咬合力与大鼠牙周组织改建关系研究中动物模型的建立
作者：袁林 赵云凤 周伟东
单位：袁林(第四军医大学口腔医学院修复科 710032)；赵云凤(华西医科大学口腔医学院修复科)；周伟东(第一军医大学珠江医院)
关键词：动物模型； 咬合力；牙周组织
实用口腔医学杂志000309〔摘要〕 目的：研究在体内情况下咬合力影响牙周组织改建的分子机制 。方法：采用拔牙法拔除大鼠一侧上颌磨牙，建立模拟下颌磨牙咬合力丧失及增强的动物模型。选择某一特定细胞因子(IL-6)用于免疫组化、原位杂交实验中鉴定，且行组织形态学观察(HE染色)。结果：免疫组化以及原位杂交结果显示，IL-6蛋白及IL-6 mRNA表 达在咬合力增强组及减弱组 均较正常咬合力组明显改变。组织形态学观察表明，咬合力增强及减弱对牙周组织改建的影 响与正常咬合力明显不同。结论：通过拔除大鼠一侧上颌磨牙建立 的动物模型，达到较好地模拟咬合力丧失、增强的目的。此动物模型有效、可靠。
, 百拇医药
中图分类号：R318.01 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)03-0199-03
Establishment of an animal model for the study of the effects
of bite f orce on rat periodontium remodeling
Yuan Lin, Zhao Yunfeng, Zhou Weidong.
(Department of Prosthodontics, Stomatolog ical College,Fourth Military Medical University, Xian 710032)
, 百拇医药
〔Abstract〕 Objective: To establish an animal model for the study of molecular mechanism of the effects of bite force on periodontium remodeling.Methods: Left maxillary molars of rats were extracted and the left mandibular molar area was used as the bite force loss; right mandibula r molars served as bite force increase. Periodontium remodeling on both sides wa s observed with HE staining, immunohistochemistry and in situ hybridization te chniques 1,2,3 and 4 weeks after the extraction. Results: Decrease of periodontal space was observed in the group of bite force loss and i n crease in the group of bite force increase at all the intervals of observation ( P<0.05).Increased IL-6 and IL-6 mRNA expression was found in the two teste d groups. Conclusion: The animal model may be used to rep resent the bite force loss and bite force increase.
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Key words Animal model; Bite force; Periodonti um ▲
口腔修复临床观察到，咬合力减弱时，牙周组织发生退行性变，牙槽骨骨小梁吸收 ，骨应力线不明显。咬合力增强，如在生理限度内，可见骨应力线增强；如超出生理限度， 出现骨小梁吸收，骨应力线不明显。此现象说明作用于牙上的咬合力可传递至牙周组织引起 其改建。
力与牙周组织改建关系的研究，以往一般采用体外实验进行。但要弄清咬合力如何影响 牙周组织改建的分子机制就必须采用体内实验的方法，必须建立模拟不同咬合力状态的动物 模型用于多方面的实验研究以探索其机制。
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立
选用80只体重为(250±20) g的成年雄性Wistar大鼠，随机等量 地分为对照组和实验组。实验组拔除左侧上颌(B区)所有磨牙使左侧下颌(D区)磨牙丧失对 颌牙导致咬合力丧失(为实验1组)，而对侧下颌(C区)磨牙功能代偿性增强，所受咬合 力增大(为实验2组)；对照组未作处理，因此咬合力正常。所 有动物均定 时、定量摄食，自由饮水。两组动物分别在实验后6 h,1、2、3 d,1、2、3、4周各处死5 只，共16组。
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1.2 组织标本制备
实验动物采用40 g/L多聚甲醛心内灌注的方式行内固定，取出下颌 骨，仅保留磨牙区骨段，置于40 g/L多聚甲醛中再固定6 h。将标本移至脱钙液(含0.7 g /L EDTA，8 mg/L酒石酸钠钾，0.14 g/L酒石酸钠，99.2 ml/L HCl)中保存2周。梯度乙醇 脱水，石蜡包埋。组织切片厚度为5 μm，裱于经硅化处理的玻片上。
1.3 组织形态学
取相应切片进行苏木素-伊红(HE)染色，在光学显微镜下观察牙周 形态变化，并用显微标尺对牙周膜宽度进行测量。每个标本选第一磨牙牙根为观察对象，近 、远中侧牙周膜根中1/3区各取3处进行测量，取平均值，结果用t检验进行统计学分析 。
1.4 免疫组化
取相应切片按常规免疫组化ABC法染色，观察细胞因子IL-6在咬合力 影响大鼠牙周组织改建中的作用。同时设不加一抗的阴性对照组。
, 百拇医药
1.5 原位杂交
取相应切片，采用IL-6寡核苷酸探针进行原位杂交，研究不同咬合力 影响大鼠牙周组织改建过程中IL-6 mRNA表达的变化。
2 结 果
2.1 组织形态学
采用此模型制备的组织切片，进行HE染色。组 织形态学观察到对照组大鼠牙周膜结构致密，纤维、细胞排列有序，成纤维细 胞胞核的方向与之一致。牙槽骨骨壁较平，表面衬以连续排列的扁平成骨细胞(图1)。实验2组2周时牙周膜宽度明显增加 ，牙周膜结构致密。其纤维、细胞排列 有 序。牙槽骨骨壁凹凸不平，有活跃的骨吸收陷窝(其内可见破骨细胞)，同时可见交替出现 的骨形成区，成骨细胞胞核较大。3周、4周时，牙周膜与2周时比无明显变化；牙槽骨骨壁 较平，骨形成区更加明显，破骨细胞数量大大减少(表1、图2)。
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实验1组2周时牙周膜结构稀疏，纤维、细胞的排列明显紊乱。牙槽骨骨壁凹 凸不平，有很多骨吸收陷窝，其内可见破骨细胞。3周、4周时，牙周膜结构更加紊乱，牙槽 骨中的破骨细胞数量减少(表1、图3)。
表1 实验组和对照组不同实验时间牙周膜宽度差值表(单位：10-2 mm)
对照组
(正常咬合力)
实验1组
实验2组
1周
2周
3周
4周
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1周
2周
3周
4周
近中侧
9.1±1.1
8.3±1.0
7.5±0.9①
7.3±0.9①
7.2±0.8①
9.6±0.9
11.0±1.0①
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11.6±1.0①
11.9±1.1①
远中侧
7.9±0.6
7.0±0.8
6.2±0.7①
6.1±0.7①
6.0±0.7①
8.0±0.8
9.1±0.8①
, 百拇医药 9.5±1.0①
9.9±0.9①
①表示P<0.05，
图1 对照组2周近中侧牙周组织HE染色×50
图2 实验2组2周近中侧牙周组织HE染色×50
图3 实验1组2周近中侧牙周组织HE染色×50
2.2 免疫组化
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研究结果表明，阴性对照组无IL-6表达。正常咬合力对照组有少量IL- 6表达，实验组(咬合力增强或丧失)IL-6表达均明显增强，且出现一定的时间规律。
2.3 原位杂交
研究结果显示，阴性对照组无IL-6 mRNA表达。正常咬合力对照组有少量 IL-6 mRNA表达。实验组(咬合力增强组或丧失组)IL-6 mRNA表达均明显增强，且出现一 定的时间规律。实验结果与免疫组化结果相符。
3 讨 论
为了进行在体内情况下咬合力对牙周组织影响的研究，国外学者一般采用以下几种方法来模 拟 不同的咬合力状态，建立咬合力减弱或增强的动物模型：①磨低牙，Steigman〔1〕 通过磨除一 定的牙体组织，使牙脱离咬合接触而达到减轻功能，减小咬合力的目的。如果磨除一侧牙， 则另一侧牙的功能就代偿性增强，所受咬合力就相应增大〔2〕。②软食〔3〕 ，给实验动物喂软 食或流汁，则其牙所受咬合力相应减小。③肌肉切除，Horowitz〔4〕通过切除相应 的咀嚼肌 ，使实验动物的咀嚼功能下降，则咬合力减小。④固定桥修复,Verstraete〔5〕 采用拔牙后固定桥修复单个切牙，观察到桥基牙所受咬合力增大。⑤拔牙〔6～8〕 ，通过拔 除一个区的部分牙或单个牙，使对颌相对磨牙丧失咬合接触，来达到减小对颌牙所受咬合力 的目的。如仅拔除少数牙，为避免牙 合创伤还需配合调牙 合。
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在上述5种方法中，应用最广的是拔牙法。因为该种方法不仅简便易行，而且所模拟的情况 是临床中常见现象。该模型重复性好，能较理想地达到建立咬合力减弱与增强的目的，故从 60年代开始，一直被采用至今。但以往学者们多采用拔除一个区的部分牙或单个牙来 建模。本实验也采用了拔牙法的方式建模，但拔除的是一侧的所有磨牙。
本实验组织形态学观察到对照组(正常咬合力组)大鼠牙周膜结构致密，纤维、细胞排列有 序。牙槽骨骨壁较平。而实验2组2周时牙周膜宽度明显增加 ，牙周膜结 构 致密，其纤维、细胞排列有序。牙槽骨骨壁凹凸不平，可见交替出现的骨形成区。实验1组 2周时牙周膜结构稀疏，纤维、细胞的排列明显紊乱。牙槽骨骨壁凹凸不平 ，有很多骨吸收陷窝，其内可见破骨细胞。组织形态学观察结果表明，此方法建立的动物模 型，咬合力增强及减弱对牙周组织改建的影响与正常咬合力明显不同。
免疫组化和原位杂交实验结果显示，阴性对照组无IL-6及IL-6 mRNA表达，正常咬合力对 照组有少量表达，实验组(咬合力增强或丧失)表达IL-6及IL-6 mRNA明显增强，且出现 一定的时间规律。实验结果与组织形态学观察结果相符。
, http://www.100md.com
综上所述，本实验采用拔牙法建立的动物模型，通过免疫组化和原位杂交实验以及组织 形态学观察应证，认为此模型能较好地模拟咬合力增强、丧失的情况，较理想地达到了建立 两种咬合力状态的目的。应用于研究咬合力影响牙周组织改建的实验中，获得理想效果，认 为此动物模型有效、可靠。■
参考文献
[1]Steigmen S, Michael Y, Yitzhaki M,et al. A three-dimentional evalu ation of th e effects of functional occlusal force on the morphology of dental and periodont al tissues of the rat incisor. J Dent Rrs, 1989,68(8):1269
[2]Stallard RE. The effect of occlusal alterations on collagen formation within the periodontium . Periodontics, 1964,2:49
, 百拇医药
[3]Kiliaridis S, Engstrom C, Thilander B. The relationship between masticatory function and craniofacical morphology. Eur J Orthod, 1985,7.273
[4]Horowitz SL, Shapiro HH. Alveolar bone changs following alteration of mastic atory function in the rat. NY State Dent J, 1956,22.212
[5]Verstraete FJ. Fixed prosthodontic replacement of single incisors in three do gs. J Vet Dent,1994,11(4):125
[6]Gerard G, Michael L, Mailand L,et al. Histologic study of the effects of o ccl usal hypofunction following antagonist tooth extraction in the rat. J Periodonto l, 1980,51(7):393
[7]Cohn SA. Disuse atrophy of the periodontium in mice following partial loss of function. Arch Oral Biol, 1966,11.95
[8]Johnson RB. Effect of altered occlusal function on transseptal ligament and n ew bone thicknesses in the periodontium of the rat. Anat Res, 1990,187: 91
收稿日期：1999-08-28, http://www.100md.com
单位：袁林(第四军医大学口腔医学院修复科 710032)；赵云凤(华西医科大学口腔医学院修复科)；周伟东(第一军医大学珠江医院)
关键词：动物模型； 咬合力；牙周组织
实用口腔医学杂志000309〔摘要〕 目的：研究在体内情况下咬合力影响牙周组织改建的分子机制 。方法：采用拔牙法拔除大鼠一侧上颌磨牙，建立模拟下颌磨牙咬合力丧失及增强的动物模型。选择某一特定细胞因子(IL-6)用于免疫组化、原位杂交实验中鉴定，且行组织形态学观察(HE染色)。结果：免疫组化以及原位杂交结果显示，IL-6蛋白及IL-6 mRNA表 达在咬合力增强组及减弱组 均较正常咬合力组明显改变。组织形态学观察表明，咬合力增强及减弱对牙周组织改建的影 响与正常咬合力明显不同。结论：通过拔除大鼠一侧上颌磨牙建立 的动物模型，达到较好地模拟咬合力丧失、增强的目的。此动物模型有效、可靠。
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中图分类号：R318.01 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)03-0199-03
Establishment of an animal model for the study of the effects
of bite f orce on rat periodontium remodeling
Yuan Lin, Zhao Yunfeng, Zhou Weidong.
(Department of Prosthodontics, Stomatolog ical College,Fourth Military Medical University, Xian 710032)
, 百拇医药
〔Abstract〕 Objective: To establish an animal model for the study of molecular mechanism of the effects of bite force on periodontium remodeling.Methods: Left maxillary molars of rats were extracted and the left mandibular molar area was used as the bite force loss; right mandibula r molars served as bite force increase. Periodontium remodeling on both sides wa s observed with HE staining, immunohistochemistry and in situ hybridization te chniques 1,2,3 and 4 weeks after the extraction. Results: Decrease of periodontal space was observed in the group of bite force loss and i n crease in the group of bite force increase at all the intervals of observation ( P<0.05).Increased IL-6 and IL-6 mRNA expression was found in the two teste d groups. Conclusion: The animal model may be used to rep resent the bite force loss and bite force increase.
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Key words Animal model; Bite force; Periodonti um ▲
口腔修复临床观察到，咬合力减弱时，牙周组织发生退行性变，牙槽骨骨小梁吸收 ，骨应力线不明显。咬合力增强，如在生理限度内，可见骨应力线增强；如超出生理限度， 出现骨小梁吸收，骨应力线不明显。此现象说明作用于牙上的咬合力可传递至牙周组织引起 其改建。
力与牙周组织改建关系的研究，以往一般采用体外实验进行。但要弄清咬合力如何影响 牙周组织改建的分子机制就必须采用体内实验的方法，必须建立模拟不同咬合力状态的动物 模型用于多方面的实验研究以探索其机制。
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立
选用80只体重为(250±20) g的成年雄性Wistar大鼠，随机等量 地分为对照组和实验组。实验组拔除左侧上颌(B区)所有磨牙使左侧下颌(D区)磨牙丧失对 颌牙导致咬合力丧失(为实验1组)，而对侧下颌(C区)磨牙功能代偿性增强，所受咬合 力增大(为实验2组)；对照组未作处理，因此咬合力正常。所 有动物均定 时、定量摄食，自由饮水。两组动物分别在实验后6 h,1、2、3 d,1、2、3、4周各处死5 只，共16组。
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1.2 组织标本制备
实验动物采用40 g/L多聚甲醛心内灌注的方式行内固定，取出下颌 骨，仅保留磨牙区骨段，置于40 g/L多聚甲醛中再固定6 h。将标本移至脱钙液(含0.7 g /L EDTA，8 mg/L酒石酸钠钾，0.14 g/L酒石酸钠，99.2 ml/L HCl)中保存2周。梯度乙醇 脱水，石蜡包埋。组织切片厚度为5 μm，裱于经硅化处理的玻片上。
1.3 组织形态学
取相应切片进行苏木素-伊红(HE)染色，在光学显微镜下观察牙周 形态变化，并用显微标尺对牙周膜宽度进行测量。每个标本选第一磨牙牙根为观察对象，近 、远中侧牙周膜根中1/3区各取3处进行测量，取平均值，结果用t检验进行统计学分析 。
1.4 免疫组化
取相应切片按常规免疫组化ABC法染色，观察细胞因子IL-6在咬合力 影响大鼠牙周组织改建中的作用。同时设不加一抗的阴性对照组。
, 百拇医药
1.5 原位杂交
取相应切片，采用IL-6寡核苷酸探针进行原位杂交，研究不同咬合力 影响大鼠牙周组织改建过程中IL-6 mRNA表达的变化。
2 结 果
2.1 组织形态学
采用此模型制备的组织切片，进行HE染色。组 织形态学观察到对照组大鼠牙周膜结构致密，纤维、细胞排列有序，成纤维细 胞胞核的方向与之一致。牙槽骨骨壁较平，表面衬以连续排列的扁平成骨细胞(图1)。实验2组2周时牙周膜宽度明显增加 ，牙周膜结构致密。其纤维、细胞排列 有 序。牙槽骨骨壁凹凸不平，有活跃的骨吸收陷窝(其内可见破骨细胞)，同时可见交替出现 的骨形成区，成骨细胞胞核较大。3周、4周时，牙周膜与2周时比无明显变化；牙槽骨骨壁 较平，骨形成区更加明显，破骨细胞数量大大减少(表1、图2)。
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实验1组2周时牙周膜结构稀疏，纤维、细胞的排列明显紊乱。牙槽骨骨壁凹 凸不平，有很多骨吸收陷窝，其内可见破骨细胞。3周、4周时，牙周膜结构更加紊乱，牙槽 骨中的破骨细胞数量减少(表1、图3)。
表1 实验组和对照组不同实验时间牙周膜宽度差值表(单位：10-2 mm)
对照组
(正常咬合力)
实验1组
实验2组
1周
2周
3周
4周
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1周
2周
3周
4周
近中侧
9.1±1.1
8.3±1.0
7.5±0.9①
7.3±0.9①
7.2±0.8①
9.6±0.9
11.0±1.0①
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11.6±1.0①
11.9±1.1①
远中侧
7.9±0.6
7.0±0.8
6.2±0.7①
6.1±0.7①
6.0±0.7①
8.0±0.8
9.1±0.8①
, 百拇医药 9.5±1.0①
9.9±0.9①
①表示P<0.05，
图1 对照组2周近中侧牙周组织HE染色×50
图2 实验2组2周近中侧牙周组织HE染色×50
图3 实验1组2周近中侧牙周组织HE染色×50
2.2 免疫组化
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研究结果表明，阴性对照组无IL-6表达。正常咬合力对照组有少量IL- 6表达，实验组(咬合力增强或丧失)IL-6表达均明显增强，且出现一定的时间规律。
2.3 原位杂交
研究结果显示，阴性对照组无IL-6 mRNA表达。正常咬合力对照组有少量 IL-6 mRNA表达。实验组(咬合力增强组或丧失组)IL-6 mRNA表达均明显增强，且出现一 定的时间规律。实验结果与免疫组化结果相符。
3 讨 论
为了进行在体内情况下咬合力对牙周组织影响的研究，国外学者一般采用以下几种方法来模 拟 不同的咬合力状态，建立咬合力减弱或增强的动物模型：①磨低牙，Steigman〔1〕 通过磨除一 定的牙体组织，使牙脱离咬合接触而达到减轻功能，减小咬合力的目的。如果磨除一侧牙， 则另一侧牙的功能就代偿性增强，所受咬合力就相应增大〔2〕。②软食〔3〕 ，给实验动物喂软 食或流汁，则其牙所受咬合力相应减小。③肌肉切除，Horowitz〔4〕通过切除相应 的咀嚼肌 ，使实验动物的咀嚼功能下降，则咬合力减小。④固定桥修复,Verstraete〔5〕 采用拔牙后固定桥修复单个切牙，观察到桥基牙所受咬合力增大。⑤拔牙〔6～8〕 ，通过拔 除一个区的部分牙或单个牙，使对颌相对磨牙丧失咬合接触，来达到减小对颌牙所受咬合力 的目的。如仅拔除少数牙，为避免牙 合创伤还需配合调牙 合。
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在上述5种方法中，应用最广的是拔牙法。因为该种方法不仅简便易行，而且所模拟的情况 是临床中常见现象。该模型重复性好，能较理想地达到建立咬合力减弱与增强的目的，故从 60年代开始，一直被采用至今。但以往学者们多采用拔除一个区的部分牙或单个牙来 建模。本实验也采用了拔牙法的方式建模，但拔除的是一侧的所有磨牙。
本实验组织形态学观察到对照组(正常咬合力组)大鼠牙周膜结构致密，纤维、细胞排列有 序。牙槽骨骨壁较平。而实验2组2周时牙周膜宽度明显增加 ，牙周膜结 构 致密，其纤维、细胞排列有序。牙槽骨骨壁凹凸不平，可见交替出现的骨形成区。实验1组 2周时牙周膜结构稀疏，纤维、细胞的排列明显紊乱。牙槽骨骨壁凹凸不平 ，有很多骨吸收陷窝，其内可见破骨细胞。组织形态学观察结果表明，此方法建立的动物模 型，咬合力增强及减弱对牙周组织改建的影响与正常咬合力明显不同。
免疫组化和原位杂交实验结果显示，阴性对照组无IL-6及IL-6 mRNA表达，正常咬合力对 照组有少量表达，实验组(咬合力增强或丧失)表达IL-6及IL-6 mRNA明显增强，且出现 一定的时间规律。实验结果与组织形态学观察结果相符。
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综上所述，本实验采用拔牙法建立的动物模型，通过免疫组化和原位杂交实验以及组织 形态学观察应证，认为此模型能较好地模拟咬合力增强、丧失的情况，较理想地达到了建立 两种咬合力状态的目的。应用于研究咬合力影响牙周组织改建的实验中，获得理想效果，认 为此动物模型有效、可靠。■
参考文献
[1]Steigmen S, Michael Y, Yitzhaki M,et al. A three-dimentional evalu ation of th e effects of functional occlusal force on the morphology of dental and periodont al tissues of the rat incisor. J Dent Rrs, 1989,68(8):1269
[2]Stallard RE. The effect of occlusal alterations on collagen formation within the periodontium . Periodontics, 1964,2:49
, 百拇医药
[3]Kiliaridis S, Engstrom C, Thilander B. The relationship between masticatory function and craniofacical morphology. Eur J Orthod, 1985,7.273
[4]Horowitz SL, Shapiro HH. Alveolar bone changs following alteration of mastic atory function in the rat. NY State Dent J, 1956,22.212
[5]Verstraete FJ. Fixed prosthodontic replacement of single incisors in three do gs. J Vet Dent,1994,11(4):125
[6]Gerard G, Michael L, Mailand L,et al. Histologic study of the effects of o ccl usal hypofunction following antagonist tooth extraction in the rat. J Periodonto l, 1980,51(7):393
[7]Cohn SA. Disuse atrophy of the periodontium in mice following partial loss of function. Arch Oral Biol, 1966,11.95
[8]Johnson RB. Effect of altered occlusal function on transseptal ligament and n ew bone thicknesses in the periodontium of the rat. Anat Res, 1990,187: 91
收稿日期：1999-08-28, http://www.100md.com