品)配成比重1 09 3 g/L和1 083 g/L 的两种MC分离液，在离心管中先加入2 ml比重1 093 g/L的分离液，再加 入 2 ml比重1 083 g/L的分离液，然后加入1 ml有核细胞悬液，离心(2 500 r/min，10 min)， 吸 取两种比重分离液间的界面液体，再同法反复离心提纯界面液8次，获取MC悬液。取少许细 胞悬液于体积分数为10%中性福尔马林固定，经甲苯胺蓝、阿尔新蓝、沙红染色和电镜证实 为MC(图1)并计数MC纯度达90%以上，调整细胞密度为2×108个/L，用CPS-1A型超声波粉 碎机 击碎MC，获取OMMCC溶液，即含有肥大细胞介质的溶液，其溶剂为RPMI-1 640细胞培养液。
, 百拇医药
1.3 OMMCC与OMFb共同培养
消化收集第7代的OMFb，调整细胞密度为2×108个/L，以每瓶1 ml的量接种于培养瓶中， 再加入4 ml培养基，37 ℃、体积分数为5%CO2培养24 h后，实验组加入1 ml OMMCC，对照 组加入1 ml RPMI-1640培养基，继续培养。
1.4 OMFb透射电镜制样
共同培养120 h后，实验及对照各取3瓶细胞，收集细胞，体积分数为2.5%的戊二醛预固定2 h，10 g/L锇酸后固定1 h，然后按常规超薄切片制样，每标本制两个铜网，透射电镜观察。
1.5 OMFb的形态计量
每个铜网随机拍摄5个OMFb，放大10 000倍，每组共拍摄30个细胞，用PC Vision PLus(85型 )图 像分析系统(美国)分别测算OMFb胞浆内粗面内质网(rough endoplasmic reticula,RER)、线 粒体(mitchondra,Mi)的体密度(Vv)、面密度(Sv)，比表面(δ)以及Mi的数密度(Nv)。
, 百拇医药
2 结 果
电镜下实验组OMFb多呈梭形，细胞核较大，常染色质丰富，异染色质较少，胞浆内RER增生 扩张(图2)，线粒体增生(图3)，计量结果如表1。对照组OMFb胞浆内RER、Mi均较实验组少 ，RER亦有扩张但不如实验组明显。
图1 分离的肥大细胞，胞浆内可见颗粒(×10 000)
图2 成纤维细胞内增生，扩张的粗面内质网(×10 000)
图3 成纤维细胞内增生的线粒体(×10 000)
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表1 OMFb的RER、Mi形态计量 (
±s) 项目
实验组(n=30)
对照组(n=30)
RER Vv%
19.37±6.96
10.20±7.38①
Sv%(mm-1)
10.39±2.72
7.35±2.60①
, 百拇医药
δ(mm-1)
0.54±0.25
0.72±0.11①
Mi Vv%
4.81±0.69
2.67±2.07①
Sv%(mm-1)
2.98±0.42
2.00±1.52①
δ(mm-1)
, 百拇医药
0.62±0.11
0.75±0.07①
Nv%0(mm-3)
0.54±0.17
0.23±0.17①
①t检验 P<0.001
3 讨 论
MC含有40多种生物活性物质，目前的研究发现下列活性物质与纤维化有一定关系：①组胺是 一种促有丝分裂剂，可刺激Fb生长及合成胶原增加〔4〕；②IL-1可直接增加I、Ⅲ 、Ⅳ型胶原的转录，促进纤维化的形成〔5〕；③IL-4能刺激Fb合成I、Ⅲ型胶原和 纤 维连结蛋白，促进纤维化的形成〔6〕；④肝素蛋白多糖可选择性与来源于内皮细胞 、巨噬细胞及Fb本身所分泌的与肝素结合的生长因子结合，增强生长因子的作用，刺激Fb增 生〔7〕；⑤胃促胰酶能降解Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白，解除Fb间的接触抑制，使Fb 增生〔8〕。本课题组另一OMMCC与OMFb共同培养实验〔9〕也发现：共同培养5 d后，OMFb数由2×108个/L增至5.9×108个/L，而对照组仅为4.1×108个/L，两者 有显著性差异，说明OMMCC有促进OMFb生长的作用。
, http://www.100md.com
本研究采用OMMCC与OMFb共同培养，试图研究MC对Fb功能的影响，结果发现OMFb内RER的Vv、 Sv增大，δ减小，说明RER扩张。RER扩张被认为是分泌胶原蛋白功能活跃的标志〔10〕 。OMFb内RER定量分析结果表明MC有促进Fb分泌胶原蛋白的功能。
Mi的形态计量表明，实验组Mi较对照组明显增生扩张，Mi是进行有氧呼吸和提供能量的场所，Mi增多为Fb的分裂增生和合成胶原提供能量。■
参考文献
[1]苏葵，刘蜀凡，沈子华，等.肥大细胞与口腔粘膜下纤维性变关系的初步研究.中 华口腔医学杂志，1997，32(4)：253
[2]鄂征主编.组织培养技术.北京：人民卫生出版社，1985.114～178
[3]Larence IRAD,Warner JA,Cohan VL,et al.Purification and characterization of hum an skin mast cells.Evidence for human mast cell heterogeneity.J Immunol,1987,139 (9):3062
, 百拇医药
[4]Hatamochi A,Fujinara K,Veki H.Effects of histamine on collagen synthesis by cu ltured fibroblasts derived from guinea pig skin.Arch Dermatol Res,1985,277(1):60
[5]Canalis E.IL-1 has independ effects on deoxyibonucleic acid and collagen synt hesis in cultures of rat calvarine.Endocrinology,1986,118(1):74
[6]Postlethuaite AE,Holness MA,Katai,et al.Human fibroblasts synthesize eleva ted levels of extracellular matrix proteins in response to IL-4.J Clin Invest,1992, 90(4):1479
, http://www.100md.com
[7]Yamashita Y,Nakagomi K,Takeda T,et al.Effect of heparin on pulmonary fibro blasts and vascullar cells.Thorax,1992,47(8):634
[8]Vartio T,Seppa H,Vaheri A.Susceptibility of solube and matrix fibronectins to deganulation by tissue proteinases,mast chymase and cathepsin G.J Biol chem,1981 ,256(1):471
[9]苏葵，刘蜀凡，沈子华，等.肥大细胞介质促成纤维细胞生长的实验研究.华西口腔医学杂 志，1995,13(4):245
[10]周开渠，彭庆廉.固有结缔组织.见：成会忠主编.组织学.第2版.北京：人民卫生出版社,1993.219～241
收稿日期：1999-07-21
修稿日期：1999-12-15, 百拇医药
单位：苏葵(广东省中山市人民医院口腔科 528403)；刘蜀凡(湖南医科大学口腔系)；沈子华(湖南医科大学口腔系)；彭隆祥(电镜室)
关键词：肥大细胞；成纤维细胞；形态学；口腔粘膜下纤维化
实用口腔医学杂志000312〔摘要〕 目的：研究口腔粘膜下纤维性变(OSF)组织中胶原纤维增生的原因。 方法：采用分离纯化人胚口腔粘膜肥大细胞的介质溶液(OMMCC)与体外培养的人胚口腔粘膜成 纤维细胞(OMFb)共同培养，对OMFb进行形态计量分析。结果：OMFb 内粗面内质 网(RER)和线粒体(Mi)体密度、面密质和Mi的数密度增大，RER和Mi的比表面减小。结论：OM MCC可促进OMFb分泌胶原蛋白的功能，肥大细胞可能参与了OSF胶原增生的病理过程。
中图分类号：R781.9 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1001-3733(2000)03-0208-03
The effects of mast cells on the ultrastructure
of fibroblasts derived from oral mucosa
Su Kui,Liu Shufan,Shen Zihua,et al.
(The People's Hospital of Zhongshan City, Gua ngdong Province,Zhongshan 528403)
〔Abstract〕Objective:To study the effects of mast cells on the ultra structure o f fibroblasts derived from oral mucosa.Method:Mast cells w ere isolated and purif ied from human embryo oral mucosa (OMMCC) and were co-cultured with the fibrobl asts from human embryo oral mucosa (OMFb).The rough endoplasmic reticula (RER) a nd mitchondria (Mi) of OMFb were observed and analyzed.Results:The volume densit y and surface density of RER and Mi,the numerical density of Mi in co-cultured OMFb increased significantly (P<0.01),the specific surface of RER and Mi de crea sed significantly.(P<0.01).Conclusion:The OMMCC can p romote proliferation of OM Fb, and the function of proliferative OMFb is active,the mast cells might be rel ated to the oral submucous fibrosis.
, 百拇医药
Key words Mast cells;Fibroblasts;Morphology;Oral submucous fibr osis▲
口腔粘膜下纤维性变(oral submucous fibrosis, OSF)主要表现在粘膜固有层和粘膜下 层胶原纤维增生，其病因尚不清楚。本课题组在OSF早期病变组织中观察到肥大细胞(mast c ell, MC)数量增多，并观察到MC与成纤维细胞(fibro blast,Fb)紧密相嵌，Fb吞噬MC 颗粒的 现象，同时发现吞噬了MC颗粒的Fb分泌胶原蛋白功能活跃〔1〕。为进一步了解MC对F b的作用和MC在OSF中所起的作用，本研究采用分离纯化的MC介质溶液与体外培养的Fb共同培 养，观察MC能否促进Fb分泌胶原蛋白，以探讨OSF胶原增生的机制。
1 材料与方法
1.1 人胚口腔粘膜成纤维细胞(oral mucous fibroblast,OMFb)培养
, http://www.100md.com
取胎龄3～4月胎儿的口腔颊粘膜，按鄂征〔2〕组织消化原代细胞培养方法进行 OMFb原代培养，经5～6次传代，OMFb自然纯化。
1.2 人胚口腔粘膜肥大细胞内容物(oral mucous mast cell contents,OMMCC)提取
按Larence 〔3〕 的肥大细胞提取法，取胎龄3～4月胎儿的口腔粘膜，在Han k液中反复漂洗，剪成0.5～1.0 mm的碎片，加入I型胶原酶1 g/L，透明质酸酶1 g/L(二者 均为Sigma公司产品)，37 ℃消化30 min，尼龙网(150 μm)过滤，残渣再消化一次，滤液离 心(1 000 r/min)10 min去上清，加入RPMI-1 640细胞培养基(Sigma公司产品)，含 体积分数为10%小牛血清(杭州 四季清生物制品厂)、青霉素10 U、链霉素100 g/L，配成有核细胞悬液。用比重为1 0 7 7 g/L的淋巴细胞分离液和比重为1 140 g/L的Ficoll液(均为上海试剂二厂产品)配成比重1 09 3 g/L和1 083 g/L 的两种MC分离液，在离心管中先加入2 ml比重1 093 g/L的分离液，再加 入 2 ml比重1 083 g/L的分离液，然后加入1 ml有核细胞悬液，离心(2 500 r/min，10 min)， 吸 取两种比重分离液间的界面液体，再同法反复离心提纯界面液8次，获取MC悬液。取少许细 胞悬液于体积分数为10%中性福尔马林固定，经甲苯胺蓝、阿尔新蓝、沙红染色和电镜证实 为MC(图1)并计数MC纯度达90%以上，调整细胞密度为2×108个/L，用CPS-1A型超声波粉 碎机 击碎MC，获取OMMCC溶液，即含有肥大细胞介质的溶液，其溶剂为RPMI-1 640细胞培养液。
, 百拇医药
1.3 OMMCC与OMFb共同培养
消化收集第7代的OMFb，调整细胞密度为2×108个/L，以每瓶1 ml的量接种于培养瓶中， 再加入4 ml培养基，37 ℃、体积分数为5%CO2培养24 h后，实验组加入1 ml OMMCC，对照 组加入1 ml RPMI-1640培养基，继续培养。
1.4 OMFb透射电镜制样
共同培养120 h后，实验及对照各取3瓶细胞，收集细胞，体积分数为2.5%的戊二醛预固定2 h，10 g/L锇酸后固定1 h，然后按常规超薄切片制样，每标本制两个铜网，透射电镜观察。
1.5 OMFb的形态计量
每个铜网随机拍摄5个OMFb，放大10 000倍，每组共拍摄30个细胞，用PC Vision PLus(85型 )图 像分析系统(美国)分别测算OMFb胞浆内粗面内质网(rough endoplasmic reticula,RER)、线 粒体(mitchondra,Mi)的体密度(Vv)、面密度(Sv)，比表面(δ)以及Mi的数密度(Nv)。
, 百拇医药
2 结 果
电镜下实验组OMFb多呈梭形，细胞核较大，常染色质丰富，异染色质较少，胞浆内RER增生 扩张(图2)，线粒体增生(图3)，计量结果如表1。对照组OMFb胞浆内RER、Mi均较实验组少 ，RER亦有扩张但不如实验组明显。
图1 分离的肥大细胞，胞浆内可见颗粒(×10 000)
图2 成纤维细胞内增生，扩张的粗面内质网(×10 000)
图3 成纤维细胞内增生的线粒体(×10 000)
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表1 OMFb的RER、Mi形态计量 (
±s) 项目实验组(n=30)
对照组(n=30)
RER Vv%
19.37±6.96
10.20±7.38①
Sv%(mm-1)
10.39±2.72
7.35±2.60①
, 百拇医药
δ(mm-1)
0.54±0.25
0.72±0.11①
Mi Vv%
4.81±0.69
2.67±2.07①
Sv%(mm-1)
2.98±0.42
2.00±1.52①
δ(mm-1)
, 百拇医药
0.62±0.11
0.75±0.07①
Nv%0(mm-3)
0.54±0.17
0.23±0.17①
①t检验 P<0.001
3 讨 论
MC含有40多种生物活性物质，目前的研究发现下列活性物质与纤维化有一定关系：①组胺是 一种促有丝分裂剂，可刺激Fb生长及合成胶原增加〔4〕；②IL-1可直接增加I、Ⅲ 、Ⅳ型胶原的转录，促进纤维化的形成〔5〕；③IL-4能刺激Fb合成I、Ⅲ型胶原和 纤 维连结蛋白，促进纤维化的形成〔6〕；④肝素蛋白多糖可选择性与来源于内皮细胞 、巨噬细胞及Fb本身所分泌的与肝素结合的生长因子结合，增强生长因子的作用，刺激Fb增 生〔7〕；⑤胃促胰酶能降解Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白，解除Fb间的接触抑制，使Fb 增生〔8〕。本课题组另一OMMCC与OMFb共同培养实验〔9〕也发现：共同培养5 d后，OMFb数由2×108个/L增至5.9×108个/L，而对照组仅为4.1×108个/L，两者 有显著性差异，说明OMMCC有促进OMFb生长的作用。
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本研究采用OMMCC与OMFb共同培养，试图研究MC对Fb功能的影响，结果发现OMFb内RER的Vv、 Sv增大，δ减小，说明RER扩张。RER扩张被认为是分泌胶原蛋白功能活跃的标志〔10〕 。OMFb内RER定量分析结果表明MC有促进Fb分泌胶原蛋白的功能。
Mi的形态计量表明，实验组Mi较对照组明显增生扩张，Mi是进行有氧呼吸和提供能量的场所，Mi增多为Fb的分裂增生和合成胶原提供能量。■
参考文献
[1]苏葵，刘蜀凡，沈子华，等.肥大细胞与口腔粘膜下纤维性变关系的初步研究.中 华口腔医学杂志，1997，32(4)：253
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[5]Canalis E.IL-1 has independ effects on deoxyibonucleic acid and collagen synt hesis in cultures of rat calvarine.Endocrinology,1986,118(1):74
[6]Postlethuaite AE,Holness MA,Katai,et al.Human fibroblasts synthesize eleva ted levels of extracellular matrix proteins in response to IL-4.J Clin Invest,1992, 90(4):1479
, http://www.100md.com
[7]Yamashita Y,Nakagomi K,Takeda T,et al.Effect of heparin on pulmonary fibro blasts and vascullar cells.Thorax,1992,47(8):634
[8]Vartio T,Seppa H,Vaheri A.Susceptibility of solube and matrix fibronectins to deganulation by tissue proteinases,mast chymase and cathepsin G.J Biol chem,1981 ,256(1):471
[9]苏葵，刘蜀凡，沈子华，等.肥大细胞介质促成纤维细胞生长的实验研究.华西口腔医学杂 志，1995,13(4):245
[10]周开渠，彭庆廉.固有结缔组织.见：成会忠主编.组织学.第2版.北京：人民卫生出版社,1993.219～241
收稿日期：1999-07-21
修稿日期：1999-12-15, 百拇医药