激光对瘢痕成纤维细胞胶原合成及前胶原基因表达的影响
作者：张从纪 李慧增 舒彬 杨军 麦跃
单位：张从纪 李慧增 杨军(重庆第三军医大学西南医院口腔科 400038)；舒彬(康复医学科)；麦跃(皮肤科)
关键词：成纤维细胞；激光；胶原；合成；溶胶原；信使RNA
实用口腔医学杂志000402
〔摘要〕目的：探讨激光对体外培养瘢痕成纤维细胞胶原合成的选择性抑制作用。方法：以不同能量密度(500 J/cm2、1000 J/cm2、1500 J/cm2和2000 J/cm2)Nd∶YAG激光照射体外培养增生性瘢痕和正常成纤维细胞，照射后24 h分别用3H-脯氨酸掺入法和斑点杂交检测成纤维细胞胶原合成和Ⅰ型前胶原基因表达。结果：培养的增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞的胶原合成和Ⅰ型前胶原mRNA相对量在500 J/cm2激光照射后无明显改变(P>0.05)，1500 J/cm2和2000 J/cm2照射后显著降低(P<0.001)，1000 J/cm2能量密度激光照射后增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成与Ⅰ型前胶原基因表达显著下降(P<0.001)，而正常皮肤成纤维细胞的胶原合成和Ⅰ型前胶原基因表达无变化。结论：以1000 J/cm2脉冲Nd∶YAG激光照射能选择性抑制增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成和Ⅰ型前胶原基因表达。
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中图分类号：R312 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)04-0257-04
Effects of laser on collagen synthesis and type I procollagen mRNA level in cultured fibroblasts derived from hypertrophic scar
Zhang Congji,Li Huizeng,Shu Bin,et al.
(Department of Stomatology,Southwest Hospital,Third Military Medical Universtiy,Chongqing,400038)
〔Abstract〕Objective:To study the effects of pulsed Nd∶YAG laser irradiation on collagen production of scar fibroblasts.Methods:Cultured fibroblasts derived from hypertrophic scars(HS) or normal human skin were treated with pulsed Nd∶YAG laser at various energy density levels(500 J/cm2,1000 J/cm2,1500 J/cm2 and 2000 J/cm2).24 hours after laser irradiation,collagen production of the fibroblasts was measured by 〔3H〕probine incorporation.The expression of proα1(Ⅰ) procollagen mRNA was investigated by blot hybridization.Results:Collagen synthesis and type Ⅰprocollagen mRNA level in HS and normal dermal fibroblasts were not significantly different at energy level of 500 J/cm2(P>0.05),and were significantly decreased at energy densities of 1500 J/cm2 and 2000 J/cm2(P<0.001).Colloagen production and typeⅠprocollagen level in HS fibroblasts were markedly reduced at energy level of 1000 J/cm2(P<0.001),while the doses did not affect collagen synthesis and type Ⅰprocollagen mRNA level in normal dermal fibroblasts.Conclusion:Pulsed ND∶YAG laser at energy density of 1000J/cm2 can selectively suppress collagen synthesis and type Ⅰprocollagen mRNA level in HS fibroblasts.
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Key words Fibroblast;Laser;Collagen;Synthesis;Procollagen;Messenger RNA
增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)的防治是口腔颌面外科及整形外科的难题之一。HS的形成机制尚不清楚，有“胶原代谢失衡”、“细胞因子失控”以及“细胞凋亡延缓”等多种学说〔1,2〕，但抑制成纤维细胞的胶原合成与沉积仍是防治HS的重要途径。以往研究表明1 060 nm波长Nd∶YAG激光能抑制人体正常皮肤成纤维细胞的胶原合成〔3〕。临床研究提示Nd∶YAG激光对病理性瘢痕(增生性瘢痕和瘢痕疙瘩)成纤维细胞的胶原合成亦有抑制作用〔4〕。但两者有无区别，Nd∶YAG激光对病理性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞的胶原合成有无选择性抑制作用，目前尚不清楚。本文通过观察比较不同能量密度激光照射下，培养增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞的胶原合成与Ⅰ型前胶原基因表达的变化，力图筛选出能选择性抑制瘢痕成纤维细胞胶原合成的激光参数。
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1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
HSM系列Nd∶YAG激光牙科治疗机为中国航天工业总公司7306研究所生产，LKB-1217型液体闪烁计数仪为LKB公司产品，LS-900型薄层扫描仪为Shimadiu公司产品，3H-脯氨酸购自中国原子能科学研究院同位素研究所，含人Ⅰ型前胶原 cDNA质粒由本校病生教研室黄庆愿博士馈赠，DNA限制内切酶EcoR1购自华美生物工程公司，地高辛DNA标记与检测试剂盒购自Boechinger公司，质粒抽提与纯化试剂盒购自Qiagen公司，总RNA抽提试剂盒、DMEM为Gibco BRL公司产品，胰酶、β-氨基丙腈为Sigma公司产品，小牛血清购自杭州四季春公司。
1.2 细胞培养
人体增生性瘢痕和正常皮肤各4例，年龄6～34岁，其中男5例，女3例，瘢痕存在时间<12月。按组织块法行成纤维细胞的原代培养〔5〕，待培养细胞长满培养器皿底壁后，用25 g/L胰酶与0.2 g/L EDTA-Na共同消化传代，每4～5 d传代1次，以4～10代细胞为实验细胞。
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1.3 激光参数与照射方法
以(1～2)×104个/孔密度接种细胞于96孔培养板，培养24 h后进行激光照射。根据预实验，选择如下激光参数：波长1 064 nm,最大平均功率6 W，单脉冲能量100 mJ，脉冲宽度150 μs，重复频率10 Hz，光斑直径600 μm。每个培养孔分10区进行非重叠照射，光纤垂直作用于培养孔底部，培养板对光的吸收率不超过10%。培养HS和正常皮肤成纤维细胞分为照射组与未照射组，照射组分为4个剂量进行，施加脉冲数分别为7个、14个、21个、28个(相应能量密度约为500 J/cm2、1 000 J/cm2、1 500 J/cm2和2 000 J/cm2)。激光照射后，将细胞置CO2孵箱内继续培养24 h，然后分别测定细胞胶原合成与Ⅰ型前胶原基因表达。
1.4 细胞胶原合成测定
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激光照射后24 h，弃培养液，加入无血清培养液100 μl、0.135×104 Bq 3 H-脯氨酸、抗坏血酸(50 mg/L)和β-氨基丙腈(100 mg/L),继续培养24 h，用胰酶和EDTA消化收集细胞于过氯酸(0.6 mol/L)预处理的玻璃纤维滤纸上，50 g/L三氯醋酸和甲醇冲洗滤纸数次，干燥后进行闪烁计数，测定3H-脯氨酸掺入量。
1.5 Ⅰ型前胶原基因表达检测
1.5.1 质粒的酶切鉴定与探针标记见参考文献〔6〕。
1.5.2 细胞总RNA提取与斑点杂交 激光照射后24 h消化收集细胞，一步法抽提细胞总RNA；取10 μl RNA水溶液，加入相应甲酰胺、甲醛和20×SSC，68 ℃孵育15 min，使RNA变性，然后用点样器将RNA点样于NC膜上，80 ℃烤箱干烤3 h，封入塑料袋中，加预杂交液浸润NC膜，42 ℃预杂交过夜；按0.5 ml预杂交液加1 μl探针的比例加入探针，42 ℃杂交24 h；分别用缓冲液Ⅰ、Ⅱ洗膜，而后加入1∶5 000抗体，37 ℃作用30 min；再用缓冲液Ⅰ、Ⅲ漂洗，加显色液在暗处显色，显色适度后，用缓冲液Ⅳ终止反应，用薄层扫描仪进行密度扫描分析，确定Ⅰ型前胶原mRNA 相对量〔7〕。
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2 结果
2.1 细胞胶原合成
3 H-脯氨酸掺入量监测细胞内胶原合成，可见HS成纤维细胞的胶原合成量明显高于正常皮肤，前者平均为(274.62±15.65) dpm/个细胞(dpm为每分钟衰数)，后者平均为(135.43±6.75) dpm/个细胞，前者约为后者的2倍；HS成纤维细胞胶原合成量在500 J/cm2激光照射后无变化，1 000 J/cm2照射后明显降低为〔(145.40±7.40) dpm/个细胞〕，与未照射瘢痕细胞相比有显著差异(P<0.001)，1 500 J/cm2、2 000 J/cm2激光照射HS成纤维细胞的胶原合成量持续下降，分别为(85.46±5.46)、(66.46±5.05) dpm/个细胞；正常皮肤细胞胶原合成量在500 J/cm2、1 000 J/cm2照射后，分别为(132.62±5.46)dpm/个细胞、(128.95±4.84) dpm/个细胞，与未照射正常细胞相比，无显著差异(P>0.05)，1 500 J/cm2、2 000 J/cm2照射后显著降低(表1)。
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表1 Nd:YAG激光对增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞胶原合成的影响
未照射
照射组(J/cm2)
500
1 000
1 500
2 000
增生性瘢痕
274.62±15.65①
264.94±12.06①
145.40±7.40③
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85.46±5.46③
66.46±5.05③
正常皮肤
135.43±6.75
132.62±5.46
128.95±4.84
86.88±5.52②
69.27±6.12②
②P<0.05,③P<0.01，与未照射组相比，①P<0.05，与正常皮肤组相比，下表同。 2.2 Ⅰ型前原基因表达
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人Ⅰ型前胶原cDNA长度为1.5 kb。HS成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA相对量显著高于正常皮肤，前者平均为65.24±3.60，后者平均为24.07±2.17，前者约为后者的3倍；HS成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA水平在500 J/cm2激光照射后下降，但与未照射瘢痕相比无显著差异(P>0.05), 1 000 J/cm2照射后明显降低，与未照射瘢痕细胞相比有显著差异(P<0.001)(表2)，1 500 J/cm2、2 000 J/cm2照射后HS细胞Ⅰ型前胶原基因表达下降，mRNA相对量分别为18.15±3.22、9.95±2.74；正常皮肤成纤维细胞Ⅰ型前胶原基因表达在500 J/cm2照射后无变化，1 000 J/cm2照射后降低(22.18±3.35)，但与未照射正常细胞相比无显著差异(P>0.05)(表2)，1 500 J/cm2照射明显降低(16.77±2.61)，2 000 J/cm2照射后继续降低(9.60±1.32)。
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表2 Nd∶YAG激光对HS和正常皮肤成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA水平的影响
未照射
照射组(J/cm2)
500
1 000
1 500
2 000
增生性瘢痕
65.24±3.60①
62.65±1.98①
36.01±3.12③
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18.15±3.22③
9.95±2.74③
正常皮肤
24.07±2.17
23.34±2.36
22.18±3.35
16.77±2.61②
9.60±1.32②
3 讨论
增生性瘢痕是创伤或术后常见并发症，是以胶原等结缔组织基质的过量产生与沉积为特征的皮肤纤维化疾患。与正常皮肤相比，增生性瘢痕组织中的胶原合成与相关基因表达均明显增强。Zhang等〔8〕报道，增生性瘢痕组织中Ⅰ型前胶原基因表达约为正常愈合瘢痕的3～4倍，约为正常皮肤的10～15倍。本文采用3H-脯氨酸掺入量检测细胞胶原合成，斑点杂交检测Ⅰ型前胶原基因表达，结果显示体外培养增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成与Ⅰ型前胶原基因表达都显著增强，培养的增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成量约为正常皮肤的2倍，Ⅰ型前胶原基因表达量约为正常皮肤的3倍。尽管Ⅰ型前胶原基因表达量约为正常皮肤的3倍；但与活体增生性瘢痕组织中的表达量相比又明显减少(后者为正常皮肤的10～15倍〔8〕)，该原因尚不清楚，可能与增生性瘢痕组织中存在某些细胞因子，如TGF-β〔7〕，不断刺激成纤维细胞的胶原合成有关。
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激光是20世纪的伟大发明之一，因其固有的频率特异性、相干性和单色性已被广泛地使用于医学的各个领域。根据选择性光热溶理论，决定激光治疗效果的主要参数是激光波长、能量密度和波宽。本文采用1 064 nm波长、150 μs脉宽的脉冲Nd∶YAG照射培养增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞，结果表明，500 J/cm2能量密度激光照射对两种类型成纤维细胞的胶原合成都无影响，Ⅰ型前胶原基因表达亦无明显改变(P>0.05)，但1 500 J/cm2照射后增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞的胶原合成明显下降(P<0.001)，Ⅰ型胶原前基因表达亦显著降低(P<0.001)，2 000 J/cm2激光照射后两种类型细胞的胶原合成与基因表达继续下降，以上结果提示1 064 nm波长、150 μs脉宽的脉冲Nd∶YAG激光能改变增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞的胶原代谢，且与激光剂量密切相关。
以1 000 J/cm2能量密度激光照射，增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞的反应有所不同，1 000 J/cm2激光照射后，增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成量明显降低(P<0.001)，I型前胶原基因的表达亦显著降低(P<0.001)，而正常皮肤成纤维细胞的胶原合成与Ⅰ型胶原基因表达均无明显改变(P>0.05)，提示1 000 J/cm2能量密度激光照射能选择性抑制增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成及其基因表达。尽管本研究中未测定培养液温度，但以往研究已表明，以1 691.4 J/cm2或以下能量密度激光照射，培养液温度不超过40 ℃，Nd∶YAG激光(连续波)的热效应阈值在1 691.4 J/cm2以上〔3〕，因此我们认为1 000 J/cm2能量密度激光选择性抑制增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成的原因至少不是由于Nd∶YAG激光的热效应所致。1 000 J/cm2激光的这种选择性作用机制尚需进一步研究。
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参考文献
1，吴宗耀，武继祥，刘宏亮，等.增生性瘢痕胶原降解的研究.中国康复理论与实践,1998,4(2):47
2，李永林，陈碧.瘢痕增生的生物学研究进展.中华整形烧伤外科杂志，1998，14(4)：457
3，Castro DJ,Abergel RP,Meeker CBS,et al.Effects of the Nd:YAG laser on DNA synthesis and collagen production in human skin fibroblast cultures.Ann Plast Surg,1983,11(3):214
4，Sherman R,Rosenfeld H.Experience with the Nd:YAG laser in the treatment of keloid scars.Ann Plast Surg,1988,21(3):231
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5，司徒镇强，吴军正主编.细胞培养.西安:世界图书出版公司，1996.1～98
6，金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学出版社，1995.539～585
7，Ghahary A,Shen YJ,Scott PG,et al.Enhanced expression of mRNA for transforming growth factor-β,type I and type Ⅲ procollagen in human post-burn hypertrophic scar tissues.J Lab Clin Med,1993,122:465
8，Zhang LQ,Laato M,Muona P,et al.Normal and hypertrophic scars:Quantification and locazition of messenger RNAs for type Ⅰ,Ⅲ and Ⅳ collagens.Br J Dermatol,1994,130:453
收稿：1999-09-14
修回：1999-12-10, http://www.100md.com
单位：张从纪 李慧增 杨军(重庆第三军医大学西南医院口腔科 400038)；舒彬(康复医学科)；麦跃(皮肤科)
关键词：成纤维细胞；激光；胶原；合成；溶胶原；信使RNA
实用口腔医学杂志000402
〔摘要〕目的：探讨激光对体外培养瘢痕成纤维细胞胶原合成的选择性抑制作用。方法：以不同能量密度(500 J/cm2、1000 J/cm2、1500 J/cm2和2000 J/cm2)Nd∶YAG激光照射体外培养增生性瘢痕和正常成纤维细胞，照射后24 h分别用3H-脯氨酸掺入法和斑点杂交检测成纤维细胞胶原合成和Ⅰ型前胶原基因表达。结果：培养的增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞的胶原合成和Ⅰ型前胶原mRNA相对量在500 J/cm2激光照射后无明显改变(P>0.05)，1500 J/cm2和2000 J/cm2照射后显著降低(P<0.001)，1000 J/cm2能量密度激光照射后增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成与Ⅰ型前胶原基因表达显著下降(P<0.001)，而正常皮肤成纤维细胞的胶原合成和Ⅰ型前胶原基因表达无变化。结论：以1000 J/cm2脉冲Nd∶YAG激光照射能选择性抑制增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成和Ⅰ型前胶原基因表达。
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中图分类号：R312 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)04-0257-04
Effects of laser on collagen synthesis and type I procollagen mRNA level in cultured fibroblasts derived from hypertrophic scar
Zhang Congji,Li Huizeng,Shu Bin,et al.
(Department of Stomatology,Southwest Hospital,Third Military Medical Universtiy,Chongqing,400038)
〔Abstract〕Objective:To study the effects of pulsed Nd∶YAG laser irradiation on collagen production of scar fibroblasts.Methods:Cultured fibroblasts derived from hypertrophic scars(HS) or normal human skin were treated with pulsed Nd∶YAG laser at various energy density levels(500 J/cm2,1000 J/cm2,1500 J/cm2 and 2000 J/cm2).24 hours after laser irradiation,collagen production of the fibroblasts was measured by 〔3H〕probine incorporation.The expression of proα1(Ⅰ) procollagen mRNA was investigated by blot hybridization.Results:Collagen synthesis and type Ⅰprocollagen mRNA level in HS and normal dermal fibroblasts were not significantly different at energy level of 500 J/cm2(P>0.05),and were significantly decreased at energy densities of 1500 J/cm2 and 2000 J/cm2(P<0.001).Colloagen production and typeⅠprocollagen level in HS fibroblasts were markedly reduced at energy level of 1000 J/cm2(P<0.001),while the doses did not affect collagen synthesis and type Ⅰprocollagen mRNA level in normal dermal fibroblasts.Conclusion:Pulsed ND∶YAG laser at energy density of 1000J/cm2 can selectively suppress collagen synthesis and type Ⅰprocollagen mRNA level in HS fibroblasts.
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Key words Fibroblast;Laser;Collagen;Synthesis;Procollagen;Messenger RNA
增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)的防治是口腔颌面外科及整形外科的难题之一。HS的形成机制尚不清楚，有“胶原代谢失衡”、“细胞因子失控”以及“细胞凋亡延缓”等多种学说〔1,2〕，但抑制成纤维细胞的胶原合成与沉积仍是防治HS的重要途径。以往研究表明1 060 nm波长Nd∶YAG激光能抑制人体正常皮肤成纤维细胞的胶原合成〔3〕。临床研究提示Nd∶YAG激光对病理性瘢痕(增生性瘢痕和瘢痕疙瘩)成纤维细胞的胶原合成亦有抑制作用〔4〕。但两者有无区别，Nd∶YAG激光对病理性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞的胶原合成有无选择性抑制作用，目前尚不清楚。本文通过观察比较不同能量密度激光照射下，培养增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞的胶原合成与Ⅰ型前胶原基因表达的变化，力图筛选出能选择性抑制瘢痕成纤维细胞胶原合成的激光参数。
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1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
HSM系列Nd∶YAG激光牙科治疗机为中国航天工业总公司7306研究所生产，LKB-1217型液体闪烁计数仪为LKB公司产品，LS-900型薄层扫描仪为Shimadiu公司产品，3H-脯氨酸购自中国原子能科学研究院同位素研究所，含人Ⅰ型前胶原 cDNA质粒由本校病生教研室黄庆愿博士馈赠，DNA限制内切酶EcoR1购自华美生物工程公司，地高辛DNA标记与检测试剂盒购自Boechinger公司，质粒抽提与纯化试剂盒购自Qiagen公司，总RNA抽提试剂盒、DMEM为Gibco BRL公司产品，胰酶、β-氨基丙腈为Sigma公司产品，小牛血清购自杭州四季春公司。
1.2 细胞培养
人体增生性瘢痕和正常皮肤各4例，年龄6～34岁，其中男5例，女3例，瘢痕存在时间<12月。按组织块法行成纤维细胞的原代培养〔5〕，待培养细胞长满培养器皿底壁后，用25 g/L胰酶与0.2 g/L EDTA-Na共同消化传代，每4～5 d传代1次，以4～10代细胞为实验细胞。
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1.3 激光参数与照射方法
以(1～2)×104个/孔密度接种细胞于96孔培养板，培养24 h后进行激光照射。根据预实验，选择如下激光参数：波长1 064 nm,最大平均功率6 W，单脉冲能量100 mJ，脉冲宽度150 μs，重复频率10 Hz，光斑直径600 μm。每个培养孔分10区进行非重叠照射，光纤垂直作用于培养孔底部，培养板对光的吸收率不超过10%。培养HS和正常皮肤成纤维细胞分为照射组与未照射组，照射组分为4个剂量进行，施加脉冲数分别为7个、14个、21个、28个(相应能量密度约为500 J/cm2、1 000 J/cm2、1 500 J/cm2和2 000 J/cm2)。激光照射后，将细胞置CO2孵箱内继续培养24 h，然后分别测定细胞胶原合成与Ⅰ型前胶原基因表达。
1.4 细胞胶原合成测定
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激光照射后24 h，弃培养液，加入无血清培养液100 μl、0.135×104 Bq 3 H-脯氨酸、抗坏血酸(50 mg/L)和β-氨基丙腈(100 mg/L),继续培养24 h，用胰酶和EDTA消化收集细胞于过氯酸(0.6 mol/L)预处理的玻璃纤维滤纸上，50 g/L三氯醋酸和甲醇冲洗滤纸数次，干燥后进行闪烁计数，测定3H-脯氨酸掺入量。
1.5 Ⅰ型前胶原基因表达检测
1.5.1 质粒的酶切鉴定与探针标记见参考文献〔6〕。
1.5.2 细胞总RNA提取与斑点杂交 激光照射后24 h消化收集细胞，一步法抽提细胞总RNA；取10 μl RNA水溶液，加入相应甲酰胺、甲醛和20×SSC，68 ℃孵育15 min，使RNA变性，然后用点样器将RNA点样于NC膜上，80 ℃烤箱干烤3 h，封入塑料袋中，加预杂交液浸润NC膜，42 ℃预杂交过夜；按0.5 ml预杂交液加1 μl探针的比例加入探针，42 ℃杂交24 h；分别用缓冲液Ⅰ、Ⅱ洗膜，而后加入1∶5 000抗体，37 ℃作用30 min；再用缓冲液Ⅰ、Ⅲ漂洗，加显色液在暗处显色，显色适度后，用缓冲液Ⅳ终止反应，用薄层扫描仪进行密度扫描分析，确定Ⅰ型前胶原mRNA 相对量〔7〕。
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2 结果
2.1 细胞胶原合成
3 H-脯氨酸掺入量监测细胞内胶原合成，可见HS成纤维细胞的胶原合成量明显高于正常皮肤，前者平均为(274.62±15.65) dpm/个细胞(dpm为每分钟衰数)，后者平均为(135.43±6.75) dpm/个细胞，前者约为后者的2倍；HS成纤维细胞胶原合成量在500 J/cm2激光照射后无变化，1 000 J/cm2照射后明显降低为〔(145.40±7.40) dpm/个细胞〕，与未照射瘢痕细胞相比有显著差异(P<0.001)，1 500 J/cm2、2 000 J/cm2激光照射HS成纤维细胞的胶原合成量持续下降，分别为(85.46±5.46)、(66.46±5.05) dpm/个细胞；正常皮肤细胞胶原合成量在500 J/cm2、1 000 J/cm2照射后，分别为(132.62±5.46)dpm/个细胞、(128.95±4.84) dpm/个细胞，与未照射正常细胞相比，无显著差异(P>0.05)，1 500 J/cm2、2 000 J/cm2照射后显著降低(表1)。
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表1 Nd:YAG激光对增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞胶原合成的影响
未照射
照射组(J/cm2)
500
1 000
1 500
2 000
增生性瘢痕
274.62±15.65①
264.94±12.06①
145.40±7.40③
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85.46±5.46③
66.46±5.05③
正常皮肤
135.43±6.75
132.62±5.46
128.95±4.84
86.88±5.52②
69.27±6.12②
②P<0.05,③P<0.01，与未照射组相比，①P<0.05，与正常皮肤组相比，下表同。 2.2 Ⅰ型前原基因表达
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人Ⅰ型前胶原cDNA长度为1.5 kb。HS成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA相对量显著高于正常皮肤，前者平均为65.24±3.60，后者平均为24.07±2.17，前者约为后者的3倍；HS成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA水平在500 J/cm2激光照射后下降，但与未照射瘢痕相比无显著差异(P>0.05), 1 000 J/cm2照射后明显降低，与未照射瘢痕细胞相比有显著差异(P<0.001)(表2)，1 500 J/cm2、2 000 J/cm2照射后HS细胞Ⅰ型前胶原基因表达下降，mRNA相对量分别为18.15±3.22、9.95±2.74；正常皮肤成纤维细胞Ⅰ型前胶原基因表达在500 J/cm2照射后无变化，1 000 J/cm2照射后降低(22.18±3.35)，但与未照射正常细胞相比无显著差异(P>0.05)(表2)，1 500 J/cm2照射明显降低(16.77±2.61)，2 000 J/cm2照射后继续降低(9.60±1.32)。
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表2 Nd∶YAG激光对HS和正常皮肤成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA水平的影响
未照射
照射组(J/cm2)
500
1 000
1 500
2 000
增生性瘢痕
65.24±3.60①
62.65±1.98①
36.01±3.12③
, 百拇医药
18.15±3.22③
9.95±2.74③
正常皮肤
24.07±2.17
23.34±2.36
22.18±3.35
16.77±2.61②
9.60±1.32②
3 讨论
增生性瘢痕是创伤或术后常见并发症，是以胶原等结缔组织基质的过量产生与沉积为特征的皮肤纤维化疾患。与正常皮肤相比，增生性瘢痕组织中的胶原合成与相关基因表达均明显增强。Zhang等〔8〕报道，增生性瘢痕组织中Ⅰ型前胶原基因表达约为正常愈合瘢痕的3～4倍，约为正常皮肤的10～15倍。本文采用3H-脯氨酸掺入量检测细胞胶原合成，斑点杂交检测Ⅰ型前胶原基因表达，结果显示体外培养增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成与Ⅰ型前胶原基因表达都显著增强，培养的增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成量约为正常皮肤的2倍，Ⅰ型前胶原基因表达量约为正常皮肤的3倍。尽管Ⅰ型前胶原基因表达量约为正常皮肤的3倍；但与活体增生性瘢痕组织中的表达量相比又明显减少(后者为正常皮肤的10～15倍〔8〕)，该原因尚不清楚，可能与增生性瘢痕组织中存在某些细胞因子，如TGF-β〔7〕，不断刺激成纤维细胞的胶原合成有关。
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激光是20世纪的伟大发明之一，因其固有的频率特异性、相干性和单色性已被广泛地使用于医学的各个领域。根据选择性光热溶理论，决定激光治疗效果的主要参数是激光波长、能量密度和波宽。本文采用1 064 nm波长、150 μs脉宽的脉冲Nd∶YAG照射培养增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞，结果表明，500 J/cm2能量密度激光照射对两种类型成纤维细胞的胶原合成都无影响，Ⅰ型前胶原基因表达亦无明显改变(P>0.05)，但1 500 J/cm2照射后增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞的胶原合成明显下降(P<0.001)，Ⅰ型胶原前基因表达亦显著降低(P<0.001)，2 000 J/cm2激光照射后两种类型细胞的胶原合成与基因表达继续下降，以上结果提示1 064 nm波长、150 μs脉宽的脉冲Nd∶YAG激光能改变增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞的胶原代谢，且与激光剂量密切相关。
以1 000 J/cm2能量密度激光照射，增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞的反应有所不同，1 000 J/cm2激光照射后，增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成量明显降低(P<0.001)，I型前胶原基因的表达亦显著降低(P<0.001)，而正常皮肤成纤维细胞的胶原合成与Ⅰ型胶原基因表达均无明显改变(P>0.05)，提示1 000 J/cm2能量密度激光照射能选择性抑制增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成及其基因表达。尽管本研究中未测定培养液温度，但以往研究已表明，以1 691.4 J/cm2或以下能量密度激光照射，培养液温度不超过40 ℃，Nd∶YAG激光(连续波)的热效应阈值在1 691.4 J/cm2以上〔3〕，因此我们认为1 000 J/cm2能量密度激光选择性抑制增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成的原因至少不是由于Nd∶YAG激光的热效应所致。1 000 J/cm2激光的这种选择性作用机制尚需进一步研究。
, 百拇医药
参考文献
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收稿：1999-09-14
修回：1999-12-10, http://www.100md.com