普罗布考的化学结构及其有关物质检查
作者：方树青 王文信 陆辉明 黄飞龙 郭丽梅 洪 霞 党晓伟
单位：河北省承德市普宁制药厂，承德 067000
关键词：普罗布考；化学结构；有关物质
中国新药杂志990829
摘要 目的：研究普罗布考的化学结构和有关物质检查。方法：通过元素分析、红外光谱(IR)、紫外-可见光谱(UV-VIS)、氢核磁共振谱(1H-NMR)、碳核磁共振谱(13C-NMR)及质谱(MS)法测定普罗布考的化学结构。其有关物质用高效液相(HPLC)反相法测定，并做了本法与美国药典(USP)法的比较。结果：化学结构研究所得数据与其结构一致；HPLC反相法所控制有关物质A(2，2'，6，6'-四叔丁基二苯醌)、有关物质B(4，4'-(二硫)双(2，6-二叔丁基苯酚))和有关物质C([4-[(3，5-二叔丁基-2-羟苯硫)亚异丙基硫]-2，6-二叔丁基苯酚])量分别为USP法限量的1/10，1/2和1/10。结论：普罗布考的化学结构与其对照品一致，HPLC反相法所控制的有关物质A，B及C量较USP法限定量低得多。
, 百拇医药
THE CHEMICAL STRUCTURE AND TEST ON RELATIVE SUBSTANCES OF PROBUCOL
Fang Shuqing, Wang Wenxin, Lu Huiming，et al.
(Puning Pharmaceutical Factory, Chengde City, Chengde 067000)
ABSTRACT OBJECTIVE:To study chemical structure and test on relative substances of probucol.METHODS:The chemical structure of probucol was determined by element analysis, IR, UV-VIS,1H-NMR,13C-NMR, and MS and the relative substances of probucol were determined by reversed-phase HPLC in comparison with the US Pharmacopeia(USP) method.RESULTS:The data obtained in the chemical structure study were identical with its structure. The relative substance A(2,2',6,6'-tetra-tert-butyldiphenoquinone),B([4,4'-(dithio)bis(2,6-di-tert-butylphenol)]) and C([4-[(3,5-di-tert-butyl -2-hydroxyphenylthio)-isopropylidenethio]-2,6-di-tert-butylphenol]) level controlled by reversed-phase HPLC were one tenth,one half,and one tenth of those limited by USP method.CONCLUSION: The chemical structure of probucol was confirmed by instrumental analysis in comparison with reference standard. The relative substance A, B, and C level controlled by reversed-phase HPLC were much lower than that limited by USP method.
, 百拇医药
KEY WORDS Probucol; Chemical structure; Relative substances
普罗布考(probucol ,丙丁酚)及其片剂是调脂、抗动脉粥样硬化药，其化学名为4，4-[(1-甲基亚乙基)双(硫)]双[2，6-双(1，1-二甲基乙基)苯酚]。
我们对普罗布考的化学结构及其有关物质检查法作了研究，所定检查法符合国情且较美国药典有改进。
1 材料
1.1 药品 普罗布考供试品为自制；普罗布考对照品由美国Marion Merrell Dow 公司所产片剂经乙醚提取，乙醇精制而得；普罗布考有关物质A(2，2'，6，6'-四叔丁基二苯醌)，B(4，4'-(二硫)双(2，6-二叔丁基苯酚))及C([4-[(3，5-二叔丁基-2-羟苯硫)亚异丙基硫]-2，6-二叔丁基苯酚])对照品均购自美国药典会。
, http://www.100md.com
1.2 仪器 意大利Carlo-Erba 1106元素分析仪；Perkin-Elmer 983型红外光谱仪；日本岛津UV-260紫外分光光度计；BRUKER AC-250核磁共振波谱仪(1H-NMR仪)；AM-500 13C-NMR仪；Zabspec质谱仪；美国Warters 公司LC-6A型高效液相仪，P-E公司LC-250型高效液相仪。
2 方法
红外：溴化钾压片法；1H-NMR：内标TMS，溶剂CDCl3，室温；13C-NMR：内标TMS，溶剂CDCl3；质谱：EI源，分辨率1 000，源温20℃，扫描范围50～1 000。通过元素分析、红外、紫外，1H-NMR，13C-NMR，质谱数据，综合分析，确定本品化学结构。通过美国药典高效液相(HPLC)正相法和本厂HPLC反相法的测定数据对比，确定HPLC反相法检查有关物质的可行性。
, 百拇医药
3 结果
3.1 化学结构测定 普罗布考供试品为白色结晶性粉末，不溶于水，溶于乙醇、甲醇、石油醚，极易溶于氯仿、丙酮；mp 125～126℃。元素分析(%)：实测值 C为71.95，H为9.29，S为12.28；理论值C为71.97，H为9.29，S为12.38。IR(KBr)cm-1：3 630，2 960，1 575, 1 395, 1 360, 1 420, 1 375,1 200,1 100,886,供试品与对照品数据一致。UV-VIS为λEtoHmaXnm:供试品为207.4，241.6，对照品为207.8,241.8;供试品为200.2, 222.0, 266.4，对照品为200.4，222.6，268.0 (HCl)；供试品为216.2，258.2，327.2 ，对照品为216.0，258.4，327.6 (NaOH)；供试品与对照品紫外吸收数据相一致。1HNMR的δ值：1.44(42H, m)，5.36(2H,m)，7.45(4H,m)，供试品与对照品数据一致。13C NMRδ值：30.474，30.314(14C)，34.326(4C)，59.162(1C)，122.303(4C)，134.086 (4C)，135.967(2C)，154.909(2C)，供试品与对照品数据一致。MS m/e(%)：516.4(M,23)，501.3(15)，442.3(12)，410.3(7)，279.2(基峰)，238.1(24)，223.1(38)，供试品与对照品数据一致。
, 百拇医药
3.2 有关物质检查
3.2.1 HPLC反相法 取本品适量，加含量测定项下的流动相振摇约15 min至溶解，并制成1.0 mg/ml的溶液，作为供试品溶液，精密量取适量，加流动相稀释成10 μg/ml的溶液作对照液，照含量测定项下的方法，检测波长为254 nm，取对照液20 μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰为满量程的20%～25%。精密量取供试品液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍，各杂质峰面积之和不得大于对照液主峰的面积(1.0%，杂质峰不得多于3个)。
3.2.2 USP法[1] 流动相：将无水乙醇和正己烷制成1∶4 000的溶液，必要时可调节。
对照品A，B，C溶液：精密称量美国药典普罗布考有关化合物A，B，C对照品，溶于正己烷，用正己烷定量分步稀释成约10 μg/ml，1 mg/ml,1mg/ml液。
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对照液：将10 ml对照品C液，1 ml对照品B液和4 ml对照品A液移入200 ml容量瓶，用正己烷稀释至刻度，混匀。
供试液：将约1 g普罗布考精密称定，加入25 ml容量瓶，溶于正己烷，用正己烷稀释至刻度，混匀。
系统适应性试验品：将1 ml对照品B液和1 ml供试液移入200 ml容量瓶，用正己烷稀释至刻度，混匀。
色谱系统：装有254 nm和420 nm检测器及4.6 mm×25 cm硅胶柱(5～10 μm多孔硅胶)的液相色谱仪。流速约1 ml/min。将系统适应性试验品注入色谱仪，记录峰, 于254 nm检测有关化合物B和普罗布考，前者首先流出，峰的分离度(R)应大于2.5，重复注射，普罗布考峰的相对标准差应小于2%。
测定法：将等体积(约20 μl)的对照液和供试液分别注入色谱仪，记录色谱图，测定峰面积。洗脱次序是化合物C，B，A，最后是普罗布考。化合物A在420 nm检测，其它在254 nm检测。计算每一个有关化合物对普罗布考的百分比，公式为:2 500(C/W)(ru/rs)，此处，C是对照液内美国药典普罗布考各有关化合物对照品的浓度，以mg/ml计；W是普罗布考的重量，以mg计；ru 和rs 分别是供试品和对照品的峰面积。化合物A应小于0.0005%，化合物B应小于0.02%，化合物C应小于0.5%。
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4 讨论
4.1 化学结构测定 元素分析实测值与理论值比，误差均未超0.3%，符合规定；从红外光谱得知，供试品结构中有-OH，-CH3，-HC=CH-(苯环)，CH3-C-CH3，C-S；由于本品结构中含有酚羟基，所以，溶液的pH值对紫外光谱影响很大，在碱性液中吸收峰向长波长位移，而在酸性液中，向短波长位移，中性液中，在242 nm有其n-π.跃迁的最大吸收；紫外光谱证明本品有酚和苯硫结构；氢核磁共振谱证明供试品含甲基氢、酚羟基氢(D2O交换后自图谱中消失)、苯环氢、3组48个氢，其积分比为21∶1∶2，说明分子结构有对称性；碳核磁共振谱证明供试品含甲基碳，叔丁基中的季碳，-S-C-S-的碳，苯环上无取代的碳，苯环与叔丁基连接的碳，苯环与-OH连接的碳，苯环与硫连接的碳；质谱的分子离子峰m/e与普罗布考相符；确定为普罗布考结构。
4.2 有关物质检查 23版USP用HPLC正相法，以本品有关物质A，B，C对照品作对照分别检测这三个杂质的含量。本品有关物质A，B及C对照品除美国药典会有保存外，再无任何地方可购得，而美国药典会对这类物质并不供应国外，故国内检验用该法难度很大。我们将该法改为HPLC反相法后解决了这一难题，且与本品含量测定法取得一致。但本法只能限制有关物质的总量，不能分别检测A，B及C有关物质，这就涉及到本法能否控制杂质限量，尤其是美国药典限定有关物质A为0.0005%，如此低的限量，本法能否达到？从表1、表2看出，本法控制的本品3个有关物质量完全用美国药典法检测后，有关物质A的量为美国药典规定1/10，有关物质B的量为1/2，有关物质C为1/10。总之，本标准既符合了国情，又能满意地控制普罗布考有关物质量。
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表1 HPLC反相法测定普罗布考有关物质 (%) 批 号
有关物质
总量
A
B
C
950617
0
0.1
0.24
0.39
950621
0
, http://www.100md.com
0.09
0.23
0.39
950625
0.08
0.25
0.33
平 均
0
0.09
0.24
0.37
表2 美国药典法测定普罗布考有关物质 (%) 批 号
, 百拇医药
有关物质
总量
A
B
C
950617
0.000050
0.0097
0.045
0.05475
950621
0.000044
0.012
, 百拇医药
0.046
0.058044
950625
0.000051
0.010
0.058
0.06851
平 均
0.000048
0.011
0.050
0.060435
参考文献
1 Mark N,Donald R B，John T F，et al. U.S.PHARMACOPEIA (USP23)-NATIONAL FORMULARY(NF18).Ⅱ.The United States Pharmacopeial Convestion Inc，1995.1292～1293
(收稿：1999-03-03 修回：1999-07-09), http://www.100md.com
单位：河北省承德市普宁制药厂，承德 067000
关键词：普罗布考；化学结构；有关物质
中国新药杂志990829
摘要 目的：研究普罗布考的化学结构和有关物质检查。方法：通过元素分析、红外光谱(IR)、紫外-可见光谱(UV-VIS)、氢核磁共振谱(1H-NMR)、碳核磁共振谱(13C-NMR)及质谱(MS)法测定普罗布考的化学结构。其有关物质用高效液相(HPLC)反相法测定，并做了本法与美国药典(USP)法的比较。结果：化学结构研究所得数据与其结构一致；HPLC反相法所控制有关物质A(2，2'，6，6'-四叔丁基二苯醌)、有关物质B(4，4'-(二硫)双(2，6-二叔丁基苯酚))和有关物质C([4-[(3，5-二叔丁基-2-羟苯硫)亚异丙基硫]-2，6-二叔丁基苯酚])量分别为USP法限量的1/10，1/2和1/10。结论：普罗布考的化学结构与其对照品一致，HPLC反相法所控制的有关物质A，B及C量较USP法限定量低得多。
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THE CHEMICAL STRUCTURE AND TEST ON RELATIVE SUBSTANCES OF PROBUCOL
Fang Shuqing, Wang Wenxin, Lu Huiming，et al.
(Puning Pharmaceutical Factory, Chengde City, Chengde 067000)
ABSTRACT OBJECTIVE:To study chemical structure and test on relative substances of probucol.METHODS:The chemical structure of probucol was determined by element analysis, IR, UV-VIS,1H-NMR,13C-NMR, and MS and the relative substances of probucol were determined by reversed-phase HPLC in comparison with the US Pharmacopeia(USP) method.RESULTS:The data obtained in the chemical structure study were identical with its structure. The relative substance A(2,2',6,6'-tetra-tert-butyldiphenoquinone),B([4,4'-(dithio)bis(2,6-di-tert-butylphenol)]) and C([4-[(3,5-di-tert-butyl -2-hydroxyphenylthio)-isopropylidenethio]-2,6-di-tert-butylphenol]) level controlled by reversed-phase HPLC were one tenth,one half,and one tenth of those limited by USP method.CONCLUSION: The chemical structure of probucol was confirmed by instrumental analysis in comparison with reference standard. The relative substance A, B, and C level controlled by reversed-phase HPLC were much lower than that limited by USP method.
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KEY WORDS Probucol; Chemical structure; Relative substances
普罗布考(probucol ,丙丁酚)及其片剂是调脂、抗动脉粥样硬化药，其化学名为4，4-[(1-甲基亚乙基)双(硫)]双[2，6-双(1，1-二甲基乙基)苯酚]。
我们对普罗布考的化学结构及其有关物质检查法作了研究，所定检查法符合国情且较美国药典有改进。
1 材料
1.1 药品 普罗布考供试品为自制；普罗布考对照品由美国Marion Merrell Dow 公司所产片剂经乙醚提取，乙醇精制而得；普罗布考有关物质A(2，2'，6，6'-四叔丁基二苯醌)，B(4，4'-(二硫)双(2，6-二叔丁基苯酚))及C([4-[(3，5-二叔丁基-2-羟苯硫)亚异丙基硫]-2，6-二叔丁基苯酚])对照品均购自美国药典会。
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1.2 仪器 意大利Carlo-Erba 1106元素分析仪；Perkin-Elmer 983型红外光谱仪；日本岛津UV-260紫外分光光度计；BRUKER AC-250核磁共振波谱仪(1H-NMR仪)；AM-500 13C-NMR仪；Zabspec质谱仪；美国Warters 公司LC-6A型高效液相仪，P-E公司LC-250型高效液相仪。
2 方法
红外：溴化钾压片法；1H-NMR：内标TMS，溶剂CDCl3，室温；13C-NMR：内标TMS，溶剂CDCl3；质谱：EI源，分辨率1 000，源温20℃，扫描范围50～1 000。通过元素分析、红外、紫外，1H-NMR，13C-NMR，质谱数据，综合分析，确定本品化学结构。通过美国药典高效液相(HPLC)正相法和本厂HPLC反相法的测定数据对比，确定HPLC反相法检查有关物质的可行性。
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3 结果
3.1 化学结构测定 普罗布考供试品为白色结晶性粉末，不溶于水，溶于乙醇、甲醇、石油醚，极易溶于氯仿、丙酮；mp 125～126℃。元素分析(%)：实测值 C为71.95，H为9.29，S为12.28；理论值C为71.97，H为9.29，S为12.38。IR(KBr)cm-1：3 630，2 960，1 575, 1 395, 1 360, 1 420, 1 375,1 200,1 100,886,供试品与对照品数据一致。UV-VIS为λEtoHmaXnm:供试品为207.4，241.6，对照品为207.8,241.8;供试品为200.2, 222.0, 266.4，对照品为200.4，222.6，268.0 (HCl)；供试品为216.2，258.2，327.2 ，对照品为216.0，258.4，327.6 (NaOH)；供试品与对照品紫外吸收数据相一致。1HNMR的δ值：1.44(42H, m)，5.36(2H,m)，7.45(4H,m)，供试品与对照品数据一致。13C NMRδ值：30.474，30.314(14C)，34.326(4C)，59.162(1C)，122.303(4C)，134.086 (4C)，135.967(2C)，154.909(2C)，供试品与对照品数据一致。MS m/e(%)：516.4(M,23)，501.3(15)，442.3(12)，410.3(7)，279.2(基峰)，238.1(24)，223.1(38)，供试品与对照品数据一致。
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3.2 有关物质检查
3.2.1 HPLC反相法 取本品适量，加含量测定项下的流动相振摇约15 min至溶解，并制成1.0 mg/ml的溶液，作为供试品溶液，精密量取适量，加流动相稀释成10 μg/ml的溶液作对照液，照含量测定项下的方法，检测波长为254 nm，取对照液20 μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰为满量程的20%～25%。精密量取供试品液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍，各杂质峰面积之和不得大于对照液主峰的面积(1.0%，杂质峰不得多于3个)。
3.2.2 USP法[1] 流动相：将无水乙醇和正己烷制成1∶4 000的溶液，必要时可调节。
对照品A，B，C溶液：精密称量美国药典普罗布考有关化合物A，B，C对照品，溶于正己烷，用正己烷定量分步稀释成约10 μg/ml，1 mg/ml,1mg/ml液。
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对照液：将10 ml对照品C液，1 ml对照品B液和4 ml对照品A液移入200 ml容量瓶，用正己烷稀释至刻度，混匀。
供试液：将约1 g普罗布考精密称定，加入25 ml容量瓶，溶于正己烷，用正己烷稀释至刻度，混匀。
系统适应性试验品：将1 ml对照品B液和1 ml供试液移入200 ml容量瓶，用正己烷稀释至刻度，混匀。
色谱系统：装有254 nm和420 nm检测器及4.6 mm×25 cm硅胶柱(5～10 μm多孔硅胶)的液相色谱仪。流速约1 ml/min。将系统适应性试验品注入色谱仪，记录峰, 于254 nm检测有关化合物B和普罗布考，前者首先流出，峰的分离度(R)应大于2.5，重复注射，普罗布考峰的相对标准差应小于2%。
测定法：将等体积(约20 μl)的对照液和供试液分别注入色谱仪，记录色谱图，测定峰面积。洗脱次序是化合物C，B，A，最后是普罗布考。化合物A在420 nm检测，其它在254 nm检测。计算每一个有关化合物对普罗布考的百分比，公式为:2 500(C/W)(ru/rs)，此处，C是对照液内美国药典普罗布考各有关化合物对照品的浓度，以mg/ml计；W是普罗布考的重量，以mg计；ru 和rs 分别是供试品和对照品的峰面积。化合物A应小于0.0005%，化合物B应小于0.02%，化合物C应小于0.5%。
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4 讨论
4.1 化学结构测定 元素分析实测值与理论值比，误差均未超0.3%，符合规定；从红外光谱得知，供试品结构中有-OH，-CH3，-HC=CH-(苯环)，CH3-C-CH3，C-S；由于本品结构中含有酚羟基，所以，溶液的pH值对紫外光谱影响很大，在碱性液中吸收峰向长波长位移，而在酸性液中，向短波长位移，中性液中，在242 nm有其n-π.跃迁的最大吸收；紫外光谱证明本品有酚和苯硫结构；氢核磁共振谱证明供试品含甲基氢、酚羟基氢(D2O交换后自图谱中消失)、苯环氢、3组48个氢，其积分比为21∶1∶2，说明分子结构有对称性；碳核磁共振谱证明供试品含甲基碳，叔丁基中的季碳，-S-C-S-的碳，苯环上无取代的碳，苯环与叔丁基连接的碳，苯环与-OH连接的碳，苯环与硫连接的碳；质谱的分子离子峰m/e与普罗布考相符；确定为普罗布考结构。
4.2 有关物质检查 23版USP用HPLC正相法，以本品有关物质A，B，C对照品作对照分别检测这三个杂质的含量。本品有关物质A，B及C对照品除美国药典会有保存外，再无任何地方可购得，而美国药典会对这类物质并不供应国外，故国内检验用该法难度很大。我们将该法改为HPLC反相法后解决了这一难题，且与本品含量测定法取得一致。但本法只能限制有关物质的总量，不能分别检测A，B及C有关物质，这就涉及到本法能否控制杂质限量，尤其是美国药典限定有关物质A为0.0005%，如此低的限量，本法能否达到？从表1、表2看出，本法控制的本品3个有关物质量完全用美国药典法检测后，有关物质A的量为美国药典规定1/10，有关物质B的量为1/2，有关物质C为1/10。总之，本标准既符合了国情，又能满意地控制普罗布考有关物质量。
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表1 HPLC反相法测定普罗布考有关物质 (%) 批 号
有关物质
总量
A
B
C
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0
0.1
0.24
0.39
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0.09
0.23
0.39
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0.08
0.25
0.33
平 均
0
0.09
0.24
0.37
表2 美国药典法测定普罗布考有关物质 (%) 批 号
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有关物质
总量
A
B
C
950617
0.000050
0.0097
0.045
0.05475
950621
0.000044
0.012
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0.058044
950625
0.000051
0.010
0.058
0.06851
平 均
0.000048
0.011
0.050
0.060435
参考文献
1 Mark N,Donald R B，John T F，et al. U.S.PHARMACOPEIA (USP23)-NATIONAL FORMULARY(NF18).Ⅱ.The United States Pharmacopeial Convestion Inc，1995.1292～1293
(收稿：1999-03-03 修回：1999-07-09), http://www.100md.com