咬合力增强对大鼠牙周组织白细胞介素-6表达影响的研究
作者：袁林 周伟东 赵云凤
单位：袁林(第四军医大学口腔医学院修复科博士后流动站)；赵云凤(华西医科大学口腔医学院修)；周伟东(第一军医大学珠江医院)
关键词：咬合力；白细胞介素-6；牙周组织；免疫组织化学
实用口腔医学杂志000421〔摘要〕目的：检测咬合力在正常及增强状态下，大鼠牙周细胞IL-6的动态表达，初探IL-6在牙周组织改建中作用的分子机别。方法：采用免疫组化的方法，观察牙周形态变化以及牙周组织中IL-6蛋白表达。结果：咬合力增强引起牙周膜增宽、牙槽骨新骨形成。牙周细胞中IL-6表达较正常咬合力时明显增强。结论：咬合力增强，促使牙周组织产生IL-6明显增多，诱发了破骨功能；同时，还激活了成骨功能。
中图分类号：R781.4+5 文章标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1001-3733(2000)04-0317-03
Effect of increased bite force on the expression of IL-6 in rat periodontium
Yuan Lin,Zhou Weidong,Zhao Yunfeng
(Department.of Prosthodontics,Stomatological College,West China University of Medical Sciences ,Chengdu 610041)
〔Abstract〕Objective:To study the expression of IL-6 in rat periodontal cells under normal and increased bite force.Methods:Immunohistochemistry technique was applied to study the morphology of periodontium and the expression of IL-6 protein under normal and increased bite force.Results:Under the increased bite force,periodontal ligament width was enlarged and new bone was formed in alveolar; the expression of IL-6 increased apparently in periodontal cells.Conclusion:Increased bite force may induce the expression of IL-6 in periodontium.The morphologic change in periodontium and alveolar may be related to IL-6 expression.
, 百拇医药
Key words Bite force;Interleukin-6;Periodontium; Immunohistochemistry
白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)是一种多功能的细胞因子，它可通过自分泌和旁分泌的形式参与牙周组织的代谢。以往大量的体外实验表明，成纤维细胞及成骨细胞均能产生IL-6，IL-6具有不同程度的破骨细胞活化因子的活性。在口腔修复学领域，国内、外均未见有研究咬合力与牙周组织IL-6表达关系的报道。本实验研究了大鼠牙周组织IL-6的表达，以及咬合力增强后，牙周组织IL-6表达的动态变化，初探了IL-6在咬合力增强作用下对牙周组织改建影响中的分子机制。
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立和组织标本的制备
动物模型的建立同参考文献〔1〕。实验方法如下：选用80只(250±20) g成年雄性Wistar大鼠，随机等量地分为对照组(正常咬合力)和实验组。两组动物分别在实验后6 h、1 d、2 d、3 d、1周、2周、3周和4周各处死5只，共16组。实验动物采用40 g/L多聚甲醛心内灌注的方式行内固定。取出下颌骨，保留磨牙区骨段，置于40 g/L多聚甲醛中巩固固定6 h。将标本移至EDTA中脱钙2周。梯度乙醇脱水，石蜡包埋。
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1.2 免疫组化检测
IL-6多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)， ABC试剂盒(美国Vector公司)。常规免疫组化染色，DAB显色。设已知有IL-6表达的应激大鼠脾组织作阳性对照，以封闭血清代替一抗作阴性对照。
1.3 图像分析与统计学处理
采用MIAS-2000型图像分析仪，对实验组和对照组各时间点牙周膜染色强度进行测量。每个标本均选第一磨牙牙根为观察对象。结果用 t检验进行统计学分析。
2 结 果
2.1 对照组(正常咬合力组)大鼠牙周膜成纤维细胞(PLF)中存在IL-6表达，其免疫阳性信号位于胞浆内。牙槽骨成骨细胞未观察到明显的IL-6表达(图1)。
, 百拇医药
图1 对照组(正常咬合力组)2周大鼠牙周组织IL-6免疫组化染色×90
2.2 实验组(咬合力增强组)阳性强度明显高于对照组。3 d后出现明显变化，2周时达高峰，随后逐渐减小，4周时基本恢复正常(表1，图2)。同时观察到1周时成骨细胞中IL-6明显表达，2周时最强，3周时明显减弱。
表1 实验组和对照组不同实验时间牙周膜IL-6免疫组化染色灰度差值表 实验分组
实验时间
6 h
1 d
2 d
3 d
1周
, 百拇医药
2周
3周
4周
对照组(正常)
5.6893
5.2276
5.7925
5.9758
6.3641
6.3119
6.8612
5.6127
实验组(增强)
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6.0319
7.5549
8.2844
15.7973①
30.9521①
45.5456①
30.5637①
14.5112①
两组比较，①表示P<0.01，有显著性差异。余者均P>0.05，无显著性差异。
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图2 实验组(咬合力增强组)2周大鼠牙周组织IL-6免疫组化染色×85)
3 讨 论
IL-6是一种多功能的细胞因子，机体的许多组织细胞均可产生IL-6。这些细胞在产生IL-6的过程中又受到诸多因素的正调节和负调节。IL-6能通过自分泌和旁分泌的方式，对局部的组织和细胞发挥作用。大量的体内和体外实验证明，IL-6具有多功能生物学活性：它参与骨的吸收；抑制成纤维细胞的生长；促进多种细胞的增殖等〔2〕。
牙周组织的结构特殊，牙周膜位于牙骨质和牙槽骨两种硬组织之间。在口腔环境中，咀嚼运动时，牙周膜和牙槽骨总是承受着咬合力的作用。本实验动物模型的建立采用拔牙的方法拔除大鼠实验组左侧上颌(B区)所有磨牙，则左侧下颌(D区)磨牙因丧失对颌牙导致咬合力丧失，而右侧下颌(C区)磨牙功能代偿性增强，所受咬合力增大，但这种增强的咬合力在正常生理限度内。
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本实验形态学观察到，咬合力增强，促使牙周膜宽度增加；牙槽骨2周时破骨、成骨作用均增强，3、4周时成骨作用大于破骨作用出现明显的成骨现象。免疫组化结果显示，大鼠PLF能稳定表达IL-6。当咬合力增强后，PLF和成骨细胞表达IL-6的阳性强度均较正常咬合力明显增强。实验提示是力的作用，促使牙周细胞产生了明显增多的IL-6。
许多研究结果表明，力能对牙周膜产生较大的影响。Steigman〔2〕对大鼠尖牙施以机械力，发现顺着牙长轴的方向，在加力处周围，出现牙周膜创伤以及牙槽骨的改建，改建区域的骨吸收和骨沉积部位相互混杂。
牙周膜主要由成纤维细胞、胶原纤维和基质组成。成纤维细胞是牙周膜中重要的细胞。成纤维细胞能产生IL-6，且是IL-6的主要来源。本实验结果也显示出，咬合力的变化均诱导出PLF产生了明显增多的IL-6。
力作用于体外分离培养的成纤维细胞是否产生IL-6，国内、外尚未见报道，但力作用于PLF能产生IL-1β、前列腺素E2(PGE2),且增加其环磷酸腺苷(cAMP)的合成，学者们通过体内和体外大量实验已证明这一点。而IL-1β或肿瘤坏死因子α(TNF-α)作用于PLF，均可诱导其产生IL-6明显增多，且具有时间效应和浓度效应。同时发现经IL-1β或TNF-α作用后，PLF产生PGE2也明显增加〔3〕。
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本实验观察到咬合力增强PLF表达IL-6明显增强，可能一方面是因为增强的咬合力本身直接促进了PLF产生IL-6，另一方面可能是因为增强的咬合力使PLF产生了IL-1β及TNF-α(本实验结果)，而IL-1β和TNF-α又作用于PLF产生了明显增多的IL-6而参与了牙周膜的改建。 IL-1β和TNF-α诱导IL-6产生的调节机制尚不完全清楚，学者们研究认为可能存在二条调节途径：一是蛋白激酶C(PKC)的激活，另一条是cAMP途径〔4〕。
本实验还发现咬合力增强，明显激活了成骨细胞分泌IL-6。Roberts〔5〕等研究表明力能促进PLF向成骨细胞的分化，刺激成骨细胞产生更多的IL-6,且激活成骨细胞的成骨功能。本研究主要观察了破骨因子在牙周组织改建中的作用。牙槽骨改建是一个由破骨和成骨共同调控的动态过程，是从骨吸收开始而后骨形成。咬合力增强时观察到IL-6明显增高，提示激发了破骨过程而诱发了牙槽骨的改建。但同时观察到成骨过程的增强，成骨细胞的数量大大增加，其功能被明显激活，成骨作用较破骨更明显而出现成骨现象。提示咬合力增强不仅促进了破骨功能，还诱导了成骨功能的增强。本实验阐明了牙周组织改建过程中结构与功能关系的一致性。
, 百拇医药
参考文献
1，袁林,赵云风,周伟东.咬合力与大鼠牙周组织改建关系研究中动物模型的建立.实用口腔医学杂志,2000,16(3):199
2，Tanabe O,Akira S,Kamiya T,et al.Genomic structure of the murine IL-6 gene:High degree conservation of potential regulatory sequences between mouse and human.J Immunol 1988,141(1):3875
3，Steigman S,Boym R,Weinreb M,et al.Dynamics of tissue changes found after mechanical loading of the rat incisor.Ⅱ.A three-dimensional longitudinal study of the histopathologic aspects.Am J Orthod Dentofac Orthop,1993,104(5):492
, http://www.100md.com
4，Okada N,Kobayashi M,Mugikura K,et al.Interleukin-6 production in human fibroblasts derived from periodontal tissues is differentially regulated by cytokines and a glucocorticoid.J Periodont Res,1997,32:559
5，Zitnik RJ,Zheng T,Elias JA,et al.cAMP inhibition of interleukin-1-induced interlewkin-6 production by human lung fibroblasts.Am J Physiol,1993,264:L253
6，Roberts WE,Chase DC.Kinetics of cell proliferation and migration associated with orthodontically-induced osteogenesis.J Dent Res,1981,60:174
收稿：2000-02-03, 百拇医药
单位：袁林(第四军医大学口腔医学院修复科博士后流动站)；赵云凤(华西医科大学口腔医学院修)；周伟东(第一军医大学珠江医院)
关键词：咬合力；白细胞介素-6；牙周组织；免疫组织化学
实用口腔医学杂志000421〔摘要〕目的：检测咬合力在正常及增强状态下，大鼠牙周细胞IL-6的动态表达，初探IL-6在牙周组织改建中作用的分子机别。方法：采用免疫组化的方法，观察牙周形态变化以及牙周组织中IL-6蛋白表达。结果：咬合力增强引起牙周膜增宽、牙槽骨新骨形成。牙周细胞中IL-6表达较正常咬合力时明显增强。结论：咬合力增强，促使牙周组织产生IL-6明显增多，诱发了破骨功能；同时，还激活了成骨功能。
中图分类号：R781.4+5 文章标识码：A
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文章编号：1001-3733(2000)04-0317-03
Effect of increased bite force on the expression of IL-6 in rat periodontium
Yuan Lin,Zhou Weidong,Zhao Yunfeng
(Department.of Prosthodontics,Stomatological College,West China University of Medical Sciences ,Chengdu 610041)
〔Abstract〕Objective:To study the expression of IL-6 in rat periodontal cells under normal and increased bite force.Methods:Immunohistochemistry technique was applied to study the morphology of periodontium and the expression of IL-6 protein under normal and increased bite force.Results:Under the increased bite force,periodontal ligament width was enlarged and new bone was formed in alveolar; the expression of IL-6 increased apparently in periodontal cells.Conclusion:Increased bite force may induce the expression of IL-6 in periodontium.The morphologic change in periodontium and alveolar may be related to IL-6 expression.
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Key words Bite force;Interleukin-6;Periodontium; Immunohistochemistry
白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)是一种多功能的细胞因子，它可通过自分泌和旁分泌的形式参与牙周组织的代谢。以往大量的体外实验表明，成纤维细胞及成骨细胞均能产生IL-6，IL-6具有不同程度的破骨细胞活化因子的活性。在口腔修复学领域，国内、外均未见有研究咬合力与牙周组织IL-6表达关系的报道。本实验研究了大鼠牙周组织IL-6的表达，以及咬合力增强后，牙周组织IL-6表达的动态变化，初探了IL-6在咬合力增强作用下对牙周组织改建影响中的分子机制。
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立和组织标本的制备
动物模型的建立同参考文献〔1〕。实验方法如下：选用80只(250±20) g成年雄性Wistar大鼠，随机等量地分为对照组(正常咬合力)和实验组。两组动物分别在实验后6 h、1 d、2 d、3 d、1周、2周、3周和4周各处死5只，共16组。实验动物采用40 g/L多聚甲醛心内灌注的方式行内固定。取出下颌骨，保留磨牙区骨段，置于40 g/L多聚甲醛中巩固固定6 h。将标本移至EDTA中脱钙2周。梯度乙醇脱水，石蜡包埋。
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1.2 免疫组化检测
IL-6多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)， ABC试剂盒(美国Vector公司)。常规免疫组化染色，DAB显色。设已知有IL-6表达的应激大鼠脾组织作阳性对照，以封闭血清代替一抗作阴性对照。
1.3 图像分析与统计学处理
采用MIAS-2000型图像分析仪，对实验组和对照组各时间点牙周膜染色强度进行测量。每个标本均选第一磨牙牙根为观察对象。结果用 t检验进行统计学分析。
2 结 果
2.1 对照组(正常咬合力组)大鼠牙周膜成纤维细胞(PLF)中存在IL-6表达，其免疫阳性信号位于胞浆内。牙槽骨成骨细胞未观察到明显的IL-6表达(图1)。
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图1 对照组(正常咬合力组)2周大鼠牙周组织IL-6免疫组化染色×90
2.2 实验组(咬合力增强组)阳性强度明显高于对照组。3 d后出现明显变化，2周时达高峰，随后逐渐减小，4周时基本恢复正常(表1，图2)。同时观察到1周时成骨细胞中IL-6明显表达，2周时最强，3周时明显减弱。
表1 实验组和对照组不同实验时间牙周膜IL-6免疫组化染色灰度差值表 实验分组
实验时间
6 h
1 d
2 d
3 d
1周
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2周
3周
4周
对照组(正常)
5.6893
5.2276
5.7925
5.9758
6.3641
6.3119
6.8612
5.6127
实验组(增强)
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6.0319
7.5549
8.2844
15.7973①
30.9521①
45.5456①
30.5637①
14.5112①
两组比较，①表示P<0.01，有显著性差异。余者均P>0.05，无显著性差异。
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图2 实验组(咬合力增强组)2周大鼠牙周组织IL-6免疫组化染色×85)
3 讨 论
IL-6是一种多功能的细胞因子，机体的许多组织细胞均可产生IL-6。这些细胞在产生IL-6的过程中又受到诸多因素的正调节和负调节。IL-6能通过自分泌和旁分泌的方式，对局部的组织和细胞发挥作用。大量的体内和体外实验证明，IL-6具有多功能生物学活性：它参与骨的吸收；抑制成纤维细胞的生长；促进多种细胞的增殖等〔2〕。
牙周组织的结构特殊，牙周膜位于牙骨质和牙槽骨两种硬组织之间。在口腔环境中，咀嚼运动时，牙周膜和牙槽骨总是承受着咬合力的作用。本实验动物模型的建立采用拔牙的方法拔除大鼠实验组左侧上颌(B区)所有磨牙，则左侧下颌(D区)磨牙因丧失对颌牙导致咬合力丧失，而右侧下颌(C区)磨牙功能代偿性增强，所受咬合力增大，但这种增强的咬合力在正常生理限度内。
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本实验形态学观察到，咬合力增强，促使牙周膜宽度增加；牙槽骨2周时破骨、成骨作用均增强，3、4周时成骨作用大于破骨作用出现明显的成骨现象。免疫组化结果显示，大鼠PLF能稳定表达IL-6。当咬合力增强后，PLF和成骨细胞表达IL-6的阳性强度均较正常咬合力明显增强。实验提示是力的作用，促使牙周细胞产生了明显增多的IL-6。
许多研究结果表明，力能对牙周膜产生较大的影响。Steigman〔2〕对大鼠尖牙施以机械力，发现顺着牙长轴的方向，在加力处周围，出现牙周膜创伤以及牙槽骨的改建，改建区域的骨吸收和骨沉积部位相互混杂。
牙周膜主要由成纤维细胞、胶原纤维和基质组成。成纤维细胞是牙周膜中重要的细胞。成纤维细胞能产生IL-6，且是IL-6的主要来源。本实验结果也显示出，咬合力的变化均诱导出PLF产生了明显增多的IL-6。
力作用于体外分离培养的成纤维细胞是否产生IL-6，国内、外尚未见报道，但力作用于PLF能产生IL-1β、前列腺素E2(PGE2),且增加其环磷酸腺苷(cAMP)的合成，学者们通过体内和体外大量实验已证明这一点。而IL-1β或肿瘤坏死因子α(TNF-α)作用于PLF，均可诱导其产生IL-6明显增多，且具有时间效应和浓度效应。同时发现经IL-1β或TNF-α作用后，PLF产生PGE2也明显增加〔3〕。
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本实验观察到咬合力增强PLF表达IL-6明显增强，可能一方面是因为增强的咬合力本身直接促进了PLF产生IL-6，另一方面可能是因为增强的咬合力使PLF产生了IL-1β及TNF-α(本实验结果)，而IL-1β和TNF-α又作用于PLF产生了明显增多的IL-6而参与了牙周膜的改建。 IL-1β和TNF-α诱导IL-6产生的调节机制尚不完全清楚，学者们研究认为可能存在二条调节途径：一是蛋白激酶C(PKC)的激活，另一条是cAMP途径〔4〕。
本实验还发现咬合力增强，明显激活了成骨细胞分泌IL-6。Roberts〔5〕等研究表明力能促进PLF向成骨细胞的分化，刺激成骨细胞产生更多的IL-6,且激活成骨细胞的成骨功能。本研究主要观察了破骨因子在牙周组织改建中的作用。牙槽骨改建是一个由破骨和成骨共同调控的动态过程，是从骨吸收开始而后骨形成。咬合力增强时观察到IL-6明显增高，提示激发了破骨过程而诱发了牙槽骨的改建。但同时观察到成骨过程的增强，成骨细胞的数量大大增加，其功能被明显激活，成骨作用较破骨更明显而出现成骨现象。提示咬合力增强不仅促进了破骨功能，还诱导了成骨功能的增强。本实验阐明了牙周组织改建过程中结构与功能关系的一致性。
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参考文献
1，袁林,赵云风,周伟东.咬合力与大鼠牙周组织改建关系研究中动物模型的建立.实用口腔医学杂志,2000,16(3):199
2，Tanabe O,Akira S,Kamiya T,et al.Genomic structure of the murine IL-6 gene:High degree conservation of potential regulatory sequences between mouse and human.J Immunol 1988,141(1):3875
3，Steigman S,Boym R,Weinreb M,et al.Dynamics of tissue changes found after mechanical loading of the rat incisor.Ⅱ.A three-dimensional longitudinal study of the histopathologic aspects.Am J Orthod Dentofac Orthop,1993,104(5):492
, http://www.100md.com
4，Okada N,Kobayashi M,Mugikura K,et al.Interleukin-6 production in human fibroblasts derived from periodontal tissues is differentially regulated by cytokines and a glucocorticoid.J Periodont Res,1997,32:559
5，Zitnik RJ,Zheng T,Elias JA,et al.cAMP inhibition of interleukin-1-induced interlewkin-6 production by human lung fibroblasts.Am J Physiol,1993,264:L253
6，Roberts WE,Chase DC.Kinetics of cell proliferation and migration associated with orthodontically-induced osteogenesis.J Dent Res,1981,60:174
收稿：2000-02-03, 百拇医药