尼古丁对牙乳头间充质细胞增殖的抑制作用
作者：王小竞 文玲英 杨富生 陈建元
单位：西安第四军医大学口腔医学院 710032
关键词：尼古丁；牙乳头；中胚层；增殖
实用口腔医学杂志000512
〔摘要〕 目的：探讨尼古丁对牙乳头间充质细胞增殖的可能影响。方法：用不同浓度的尼古丁硫酸盐作用于牙乳头间充质细胞，分别在3、5、7 d时，采用MTT法观察细胞增殖情况。结果：浓度低于0.05 g/L时，A 值变化不明显(P>0.05)；当浓度高于0.1 g/L时，A 值随尼古丁浓度增加而明显降低(P<0.01)。加药1 d时，实验组和对照组无明显差异，3 d后出现差异(P<0.05)，5～7d 时实验组与对照组出现明显差异(P<0.01)。结论：尼古丁抑制了牙乳头间充质细胞的增殖，可能造成对牙齿生长发育的影响。
, 百拇医药
中图分类号：R329.2+8 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0369-03
The inhibitory effect of nicotine on the proliferation of human dental papilla mesenchymal cells in vitro
Wang Xiaojing Wen Lingying Yang Fusheng
(Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
〔Abstract〕 Objective: To study the effect of nicotine on dental papilla mesenchymal cells. Methods: The effect of nicotine sulfate at various concentrations on the proliferation of human dental papilla mesenchymal cells was studied with MTT method. Results: When the concentration of nicotine sulfate was lower than 0.05 g/L,the absorbance value (A) of the treated cells was similar to that of the control(P>0.05).When the concentration of nicotine was higher than 0.1 g/L,the absorbance value of the treated cells was smaller than that of the control (P<0.01),and the absorbance value decreased with the increace of nicotine dosage.In one-day-expossure group,no difference of absorbance values was found between the treated and the control cells,in three-day- and seven-day-expossure groups,the absorbance values of the treated cells were smaller than that of the control (P<0.05 and P<0.01 respectively).Conclusion: Nicotine inhibite the proliferation of human dental papilla mesenchymal cells in a dose and time dependent manner.
, 百拇医药
Key words Nicotine; Dental papilla;Mesoderm; Proliferation
尼古丁是损害牙胚造成牙胚发育异常的重要原因之一。探讨它对牙胚细胞毒害的机制是防治其危害的关键。多年来，人们仅在流行病学调查和体内实验证实了这一现象〔1～3〕，但尼古丁是否干扰牙胚细胞的成熟和它们的重要生理功能、以及如何干扰等问题，至今仍不清楚。本文选择牙乳头细胞为研究对象，观察尼古丁对细胞增殖的可能影响，探讨细胞在增殖方面受到的干扰。
1 材料和方法
1.1 材料
尼古丁硫酸盐(Sigma USA) ；MTT(Sigma USA)；DMEM培养基(Gibco USA)；胰蛋白酶(Gibco USA)；胎牛血清(浙江金华清湖犊牛利用研究所)；DMSO(上海东风试剂厂)；96孔培养板(Gibco USA)；CO2孵箱(Forma Scientific USA)；DG -1 型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)；YJ-875型超净工作台 (苏州净化设备厂)；倒置显微镜和照相机系统 (Olympus Japan)
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 人牙乳头间充质细胞的培养 采用4个月龄女胎，75%乙醇消毒，分离上、下颌骨，无血清DMEM冲洗，无菌条件下剪开牙槽嵴粘膜，暴露并取出乳牙牙胚，在厚玻璃板上小心分离牙乳头组织，浸泡于φ=10%胎牛血清(fetal calf serum， FCS)的DMEM 培养液中备用。在超净工作台中，取出浸泡于培养液中的牙乳头组织，于培养液中剪成1 mm3大小的组织块，用消毒探针将组织块均匀铺于25 ml培养瓶底，瓶底向上，加入15%FCS的DMEM培养液4 ml，饱和湿度、5%(CO2)=，37 ℃(标准环境)孵育，约1.5～2 h 后翻转培养瓶，继续培养，每3天换液1 次，直至细胞从组织块周围游出。传代，取4～6 代细胞使用。
1.2.2 尼古丁对人牙乳头间充质细胞增殖影响的浓度效应 取第4代人牙乳头间充质细胞，用2.5 g/L 胰酶消化，调整细胞浓度至2×107个/L, 接种于96孔细胞培养板中，每孔液量100 μl。10% FCS的DMEM标准环境中培养24 h，弃孔内培养液，无血清DMEM 洗3 遍，吸干。随机分成5个实验组及1个对照组，每组6孔。实验组加入含有2% FCS的DMEM 和分别含有0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L 系列浓度的尼古丁硫酸盐，对照组只加入2% FCS 的 DMEM，每孔液量均为100 μl。 在标准环境中继续培养5 d，每孔内加入MTT溶液20 μl，再培养4 h，终止，倒置显微镜下观察结晶形成情况。吸净孔内液体，每孔加入DMSO 150 μl，震荡5 min，在DG -1 型酶联免疫检测仪上于490 nm波长下，测量各孔的A值，绘制尼古丁对人牙乳头间充质细胞增殖影响的浓度效应图，求出半抑制浓度(IC50)，并做统计学分析。
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1.2.3 尼古丁对人牙乳头间充质细胞增殖影响的时间效应 将第4 代人牙乳头间充质细胞接种于3 块96 孔细胞培养板，接种浓度为2×107个/L，每孔液量100 μl，标准环境下，在含有10% FCS 的 DMEM培养液培养24 h后，弃孔内培养液，无血清DMEM 洗3遍，吸干。从每块96 孔板中随机取6 孔做实验组，另取6 孔做对照组。实验组加入含有2% FCS及0.2 g/L尼古丁的DMEM，对照组只加入2%FCS的DMEM，分别于加药后1、3、5、7 d 随机取一块96 孔板，加MTT，测A 值，进行统计学分析，计算细胞存活率。
2 结 果
2.1 浓度效应
如图1所示，当尼古丁硫酸盐浓度低于0.05 g/L 时，A 值变化不明显(P>0.05)；当浓度高于0.1 g/L时，A值随尼古丁浓度增加而明显减低(P<0.01)；即随尼古丁浓度增加，人牙乳头间充质细胞存活率降低。倒置显微镜下观察，培养孔底部有紫黑色针状结晶形成，其量的多少与A 值的变化基本一致。
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图1 尼古丁对人牙乳头间充质细胞增殖影响的浓度效应
由于人牙乳头间充质细胞存活率与尼古丁硫酸盐浓度符合对数关系，故通过其拟合方程可求出半致死浓度(IC50)。拟合方程为：In(X1+0.92)=0.521-0.666X2其中 X1：细胞成活率，X2：尼古丁浓度；相关系数为 r=-0.9907 (P<0.01)。由此求出的半致死浓度(IC50)为0.232 g/L。以后的实验中，为了计算及药物配制方便，半致死浓度取为0.2 g/L。
2.2 时间效应
如图2 所示，加药1 d 时，实验组和对照组无明显差异，3 d 后出现差异(P<0.05)，5～7 d 时实验组与对照组有显著性差异(P<0.01)。
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图2 尼古丁硫酸盐(0.2 g/L)对人牙乳头间充质细胞增殖影响的时间效应
3 讨 论
本组实验观察了5 组不同浓度尼古丁硫酸盐在不同时间点对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖的影响。实验结果表明：当尼古丁硫酸盐的浓度低于0.05 g/L 时细胞存活率(A 值)虽下降，但与对照组相比无显著性差异；而当浓度高于0.1 g/L 时A 值随尼古丁硫酸盐浓度的增加而显著下降，即表明随尼古丁浓度增高，人牙乳头细胞的存活率降低。从时间效应看，尼古丁在加药3 d后开始显示抑制效应(P<0.05)，5～7 d 时差异最大(P<0.01)。说明尼古丁对人牙乳头间充质细胞有明显的抑制增殖作用，其抑制作用表现为对时间及剂量的依赖性，浓度越高，作用的时间越长，其抑制作用越强。浓度效应曲线图为典型的反S 型。
尼古丁是一种液态生物碱，它是一种高毒性、无色易挥发、溶于水、并可形成可溶性盐。由于它是烟草中的主要毒性物质，因此研究它的毒性作用在医学领域内具有很重要的意义。迄今为止的研究表明它除了可引起脑神经系统的损害外，还可对颌面部、牙齿发育产生影响，同时还具有抑制细胞增殖等作用〔4,5,6〕。Raulin〔4〕在研究尼古丁对人包皮成纤维细胞(HFF)粘附玻璃及牙根表面的影响时发现，高浓度组尼古丁(400 ng/ml)不仅影响HFF 的粘附能力，同时还可使细胞产生空泡变性、死亡，使得该浓度组活细胞数目下降。Giannopoulou等〔5〕发现不同浓度尼古丁作用于牙周膜细胞(PDL)时，可使细胞胞浆内产生空泡，形态发生改变，并且对细胞的增殖有抑制作用，呈浓度依赖性。Tipton〔6〕研究尼古丁对人牙龈成纤维细胞的作用时发现，当尼古丁浓度在0.001% ～ 0.075% 范围内时可抑制细胞的增殖，而当浓度大于0.075%时，细胞全部死亡。本实验0.8 g/L 组细胞存活率只有11.1%，生存细胞极少，与Tipton 结果一致。
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尼古丁作为烟草的活性成分，不论是以主动吸烟还是被动吸烟进入母体血液中的烟碱可迅速通过胎盘分布，对正在发育的胎儿产生影响，其中包括对胎儿牙胚发育的毒害作用〔1〕。Kieser〔2〕在流行病学调查中报道，双亲都吸烟的儿童牙齿成熟率降低了35%，造成牙胚发育异常甚至无牙胚形成。Heikkinen〔3〕在母亲吸烟与胎儿发育关系的调查中发现，胎儿期形成的恒牙形态异常与孕妇吸烟有关。动物实验中发现，尼古丁不仅影响胎鼠的总体发育，而且也影响牙胚发育，使牙胚发育迟缓，形态异常或牙胚消失〔4〕。从中推测，尼古丁可能干扰了牙胚细胞的成熟，或可能有抑制牙胚细胞某些代谢活动的毒性作用。本实验采用MTT法检测牙乳头间充质细胞在尼古丁作用下所显示的毒害作用。结果表明：一定浓度的尼古丁对牙乳头间充质细胞的增殖有抑制作用。我们推测尼古丁由于抑制了牙乳头间充质细胞的增殖，可能造成对牙齿生长发育的影响。
参考文献
, 百拇医药
1，Seller MJ, Bnait KS. Effects of tobacco smoke inhalation on the developing mouse embryo and fetus . Reprod Toxicol , 1995,9(5):449
2，Kieser JA, Groeneveld HT. Silva PD. Delayed tooth formation in children exposed to tobacco smoke. J Clin Pediate Dent, 1996, 20(2): 97
3，Heikkinen T, Alvesalo L, Osborne RH, et al.: Maternal smoking and tooth formation in the foetus. III. Thin mandibula incisors and delayed molar development at 1 year of age. Early Hum Dev, 1997, 47(3) 327
, http://www.100md.com
4，Raulin LA, McPherson JC, McQuade MJ, et al.The effect of nicotine on the attachment of human fibroblasts to glass and human root surfaces in vitro. J Periodontol，1988, 59(5): 318
5，Giannopoulou C, Geinoz A, Cimasoni G. Effects of nicotine on periodontal ligament fibroblasts in vitro. J Clin Periodontol, 1999,26(1):49
6，Tipton DA, Dabbons MK. Effects of nicotine on proliferation and extracellular matrix production of human gingival fibroblasts in vitro. J Periodontol,1995, 66(12):1056
(收稿：2000-03-15修回：2000-04-24), http://www.100md.com
单位：西安第四军医大学口腔医学院 710032
关键词：尼古丁；牙乳头；中胚层；增殖
实用口腔医学杂志000512
〔摘要〕 目的：探讨尼古丁对牙乳头间充质细胞增殖的可能影响。方法：用不同浓度的尼古丁硫酸盐作用于牙乳头间充质细胞，分别在3、5、7 d时，采用MTT法观察细胞增殖情况。结果：浓度低于0.05 g/L时，A 值变化不明显(P>0.05)；当浓度高于0.1 g/L时，A 值随尼古丁浓度增加而明显降低(P<0.01)。加药1 d时，实验组和对照组无明显差异，3 d后出现差异(P<0.05)，5～7d 时实验组与对照组出现明显差异(P<0.01)。结论：尼古丁抑制了牙乳头间充质细胞的增殖，可能造成对牙齿生长发育的影响。
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中图分类号：R329.2+8 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0369-03
The inhibitory effect of nicotine on the proliferation of human dental papilla mesenchymal cells in vitro
Wang Xiaojing Wen Lingying Yang Fusheng
(Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
〔Abstract〕 Objective: To study the effect of nicotine on dental papilla mesenchymal cells. Methods: The effect of nicotine sulfate at various concentrations on the proliferation of human dental papilla mesenchymal cells was studied with MTT method. Results: When the concentration of nicotine sulfate was lower than 0.05 g/L,the absorbance value (A) of the treated cells was similar to that of the control(P>0.05).When the concentration of nicotine was higher than 0.1 g/L,the absorbance value of the treated cells was smaller than that of the control (P<0.01),and the absorbance value decreased with the increace of nicotine dosage.In one-day-expossure group,no difference of absorbance values was found between the treated and the control cells,in three-day- and seven-day-expossure groups,the absorbance values of the treated cells were smaller than that of the control (P<0.05 and P<0.01 respectively).Conclusion: Nicotine inhibite the proliferation of human dental papilla mesenchymal cells in a dose and time dependent manner.
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Key words Nicotine; Dental papilla;Mesoderm; Proliferation
尼古丁是损害牙胚造成牙胚发育异常的重要原因之一。探讨它对牙胚细胞毒害的机制是防治其危害的关键。多年来，人们仅在流行病学调查和体内实验证实了这一现象〔1～3〕，但尼古丁是否干扰牙胚细胞的成熟和它们的重要生理功能、以及如何干扰等问题，至今仍不清楚。本文选择牙乳头细胞为研究对象，观察尼古丁对细胞增殖的可能影响，探讨细胞在增殖方面受到的干扰。
1 材料和方法
1.1 材料
尼古丁硫酸盐(Sigma USA) ；MTT(Sigma USA)；DMEM培养基(Gibco USA)；胰蛋白酶(Gibco USA)；胎牛血清(浙江金华清湖犊牛利用研究所)；DMSO(上海东风试剂厂)；96孔培养板(Gibco USA)；CO2孵箱(Forma Scientific USA)；DG -1 型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)；YJ-875型超净工作台 (苏州净化设备厂)；倒置显微镜和照相机系统 (Olympus Japan)
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1.2 方法
1.2.1 人牙乳头间充质细胞的培养 采用4个月龄女胎，75%乙醇消毒，分离上、下颌骨，无血清DMEM冲洗，无菌条件下剪开牙槽嵴粘膜，暴露并取出乳牙牙胚，在厚玻璃板上小心分离牙乳头组织，浸泡于φ=10%胎牛血清(fetal calf serum， FCS)的DMEM 培养液中备用。在超净工作台中，取出浸泡于培养液中的牙乳头组织，于培养液中剪成1 mm3大小的组织块，用消毒探针将组织块均匀铺于25 ml培养瓶底，瓶底向上，加入15%FCS的DMEM培养液4 ml，饱和湿度、5%(CO2)=，37 ℃(标准环境)孵育，约1.5～2 h 后翻转培养瓶，继续培养，每3天换液1 次，直至细胞从组织块周围游出。传代，取4～6 代细胞使用。
1.2.2 尼古丁对人牙乳头间充质细胞增殖影响的浓度效应 取第4代人牙乳头间充质细胞，用2.5 g/L 胰酶消化，调整细胞浓度至2×107个/L, 接种于96孔细胞培养板中，每孔液量100 μl。10% FCS的DMEM标准环境中培养24 h，弃孔内培养液，无血清DMEM 洗3 遍，吸干。随机分成5个实验组及1个对照组，每组6孔。实验组加入含有2% FCS的DMEM 和分别含有0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L 系列浓度的尼古丁硫酸盐，对照组只加入2% FCS 的 DMEM，每孔液量均为100 μl。 在标准环境中继续培养5 d，每孔内加入MTT溶液20 μl，再培养4 h，终止，倒置显微镜下观察结晶形成情况。吸净孔内液体，每孔加入DMSO 150 μl，震荡5 min，在DG -1 型酶联免疫检测仪上于490 nm波长下，测量各孔的A值，绘制尼古丁对人牙乳头间充质细胞增殖影响的浓度效应图，求出半抑制浓度(IC50)，并做统计学分析。
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1.2.3 尼古丁对人牙乳头间充质细胞增殖影响的时间效应 将第4 代人牙乳头间充质细胞接种于3 块96 孔细胞培养板，接种浓度为2×107个/L，每孔液量100 μl，标准环境下，在含有10% FCS 的 DMEM培养液培养24 h后，弃孔内培养液，无血清DMEM 洗3遍，吸干。从每块96 孔板中随机取6 孔做实验组，另取6 孔做对照组。实验组加入含有2% FCS及0.2 g/L尼古丁的DMEM，对照组只加入2%FCS的DMEM，分别于加药后1、3、5、7 d 随机取一块96 孔板，加MTT，测A 值，进行统计学分析，计算细胞存活率。
2 结 果
2.1 浓度效应
如图1所示，当尼古丁硫酸盐浓度低于0.05 g/L 时，A 值变化不明显(P>0.05)；当浓度高于0.1 g/L时，A值随尼古丁浓度增加而明显减低(P<0.01)；即随尼古丁浓度增加，人牙乳头间充质细胞存活率降低。倒置显微镜下观察，培养孔底部有紫黑色针状结晶形成，其量的多少与A 值的变化基本一致。
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图1 尼古丁对人牙乳头间充质细胞增殖影响的浓度效应
由于人牙乳头间充质细胞存活率与尼古丁硫酸盐浓度符合对数关系，故通过其拟合方程可求出半致死浓度(IC50)。拟合方程为：In(X1+0.92)=0.521-0.666X2其中 X1：细胞成活率，X2：尼古丁浓度；相关系数为 r=-0.9907 (P<0.01)。由此求出的半致死浓度(IC50)为0.232 g/L。以后的实验中，为了计算及药物配制方便，半致死浓度取为0.2 g/L。
2.2 时间效应
如图2 所示，加药1 d 时，实验组和对照组无明显差异，3 d 后出现差异(P<0.05)，5～7 d 时实验组与对照组有显著性差异(P<0.01)。
, 百拇医药
图2 尼古丁硫酸盐(0.2 g/L)对人牙乳头间充质细胞增殖影响的时间效应
3 讨 论
本组实验观察了5 组不同浓度尼古丁硫酸盐在不同时间点对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖的影响。实验结果表明：当尼古丁硫酸盐的浓度低于0.05 g/L 时细胞存活率(A 值)虽下降，但与对照组相比无显著性差异；而当浓度高于0.1 g/L 时A 值随尼古丁硫酸盐浓度的增加而显著下降，即表明随尼古丁浓度增高，人牙乳头细胞的存活率降低。从时间效应看，尼古丁在加药3 d后开始显示抑制效应(P<0.05)，5～7 d 时差异最大(P<0.01)。说明尼古丁对人牙乳头间充质细胞有明显的抑制增殖作用，其抑制作用表现为对时间及剂量的依赖性，浓度越高，作用的时间越长，其抑制作用越强。浓度效应曲线图为典型的反S 型。
尼古丁是一种液态生物碱，它是一种高毒性、无色易挥发、溶于水、并可形成可溶性盐。由于它是烟草中的主要毒性物质，因此研究它的毒性作用在医学领域内具有很重要的意义。迄今为止的研究表明它除了可引起脑神经系统的损害外，还可对颌面部、牙齿发育产生影响，同时还具有抑制细胞增殖等作用〔4,5,6〕。Raulin〔4〕在研究尼古丁对人包皮成纤维细胞(HFF)粘附玻璃及牙根表面的影响时发现，高浓度组尼古丁(400 ng/ml)不仅影响HFF 的粘附能力，同时还可使细胞产生空泡变性、死亡，使得该浓度组活细胞数目下降。Giannopoulou等〔5〕发现不同浓度尼古丁作用于牙周膜细胞(PDL)时，可使细胞胞浆内产生空泡，形态发生改变，并且对细胞的增殖有抑制作用，呈浓度依赖性。Tipton〔6〕研究尼古丁对人牙龈成纤维细胞的作用时发现，当尼古丁浓度在0.001% ～ 0.075% 范围内时可抑制细胞的增殖，而当浓度大于0.075%时，细胞全部死亡。本实验0.8 g/L 组细胞存活率只有11.1%，生存细胞极少，与Tipton 结果一致。
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尼古丁作为烟草的活性成分，不论是以主动吸烟还是被动吸烟进入母体血液中的烟碱可迅速通过胎盘分布，对正在发育的胎儿产生影响，其中包括对胎儿牙胚发育的毒害作用〔1〕。Kieser〔2〕在流行病学调查中报道，双亲都吸烟的儿童牙齿成熟率降低了35%，造成牙胚发育异常甚至无牙胚形成。Heikkinen〔3〕在母亲吸烟与胎儿发育关系的调查中发现，胎儿期形成的恒牙形态异常与孕妇吸烟有关。动物实验中发现，尼古丁不仅影响胎鼠的总体发育，而且也影响牙胚发育，使牙胚发育迟缓，形态异常或牙胚消失〔4〕。从中推测，尼古丁可能干扰了牙胚细胞的成熟，或可能有抑制牙胚细胞某些代谢活动的毒性作用。本实验采用MTT法检测牙乳头间充质细胞在尼古丁作用下所显示的毒害作用。结果表明：一定浓度的尼古丁对牙乳头间充质细胞的增殖有抑制作用。我们推测尼古丁由于抑制了牙乳头间充质细胞的增殖，可能造成对牙齿生长发育的影响。
参考文献
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1，Seller MJ, Bnait KS. Effects of tobacco smoke inhalation on the developing mouse embryo and fetus . Reprod Toxicol , 1995,9(5):449
2，Kieser JA, Groeneveld HT. Silva PD. Delayed tooth formation in children exposed to tobacco smoke. J Clin Pediate Dent, 1996, 20(2): 97
3，Heikkinen T, Alvesalo L, Osborne RH, et al.: Maternal smoking and tooth formation in the foetus. III. Thin mandibula incisors and delayed molar development at 1 year of age. Early Hum Dev, 1997, 47(3) 327
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4，Raulin LA, McPherson JC, McQuade MJ, et al.The effect of nicotine on the attachment of human fibroblasts to glass and human root surfaces in vitro. J Periodontol，1988, 59(5): 318
5，Giannopoulou C, Geinoz A, Cimasoni G. Effects of nicotine on periodontal ligament fibroblasts in vitro. J Clin Periodontol, 1999,26(1):49
6，Tipton DA, Dabbons MK. Effects of nicotine on proliferation and extracellular matrix production of human gingival fibroblasts in vitro. J Periodontol,1995, 66(12):1056
(收稿：2000-03-15修回：2000-04-24), http://www.100md.com