骨形成蛋白2基因注射小鼠骨骼肌表达的初步实验研究
作者：司晓辉 杨连甲 金岩
单位：司晓辉(第四军医大学口腔医学院病理科 710032)；杨连甲(第四军医大学口腔医学院病理科 710032)；金岩(第四军医大学口腔医学院病理科 710032)
关键词：骨形成蛋白2；基因表达；免疫组织化学
实用口腔医学杂志000409〔摘要〕目的：探讨骨形成蛋白(BMP)基因能否直接导入骨骼肌细胞并表达。方法：将BMP2真核表达质粒注射于小鼠骨骼肌内，14 d后分别用HE及免疫组化ABC法观察组织学变化和BMP2的表达情况。结果：注射部位局部有炎症反应，部分骨骼肌细胞内可见BMP2的阳性信号。结论：直接注射BMP2基因可使其导入骨骼肌细胞内并表达。
中图分类号：R780.2 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)04-0282-03
, http://www.100md.com
A primary study on transfection of bone morphogenetic protein 2 gene into mouse skeletal muscle by direct injection
Si Xiaohui,Yang Lianjia,Jin Yan
(Department of Oral Pathology,Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
〔Abstract〕Objective:To study the posibility of transfection of BMP gene by direct injection of the gene into skeletal muscle cells.Methods:Eukaryotic expression vector for BMP2 was injected into mouse skeletal muscle.Fourteen days post-injection,histological reaction and the expression of BMP2 were observed using HE and immunohistochemical staining,respectively.Results:Inflammatory reaction was observed in the gene-injected area and some skeletal muscle cells demonstrated BMP2 positive signals.Conclusion:BMP2 gene may be transfered and expressed in skeletal muscle cells by direct injection.
, 百拇医药
Key Words Bone morphogenetic Protein 2;Gene expression,Immunohistochemistry
以往通过基因转移表达蛋白质的方法，必须通过中介细胞。目前一种直接将外源基因注入体内使其进入细胞并得到表达的方法引起人们的关注，它省去了体外细胞修饰这一步。Wolff等〔1〕首先将带有报告基因的质粒DNA直接注射到小鼠骨骼肌内，获得了外源性基因在骨骼肌细胞中的表达，为基因治疗的实验研究开辟了新领域，同时也提示外源基因不需导入体外培养的细胞而进入活体内是可能的。本实验将骨形成蛋白2(BMP2)表达质粒直接注射于小鼠骨骼肌内并观察其表达情况，探讨外源性BMP基因能否直接导入骨骼肌细胞并表达。
1 材料和方法
1.1 主要材料
BalB/c小鼠，雄性，5～8周龄，体重16～18 g，由本校动物中心提供。BMP2真核表达载体pBK-B2由本室构建〔2〕。抗人BMP2 McAb(G8A6)由本校卢兹凡博士惠赠。ABC试剂盒为美国Vector公司产品。
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1.2 基因直接注射
BalB/c小鼠6只，无菌条件下在股四头肌内注射2.5 g/L布比卡因80 μl，注射深度为2 mm。5 d后再在同一部位注射生理盐水溶解的pBK-B2质粒100 μl(100 μg)。同时设空载体及生理盐水对照。
1.3 HE染色
于注射后第14 天取材，HE染色，观察组织学变化。
1.4 免疫组化染色
①切片脱蜡至水；②在体积分数为3% H2O2中孵育10 min；③正常羊血清37 ℃孵育20 min；④滴加鼠抗入BMP2 McAb，4 ℃冰箱内过夜；⑤滴加生物素化的羊抗鼠IgG，37 ℃温育30 min；⑥滴加ABC复合物，37 ℃温育30 min。上述各步之间均经PBS缓冲液充分振洗；⑦显色液(终浓度为0.5 g/L DAB，体积分数为0.03% H2O2)用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.6)、DAB和新鲜的H2O2配制；⑧显色后用苏木精复染，脱水，透明，封片。上述各步未加说明者，皆为室温条件下。用PBS代替BMP2 McAb作为阴性对照。以多次重复实验均证明为BMP2阳性的骨肉瘤为阳性对照。
, 百拇医药
2 结 果
HE染色结果表明，注射部位有较轻微的炎症反应(图1)。注射pBK-B2质粒、空载体和生理盐水的小鼠肌肉内未见到骨和软骨形成。但是免疫组化结果显示在部分注射pBK-B2质粒的骨骼细胞胞浆内可见浅棕色的阳性信号(图2)。注射空载体及生理盐水的对照组未观察到阳性着色。
图1 注射BMP2表达质粒的骨骼肌细胞间可见炎症反应 HE×10
图2 注射BMP2表达质粒的部分骨骼肌细胞内可见BMP2阳性着色 ABC法×10
3 讨 论
基因转移不仅是研究特定基因结构、功能及表达调控的重要手段，也是基因治疗的关键。间接基因导入法必须通过中介细胞才能把基因导入体内，操作复杂。而且所需的中介细胞有个体特异性，只有用同源细胞才能奏效，在实际应用中受到了一定的限制。而基因直接转导操作简单，省时省力，易被临床医生接受，其中直接注射法操作简单、周期短、安全性好(外源性基因以非整合方式存在于细胞内)，对骨骼肌效果最好。骨骼肌对DNA的摄取效率与腺病毒、逆转录病毒的转导效率相当，且目的基因的表达能持续19个月〔3〕。由于骨骼肌结构上的特殊性，如肌纤维的多核性、横纹肌细胞有大量的横管系统和肌浆网、横管系统有大量的细胞外液等，可能使骨骼肌能直接摄取外源DNA并在其中表达。也可能是注射等局部刺激使肌细胞受到损伤，产生炎症反应，导致DNA的进入〔3〕。
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采用注射法，注射针头型号、注射速度、注射的量、注射液体的渗透压、溶解质粒的缓冲液等，以及肌肉的导入部位、动物生理性状等，均影响在体表达的效果〔4〕。注射前用吡哌卡因等局部麻醉剂作预处理，使肌肉处于再生状态，可使外源基因的表达量提高并延长表达时间〔5〕。用生理盐水溶解质粒可提高表达效率。所以本实验采用布比卡因作预处理和生理盐水溶解质粒的注射方法。
BMP是一种高效骨诱导因子，在骨缺损修复和骨折愈合中的作用越来越引起人们的重视，并在临床得到应用。基因直接在体表达技术的发展为BMP的应用开辟了新途径。Fang等〔6〕将含有BMP-4 cDNA表达质粒的胶原植入成年大鼠股骨的节段性缺损区，9周后可见缺损部已愈合，并首次证明BMP质粒DNA可以在活体直接转移至骨缺损区的成纤维细胞，同时也提示暂时、局部过表达BMP是一种简便的刺激骨生长的方法。赵明等〔7〕将BMP2的真核表达质粒注射于小鼠股部肌肉内，可观察到BMP2 mRNA的转录水平提高。马庆军等〔3〕将BMP1表达质粒注射于小鼠骨骼肌后可见外源性BMP1基因的表达。本实验结果也显示，在骨骼肌内直接注射BMP2质粒能使其得到表达。虽然在基因导入的局部未发现新骨形成，这是否由于表达水平不高和表达产物活性较低的原因，还有待于进一步研究。
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基因直接注射法可在体内多途径、多部位注射并做到稳定表达，还可用于研究体内免疫应答、基因调控等，更符合生理环境。需解决的问题是如何提高转移效率和蛋白质的表达产量，以及控制表达的持续时间等。某些生长因子已在临床使用以促进骨骼-肌肉组织的修复，采用基因疗法转移相关生长因子既可能解决这些问题，且基因表达只需在组织愈合的时间内即可，从而使临时性基因表达技术用于临床〔8〕。
参考文献
1，Wolff JA,Robert WM,Phillip W,et al.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.Science,1996,247(4949):1465
2，司晓辉,杨连甲,金岩,等.人骨形成蛋白2 噬菌粒表达载体的构建与鉴定.细胞与分子免疫学杂志，1998，14(2)：141
, 百拇医药
3，麦跃,谭骏,李文雅.基因治疗的新策略——外源基因直接注射法.国外医学遗传学分册，1993，16(2):66
4，马庆军,党耕町,马大龙,等.BMP-1基因在体表达的实验研究.中华外科杂志,1996，34(10):582
5，叶治家,郭华阳,董燕麟,等.重组人IL-3真核表达质粒直接注射小鼠骨骼肌的体内表达研究.细胞生物学杂志,1997,19(2):84
6，Fang JM,Zhu YY,Smiley E,et al.Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(12):5753
7，赵明,王会信,刘莉,等.hBMP-2 cDNA在COS细胞和小鼠肌肉内的表达.生物化学杂志,1995，11(5)：510
8，朱建民,金宗达,王萍花,等.基因疗法在骨科运用的可能性.中华外科杂志,1997,35(11):701
收稿：1999-07-06
修回：1999-11-13, 百拇医药
单位：司晓辉(第四军医大学口腔医学院病理科 710032)；杨连甲(第四军医大学口腔医学院病理科 710032)；金岩(第四军医大学口腔医学院病理科 710032)
关键词：骨形成蛋白2；基因表达；免疫组织化学
实用口腔医学杂志000409〔摘要〕目的：探讨骨形成蛋白(BMP)基因能否直接导入骨骼肌细胞并表达。方法：将BMP2真核表达质粒注射于小鼠骨骼肌内，14 d后分别用HE及免疫组化ABC法观察组织学变化和BMP2的表达情况。结果：注射部位局部有炎症反应，部分骨骼肌细胞内可见BMP2的阳性信号。结论：直接注射BMP2基因可使其导入骨骼肌细胞内并表达。
中图分类号：R780.2 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)04-0282-03
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A primary study on transfection of bone morphogenetic protein 2 gene into mouse skeletal muscle by direct injection
Si Xiaohui,Yang Lianjia,Jin Yan
(Department of Oral Pathology,Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
〔Abstract〕Objective:To study the posibility of transfection of BMP gene by direct injection of the gene into skeletal muscle cells.Methods:Eukaryotic expression vector for BMP2 was injected into mouse skeletal muscle.Fourteen days post-injection,histological reaction and the expression of BMP2 were observed using HE and immunohistochemical staining,respectively.Results:Inflammatory reaction was observed in the gene-injected area and some skeletal muscle cells demonstrated BMP2 positive signals.Conclusion:BMP2 gene may be transfered and expressed in skeletal muscle cells by direct injection.
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Key Words Bone morphogenetic Protein 2;Gene expression,Immunohistochemistry
以往通过基因转移表达蛋白质的方法，必须通过中介细胞。目前一种直接将外源基因注入体内使其进入细胞并得到表达的方法引起人们的关注，它省去了体外细胞修饰这一步。Wolff等〔1〕首先将带有报告基因的质粒DNA直接注射到小鼠骨骼肌内，获得了外源性基因在骨骼肌细胞中的表达，为基因治疗的实验研究开辟了新领域，同时也提示外源基因不需导入体外培养的细胞而进入活体内是可能的。本实验将骨形成蛋白2(BMP2)表达质粒直接注射于小鼠骨骼肌内并观察其表达情况，探讨外源性BMP基因能否直接导入骨骼肌细胞并表达。
1 材料和方法
1.1 主要材料
BalB/c小鼠，雄性，5～8周龄，体重16～18 g，由本校动物中心提供。BMP2真核表达载体pBK-B2由本室构建〔2〕。抗人BMP2 McAb(G8A6)由本校卢兹凡博士惠赠。ABC试剂盒为美国Vector公司产品。
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1.2 基因直接注射
BalB/c小鼠6只，无菌条件下在股四头肌内注射2.5 g/L布比卡因80 μl，注射深度为2 mm。5 d后再在同一部位注射生理盐水溶解的pBK-B2质粒100 μl(100 μg)。同时设空载体及生理盐水对照。
1.3 HE染色
于注射后第14 天取材，HE染色，观察组织学变化。
1.4 免疫组化染色
①切片脱蜡至水；②在体积分数为3% H2O2中孵育10 min；③正常羊血清37 ℃孵育20 min；④滴加鼠抗入BMP2 McAb，4 ℃冰箱内过夜；⑤滴加生物素化的羊抗鼠IgG，37 ℃温育30 min；⑥滴加ABC复合物，37 ℃温育30 min。上述各步之间均经PBS缓冲液充分振洗；⑦显色液(终浓度为0.5 g/L DAB，体积分数为0.03% H2O2)用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.6)、DAB和新鲜的H2O2配制；⑧显色后用苏木精复染，脱水，透明，封片。上述各步未加说明者，皆为室温条件下。用PBS代替BMP2 McAb作为阴性对照。以多次重复实验均证明为BMP2阳性的骨肉瘤为阳性对照。
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2 结 果
HE染色结果表明，注射部位有较轻微的炎症反应(图1)。注射pBK-B2质粒、空载体和生理盐水的小鼠肌肉内未见到骨和软骨形成。但是免疫组化结果显示在部分注射pBK-B2质粒的骨骼细胞胞浆内可见浅棕色的阳性信号(图2)。注射空载体及生理盐水的对照组未观察到阳性着色。
图1 注射BMP2表达质粒的骨骼肌细胞间可见炎症反应 HE×10
图2 注射BMP2表达质粒的部分骨骼肌细胞内可见BMP2阳性着色 ABC法×10
3 讨 论
基因转移不仅是研究特定基因结构、功能及表达调控的重要手段，也是基因治疗的关键。间接基因导入法必须通过中介细胞才能把基因导入体内，操作复杂。而且所需的中介细胞有个体特异性，只有用同源细胞才能奏效，在实际应用中受到了一定的限制。而基因直接转导操作简单，省时省力，易被临床医生接受，其中直接注射法操作简单、周期短、安全性好(外源性基因以非整合方式存在于细胞内)，对骨骼肌效果最好。骨骼肌对DNA的摄取效率与腺病毒、逆转录病毒的转导效率相当，且目的基因的表达能持续19个月〔3〕。由于骨骼肌结构上的特殊性，如肌纤维的多核性、横纹肌细胞有大量的横管系统和肌浆网、横管系统有大量的细胞外液等，可能使骨骼肌能直接摄取外源DNA并在其中表达。也可能是注射等局部刺激使肌细胞受到损伤，产生炎症反应，导致DNA的进入〔3〕。
, http://www.100md.com
采用注射法，注射针头型号、注射速度、注射的量、注射液体的渗透压、溶解质粒的缓冲液等，以及肌肉的导入部位、动物生理性状等，均影响在体表达的效果〔4〕。注射前用吡哌卡因等局部麻醉剂作预处理，使肌肉处于再生状态，可使外源基因的表达量提高并延长表达时间〔5〕。用生理盐水溶解质粒可提高表达效率。所以本实验采用布比卡因作预处理和生理盐水溶解质粒的注射方法。
BMP是一种高效骨诱导因子，在骨缺损修复和骨折愈合中的作用越来越引起人们的重视，并在临床得到应用。基因直接在体表达技术的发展为BMP的应用开辟了新途径。Fang等〔6〕将含有BMP-4 cDNA表达质粒的胶原植入成年大鼠股骨的节段性缺损区，9周后可见缺损部已愈合，并首次证明BMP质粒DNA可以在活体直接转移至骨缺损区的成纤维细胞，同时也提示暂时、局部过表达BMP是一种简便的刺激骨生长的方法。赵明等〔7〕将BMP2的真核表达质粒注射于小鼠股部肌肉内，可观察到BMP2 mRNA的转录水平提高。马庆军等〔3〕将BMP1表达质粒注射于小鼠骨骼肌后可见外源性BMP1基因的表达。本实验结果也显示，在骨骼肌内直接注射BMP2质粒能使其得到表达。虽然在基因导入的局部未发现新骨形成，这是否由于表达水平不高和表达产物活性较低的原因，还有待于进一步研究。
, http://www.100md.com
基因直接注射法可在体内多途径、多部位注射并做到稳定表达，还可用于研究体内免疫应答、基因调控等，更符合生理环境。需解决的问题是如何提高转移效率和蛋白质的表达产量，以及控制表达的持续时间等。某些生长因子已在临床使用以促进骨骼-肌肉组织的修复，采用基因疗法转移相关生长因子既可能解决这些问题，且基因表达只需在组织愈合的时间内即可，从而使临时性基因表达技术用于临床〔8〕。
参考文献
1，Wolff JA,Robert WM,Phillip W,et al.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.Science,1996,247(4949):1465
2，司晓辉,杨连甲,金岩,等.人骨形成蛋白2 噬菌粒表达载体的构建与鉴定.细胞与分子免疫学杂志，1998，14(2)：141
, 百拇医药
3，麦跃,谭骏,李文雅.基因治疗的新策略——外源基因直接注射法.国外医学遗传学分册，1993，16(2):66
4，马庆军,党耕町,马大龙,等.BMP-1基因在体表达的实验研究.中华外科杂志,1996，34(10):582
5，叶治家,郭华阳,董燕麟,等.重组人IL-3真核表达质粒直接注射小鼠骨骼肌的体内表达研究.细胞生物学杂志,1997,19(2):84
6，Fang JM,Zhu YY,Smiley E,et al.Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(12):5753
7，赵明,王会信,刘莉,等.hBMP-2 cDNA在COS细胞和小鼠肌肉内的表达.生物化学杂志,1995，11(5)：510
8，朱建民,金宗达,王萍花,等.基因疗法在骨科运用的可能性.中华外科杂志,1997,35(11):701
收稿：1999-07-06
修回：1999-11-13, 百拇医药