戊二酰亚胺类抗生素S-632家族的研究进展
作者：刘琼岩 李电东
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 医药生物技术研究所，北京 100050
关键词：戊二酰亚胺类抗生素；发酵；分离提取；结构鉴定
中国新药杂志000505 摘要 综述了戊二酰亚胺类抗生素产生菌S-632的分类鉴定，发酵流程及其产生的戊二酰亚胺抗生素S-632-A,B的分离提取，结构鉴定，理化性质及生物学活性的研究。
PROGRESS ON RESEARCH OF GLUTARIMIDE ANTIBIOTICS S-632 FAMILY
Liu Qiongyan Li Diandong
(Institute of Medical Biotechnology,Chinese Union Medical
, http://www.100md.com
University,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100050)
ABSTRACT Studies on the tantonomy of strain from which glutarimide antibiotics S-632 were produced,the fermentation and isolation processes of glutarimide antibiotics,S-632-A,B;their structure elucidation,physical and chemical properties,and bioactivity were reviewed.
KEY WORDS Glutarimide antibiotics;Fermentation;Isolation;Structure elucidation
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在筛选新抗生素过程中，我所从山东省的土样中筛选出具有抗Saccharomyces.cereisiae 的菌株S-632。根据分类学研究命名其为吸水链霉菌(Streptomyces.hygroscopicus)，其发酵液成分极其复杂，就其产生的戊二酰亚胺类抗生素而言有4种，分别为S-632-A1,A2,S-632-B1,B2,其中S-632-A1是1959年Kohberger等[1]发现并定名为链霉戊二酰亚胺(steptimidone)。S-632-A2是1974年Noriyuki Saito等发现的一种抗病毒抗生素，产生菌为链霉菌S-885(Streptomyces sp.S-885)。该抗生素定名为9-甲基链霉戊二酰亚胺(9-methylstreptimidone)。这2种抗生素绝对构型的确定是1976年由 Becker等[2]完成，后来由于菌种S-632的出现并产生该2种抗生素，才开始称为S-632-A1,A2。此外在发酵早期还有聚醚类抗生素灰争霉素产生，该抗生素随后分解。发酵液中除戊二酰亚胺类外还有多烯类抗生素S-632-D的存在以及核苷类抗生素巴梭霉素(sparsomycin)和S-去氧-巴梭霉素(S-deoxy-sparsomycin)。因此对菌种S-632的深入研究，对更有效地寻找新的抗生素，特别是新戊二酰亚胺类抗生素有重要意义。
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1 S-632的分类学研究
菌种S-632是分离自中国山东省土样中的一个菌种，依据国际放线菌属研究会标准(ISP)和Waksman所用方法确定其形态学和生理学特征。所有检测都是在27℃培养的前21d中进行的。
菌种S-632的气生菌丝呈开放式螺旋状。孢子呈圆柱型，直径为0.8～1.0μm，长度为1.1～1.2μm ，表面光滑或具皱褶。基内菌丝在大多数培养基中呈无色或淡黄棕色。气生菌丝首先呈白色，然后呈灰白色，最后呈淡棕色并带有黑色湿斑或吸水性孢子团块。在Bennett's琼脂培养基中可见亮黄色色素产生，其他培养基中未见可溶性色素产生。培养特征详见文献[3]。
于其伟等[4]报道了其生理学性质，在酪氨酸培养基和蛋白胨-酵母浸膏-铁培养基中未见类黑素产生。最适生长温度的检测使用的是酵母浸膏-麦芽抽提物培养基，表明其最适生长温度范围为27℃～30℃。淀粉水解、牛奶的凝固和胨化、硫化氢的产生及亚硝酸盐的还原都呈阳性反应。
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对菌种S-632细胞壁进行化学分析，表明有LL-二氨基庚二酸的存在。全细胞糖分析后未见特异性糖。
在ISP-9号培养基上菌种S-632可以利用多种碳源，但比较适合的碳源是D-葡萄糖(阳性对照)和水杨苷，在以纤维素为碳源和无碳源基本培养基(阴性对照)上长势不好。在Isp No.3，No.4，No.5,葡萄糖天门冬素琼脂和高氏一号琼脂上有明显的吸水特征[4]。
由以上结果来看，菌种S-632应属链霉菌属。根据文献[4，5]，该菌种气生菌丝呈潮湿并形成深色吸水团块，孢子表面光滑或具皱褶，电镜下其外型具疣甚至是刺状，表明菌种S-632为吸水链霉菌(Streptomyces.hygroscopicus)。将该菌种与已知的吸水链霉菌比较，结果见文献[4]，也表明该菌种属吸水链霉菌。
2 S-632的发酵
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2.1 菌种的保藏 菌种S-632保存于冻干管中，实验过程中可以保存于沙土管或甘油管中，打开冻干管后，接种于斜面培养基上，待斜面长好之后，再转移至沙土管或甘油管中，甘油管是刮取斜面上的 S-632的孢子使之悬浮于2ml含10%甘油的小管中，于-20℃保存。如有需要，甘油管可直接接种于种子培养基而进行发酵。
2.2 培养基 ①斜面培养基：KNO3 0.1%,K2HPO4 0.05%,MgSO4 0.05%,NaCl 0.05%,FeSO4 0.001%,可溶性淀粉2%，琼脂1.5%，pH为 7.2～7.4。10磅高压灭菌。②种子培养基：甘油4.0%，葡萄糖0.2%，土豆淀粉0.2%，热榨黄豆饼粉2.0%，全血胨0.5%，干酵母0.5%，NaCl 0.5%,CaCO3 0.2%,pH为7.0。15磅高压灭菌。③发酵培养基：甘油3.0%，葡萄糖0.2%，土豆淀粉0.2%，热榨黄豆饼粉2.0%,全血胨0.3%，干酵母0.5%，NaCl 0.3%,pH为6.4。15磅高压灭菌。
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2.3 发酵流程 S-632菌株接种于斜面培养基(Gause No.1)上，经28℃10d培养，转种于种子培养基(接种量为5%)，旋转摇床27℃，3d，再转种于发酵培养基(接种量仍为5%)，27℃，5～6d。经生物检测后或根据pH的变化而决定何时下发酵。
2.4 发酵液的生物检测 S-632的发酵一般采用纸片法测定其活性，纸片直径为10mm，因为S-632的发酵液抗酵母活性较强，故多采用清酒酵母(Saccharomyces.cerevisiae No.30)为检定菌，37℃培养24h后观察抑菌圈的大小。是小莉等[6]认为S-632发酵液的抗酵母活性和其HL-60细胞分化诱导活性存在平行关系。抗生素S-632-A,S-632-B等均以清酒酵母为检定菌发酵而来。
3 发酵液中的戊二酰亚胺类抗生素
菌种S-632的发酵液成分复杂，其中的戊二酰亚胺类抗生素到目前为止共报道2类4种，即S-632-A和S-632-B。Urakawa等[7]于1993年发现的抗生素S-632-C并不是戊二酰亚胺类抗生素，而是一种新的抗真菌抗生素，只不过是由菌种S-632产生的罢了。下面分别就上述2类抗生素的分离提取、结构、理化性质、生物学活性加以说明。
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3.1 抗生素S-632-A 在这类抗生素中又分为2种，即S-632-A1,A2。还有一种新的抗生素最近被发现，详细内容有待发表。它们都是发酵液经乙酸乙酯萃取而来，并且结构上有些相近，它们的分子式如下：
3.1.1 分离流程 发酵液经抽滤得上清液，滤液用Diaion HP-20大孔吸附树脂(树脂用量为5%，v/v)， HP-20柱经去离子水洗涤后用50%丙酮洗脱，洗脱液经生物检测后合并具活性的洗脱液，减压除去丙酮，室温通风橱内过夜除去剩余丙酮，调pH为7.6，乙酸乙酯抽提2次，合并乙酸乙酯相，无水Na2SO4脱水，减压除去乙酸乙酯得到淡黄色油状物(粗品)。粗品经硅胶G柱层析(展开液为氯仿∶丙酮为4∶1)后分成两个活性组分A,B。A组分经减压浓缩除去溶剂，得到淡黄色油状物，进一步经SephadexLH-20 柱层析(展开液为甲醇)，具活性部分减压除去甲醇得淡黄色物质，该物经C18反向中压柱层析(展开剂为38%的甲醇)，洗脱液经HPLC检测、生物检测，即可分离出S-632-A1,A2(单峰)。
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3.1.2 结构鉴定 Becker等[2]于1976年就已经确定了S-632-A1,A2的结构，二者的结构都存在一个戊二酰亚胺环并且3’位上取代基团只差一个甲基。其立体结构的决定主要取决于6，8双烯系统和2位碳及5位碳的手性结构。Becker等通过1，3双烯模型和CD 谱等方法确定S-632-A1,A2的立体结构为(2R,5S,6E)-结构和(2R,5S,6E,8Z)-结构。S-632-A1,A2的具体结构鉴定详见文献[2]。
3.1.3 抗生素S-632-A1,A2的理化性质 这2种抗生素分子结构上虽然相差不大，其分子式相差一个甲基，但其理化性质存在一些差别，S-632-A1的外观是无色粉末，而S-632-A2却是淡黄色油状物，S-632-A1在25℃时的比旋光度为+238°(c 0.5 氯仿)，S-632-A2在28℃时为+144°(c 0.1 氯仿)。S-632-A1在232，291nm处有最大吸收峰，S-632-A2在233.6，288nm处有最大吸收值。其红外吸收峰S-632-A1出现在3 575，3 425，1 710/cm处,而S-632-A2则出现在3 420，3 200，1 720/cm处。
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3.1.4 抗生素S-632-A1,A2的生物学性质 Kohberger等[1]于1959年报道了链霉戊二酰亚胺(streptimidone)即S-632-A1的生物学活性，该抗生素具有抗酵母、真菌、原虫的活性。Noriyuki Saito等[8]1974年报道了S-632-A2(9-methylstreptimidone)的生物学性质，该抗生素抗细菌和真菌的活性很低，但有抗酵母活性，用琼脂平板方法S-632-A2可以抑制一些组织细胞的生长，象HeLa S3细胞、兔肾细胞等，应用同样方法S-632-A2可抑制脊髓灰质炎病毒在HeLa细胞上的斑点形成，可抑制鸡胚纤维原细胞上水疱性口炎病毒(VSV)和新城疫病毒(NDV)。现有学者证明S-632-A可抑制柯萨奇病毒的表达(有待发表)。使用小鼠(dd种)测其LD50为280mg/kg(ip),210mg/kg(iv)。是小莉等[6]发现A组分的混合物S-632-A具有诱导HL-60细胞分化的活性，许多戊二酰亚胺类抗生素具有诱导分化活性，例如acetoxycloheximide,cycloheximide[9],epiderstatin[10,11]都有转变ras-转化细胞形态的活性，但 Urakawa等发现的抗生素S-632-C(不是戊二酰亚胺类抗生素)也具有该活性，说明戊二酰亚胺环不是引起这种形态转变的关键结构[7]。
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3.2 抗生素S-632-B 此类抗生素又分2种S-632-B1,B2,是Otani等[12]于1989年分离鉴定，二者系立体异构体,其异构位置可能在2位碳或者是环氧环的绝对构型的差异，因为谱学数据表明二者6位双键都是E-构型，8，9位上的氢都是顺式取代，5位碳的构型都为S-构型。具体二者之间的手性差异还有待于进一步研究。它们的分子式如下：
3.2.1 分离流程 发酵液如前所述分成A,B两个活性部分，其中B组分减压除去溶剂后得到淡黄色油状物，将该物溶于乙腈-水中，不溶物离心除去,上清液经ODS柱层析(50cm×1.5cm,MM1515,Ymazen Co.)，洗脱液乙腈∶水为20∶80,HPLC检测单峰的活性部分合并后减压除去有机溶剂冷冻干燥而分离得到此2种抗生素。
3.2.2 结构鉴定 S-632-B1,B2的紫外最大吸收出现在206～207nm和280～282nm处，在232nm处无最大吸收表明其分子中没有共轭双烯，其碳谱数据表明8，9位出现2个次甲基碳而不是S-632-A2分子中的2个烯碳，这2个碳的化学位移和它们较大的碳-氢耦合常数(172～180Hz)都表明存在一个环氧环。此外氢谱数据也表明8位上是环氧基[12]。但碳谱和氢谱数据都表明二者无明显区别，可是二者在HPLC保留时间上有差异，谱学数据表明二者5，6，8，9位的立体结构都相同，所以二者之间的区别可能在2位上或环氧环的绝对构型上。
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3.2.3 抗生素S-632-B1,B2的理化性质 由于二者系同分异构体，故这2种抗生素的理化性质极其相似，首先二者在外观上都为淡黄色油状物，比旋光度在25℃时S-632-B1为+68°(c 1.0 ,氯仿)，S-632-B2为+73°(c 1.0,氯仿)。其分子式都为C17H25NO5。紫外吸收S-632-B1出现在206，282nm处，而S-632-B2出现在207，280 nm处。红外吸收S-632-B1,B2则分别出现在3 490，2 915，1 710，1 697/cm和3 350，2 970，2 920，1 725 /cm处。
3.2.4 抗生素S-632-B1,B2的生物学性质 抗生素S-632-B1,B2都显示出对Saccharomyces sp.较强活性，但是对丝状真菌，G+,G-菌均无活性，二者的抗真菌谱相似。其细胞毒活性是通过作图法测出其IC50为0.03,3μg/ml。S-632-B1注射入BDF1小鼠体内，80mg/kg对白血病P388未见抑制。其LD50大于80mg/kg(ip)。S-632-B1可以抑制[3H]-亮氨酸掺入5%TCA不溶物，表明蛋白合成是其作用靶点。抑制蛋白合成的作用这几种抗生素都有，但S-632-B1的活性最强。
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综上所述，对菌种S-632的研究虽然取得了较大进展，但还有许多领域值得进行深入探讨，仅在其发酵液成分的复杂性上就有许多工作可做，到目前为止虽然我们在对其研究过程中发现了多种新抗生素，但其产生的多烯类抗生素S-632-D还没有被分离纯化。单就其产生的戊二酰亚胺类抗生素而言，也有许多方面有待我们进一步研究，S-632-A的诱导分化作用能否在肿瘤的治疗上有所突破，S-632-A2的抗酵母、抗病毒活性在农业、养殖业上的应用也有待于我们进一步研究。
参考文献
1，Kohberger DL , Fisher MW,Galbraith MW,et al .Biological studies of streptimidone, a new antibiotic. Antibiot Chemoth, 1959, 10∶9
2，Becker AM ， Rickards RW.The absolute configuration of the glutarimide antibiotics streptimidone and 9-methlstreptimidone. Helv Chim Acta, 1976, 59∶2393
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3，Otani T,QW Yu.New glutarimide antibiotics,S-632-B1 and B2 Ⅰ.Taxonomy of producing strain,fermentation and biological properties.J Antibiotics ,1989, 42∶647
4，于其伟，范翠敏.链霉菌产生的新抗癌抗生素S632分化诱导研究 Ⅰ.产生菌的分类鉴定.中国学术期刊文摘，1998，10(4)∶1268
5，Williams ST, Wellington EMH. Micromorphology and fine structure of actinomycetes.In ： Goodfellow M，Board RG eds.Microbial Classification and Identification. New York:Academic Press, 1980.139～165
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6，是小莉，于其伟，李电东.戊二酰亚胺类抗生素S632对人早幼粒白血病细胞HL-60的分化诱导作用.中国肿瘤临床，1995，22(增刊)∶57
7，Urakawa A,Otani T，Yoshida Ken-ichro. Isolation,stucture determination and biological activities of a novel antifungal antibiotic,S-632-C,closely related to glutarimide antibiotics.J Antibiotics,1993，46∶1827
8，Saito N,Kitame F,Kikuchi M,et al. Studies on a new antiviral antibiotic, 9-methylstreptimidone.J Antibiotics,1974, 27∶206
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9，Ogawara H ，Hasumi Y,Higashi K, et al. Acetoxycycloheximide and cycloheximide convert transformed morphology of ras-transformed cells to normal morphology.J Antibiotics, 1989,42∶1530
10，Sonoda T,Osada H, Uramoto M, et al. Epiderstatin, a new inhibitor of the mitogenic activity induced by epidermal growth factor.Ⅱ Structure elucidation. J Antibiotics，1989，42∶1607
11，Osada H,Sasaki M, Sonoda T . Epiderstatin induces the flat reversion of nrk cells transformed by temperature-sensitive rous sarcoma virus. Biosci Biotech Biochem，1992， 56∶1801
12，Otani T, ZX Lou， QW Yu，et al. New glutarimide antibiotics ,S-632-B1 and B2.Ⅱ. Isolation,physico-chemical properties and chemical stucture. J Antibiotics， 1989，42∶654
收稿：1999-11-30
修回：2000-02-15, http://www.100md.com
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 医药生物技术研究所，北京 100050
关键词：戊二酰亚胺类抗生素；发酵；分离提取；结构鉴定
中国新药杂志000505 摘要 综述了戊二酰亚胺类抗生素产生菌S-632的分类鉴定，发酵流程及其产生的戊二酰亚胺抗生素S-632-A,B的分离提取，结构鉴定，理化性质及生物学活性的研究。
PROGRESS ON RESEARCH OF GLUTARIMIDE ANTIBIOTICS S-632 FAMILY
Liu Qiongyan Li Diandong
(Institute of Medical Biotechnology,Chinese Union Medical
, http://www.100md.com
University,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100050)
ABSTRACT Studies on the tantonomy of strain from which glutarimide antibiotics S-632 were produced,the fermentation and isolation processes of glutarimide antibiotics,S-632-A,B;their structure elucidation,physical and chemical properties,and bioactivity were reviewed.
KEY WORDS Glutarimide antibiotics;Fermentation;Isolation;Structure elucidation
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在筛选新抗生素过程中，我所从山东省的土样中筛选出具有抗Saccharomyces.cereisiae 的菌株S-632。根据分类学研究命名其为吸水链霉菌(Streptomyces.hygroscopicus)，其发酵液成分极其复杂，就其产生的戊二酰亚胺类抗生素而言有4种，分别为S-632-A1,A2,S-632-B1,B2,其中S-632-A1是1959年Kohberger等[1]发现并定名为链霉戊二酰亚胺(steptimidone)。S-632-A2是1974年Noriyuki Saito等发现的一种抗病毒抗生素，产生菌为链霉菌S-885(Streptomyces sp.S-885)。该抗生素定名为9-甲基链霉戊二酰亚胺(9-methylstreptimidone)。这2种抗生素绝对构型的确定是1976年由 Becker等[2]完成，后来由于菌种S-632的出现并产生该2种抗生素，才开始称为S-632-A1,A2。此外在发酵早期还有聚醚类抗生素灰争霉素产生，该抗生素随后分解。发酵液中除戊二酰亚胺类外还有多烯类抗生素S-632-D的存在以及核苷类抗生素巴梭霉素(sparsomycin)和S-去氧-巴梭霉素(S-deoxy-sparsomycin)。因此对菌种S-632的深入研究，对更有效地寻找新的抗生素，特别是新戊二酰亚胺类抗生素有重要意义。
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1 S-632的分类学研究
菌种S-632是分离自中国山东省土样中的一个菌种，依据国际放线菌属研究会标准(ISP)和Waksman所用方法确定其形态学和生理学特征。所有检测都是在27℃培养的前21d中进行的。
菌种S-632的气生菌丝呈开放式螺旋状。孢子呈圆柱型，直径为0.8～1.0μm，长度为1.1～1.2μm ，表面光滑或具皱褶。基内菌丝在大多数培养基中呈无色或淡黄棕色。气生菌丝首先呈白色，然后呈灰白色，最后呈淡棕色并带有黑色湿斑或吸水性孢子团块。在Bennett's琼脂培养基中可见亮黄色色素产生，其他培养基中未见可溶性色素产生。培养特征详见文献[3]。
于其伟等[4]报道了其生理学性质，在酪氨酸培养基和蛋白胨-酵母浸膏-铁培养基中未见类黑素产生。最适生长温度的检测使用的是酵母浸膏-麦芽抽提物培养基，表明其最适生长温度范围为27℃～30℃。淀粉水解、牛奶的凝固和胨化、硫化氢的产生及亚硝酸盐的还原都呈阳性反应。
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对菌种S-632细胞壁进行化学分析，表明有LL-二氨基庚二酸的存在。全细胞糖分析后未见特异性糖。
在ISP-9号培养基上菌种S-632可以利用多种碳源，但比较适合的碳源是D-葡萄糖(阳性对照)和水杨苷，在以纤维素为碳源和无碳源基本培养基(阴性对照)上长势不好。在Isp No.3，No.4，No.5,葡萄糖天门冬素琼脂和高氏一号琼脂上有明显的吸水特征[4]。
由以上结果来看，菌种S-632应属链霉菌属。根据文献[4，5]，该菌种气生菌丝呈潮湿并形成深色吸水团块，孢子表面光滑或具皱褶，电镜下其外型具疣甚至是刺状，表明菌种S-632为吸水链霉菌(Streptomyces.hygroscopicus)。将该菌种与已知的吸水链霉菌比较，结果见文献[4]，也表明该菌种属吸水链霉菌。
2 S-632的发酵
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2.1 菌种的保藏 菌种S-632保存于冻干管中，实验过程中可以保存于沙土管或甘油管中，打开冻干管后，接种于斜面培养基上，待斜面长好之后，再转移至沙土管或甘油管中，甘油管是刮取斜面上的 S-632的孢子使之悬浮于2ml含10%甘油的小管中，于-20℃保存。如有需要，甘油管可直接接种于种子培养基而进行发酵。
2.2 培养基 ①斜面培养基：KNO3 0.1%,K2HPO4 0.05%,MgSO4 0.05%,NaCl 0.05%,FeSO4 0.001%,可溶性淀粉2%，琼脂1.5%，pH为 7.2～7.4。10磅高压灭菌。②种子培养基：甘油4.0%，葡萄糖0.2%，土豆淀粉0.2%，热榨黄豆饼粉2.0%，全血胨0.5%，干酵母0.5%，NaCl 0.5%,CaCO3 0.2%,pH为7.0。15磅高压灭菌。③发酵培养基：甘油3.0%，葡萄糖0.2%，土豆淀粉0.2%，热榨黄豆饼粉2.0%,全血胨0.3%，干酵母0.5%，NaCl 0.3%,pH为6.4。15磅高压灭菌。
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2.3 发酵流程 S-632菌株接种于斜面培养基(Gause No.1)上，经28℃10d培养，转种于种子培养基(接种量为5%)，旋转摇床27℃，3d，再转种于发酵培养基(接种量仍为5%)，27℃，5～6d。经生物检测后或根据pH的变化而决定何时下发酵。
2.4 发酵液的生物检测 S-632的发酵一般采用纸片法测定其活性，纸片直径为10mm，因为S-632的发酵液抗酵母活性较强，故多采用清酒酵母(Saccharomyces.cerevisiae No.30)为检定菌，37℃培养24h后观察抑菌圈的大小。是小莉等[6]认为S-632发酵液的抗酵母活性和其HL-60细胞分化诱导活性存在平行关系。抗生素S-632-A,S-632-B等均以清酒酵母为检定菌发酵而来。
3 发酵液中的戊二酰亚胺类抗生素
菌种S-632的发酵液成分复杂，其中的戊二酰亚胺类抗生素到目前为止共报道2类4种，即S-632-A和S-632-B。Urakawa等[7]于1993年发现的抗生素S-632-C并不是戊二酰亚胺类抗生素，而是一种新的抗真菌抗生素，只不过是由菌种S-632产生的罢了。下面分别就上述2类抗生素的分离提取、结构、理化性质、生物学活性加以说明。
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3.1 抗生素S-632-A 在这类抗生素中又分为2种，即S-632-A1,A2。还有一种新的抗生素最近被发现，详细内容有待发表。它们都是发酵液经乙酸乙酯萃取而来，并且结构上有些相近，它们的分子式如下：
3.1.1 分离流程 发酵液经抽滤得上清液，滤液用Diaion HP-20大孔吸附树脂(树脂用量为5%，v/v)， HP-20柱经去离子水洗涤后用50%丙酮洗脱，洗脱液经生物检测后合并具活性的洗脱液，减压除去丙酮，室温通风橱内过夜除去剩余丙酮，调pH为7.6，乙酸乙酯抽提2次，合并乙酸乙酯相，无水Na2SO4脱水，减压除去乙酸乙酯得到淡黄色油状物(粗品)。粗品经硅胶G柱层析(展开液为氯仿∶丙酮为4∶1)后分成两个活性组分A,B。A组分经减压浓缩除去溶剂，得到淡黄色油状物，进一步经SephadexLH-20 柱层析(展开液为甲醇)，具活性部分减压除去甲醇得淡黄色物质，该物经C18反向中压柱层析(展开剂为38%的甲醇)，洗脱液经HPLC检测、生物检测，即可分离出S-632-A1,A2(单峰)。
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3.1.2 结构鉴定 Becker等[2]于1976年就已经确定了S-632-A1,A2的结构，二者的结构都存在一个戊二酰亚胺环并且3’位上取代基团只差一个甲基。其立体结构的决定主要取决于6，8双烯系统和2位碳及5位碳的手性结构。Becker等通过1，3双烯模型和CD 谱等方法确定S-632-A1,A2的立体结构为(2R,5S,6E)-结构和(2R,5S,6E,8Z)-结构。S-632-A1,A2的具体结构鉴定详见文献[2]。
3.1.3 抗生素S-632-A1,A2的理化性质 这2种抗生素分子结构上虽然相差不大，其分子式相差一个甲基，但其理化性质存在一些差别，S-632-A1的外观是无色粉末，而S-632-A2却是淡黄色油状物，S-632-A1在25℃时的比旋光度为+238°(c 0.5 氯仿)，S-632-A2在28℃时为+144°(c 0.1 氯仿)。S-632-A1在232，291nm处有最大吸收峰，S-632-A2在233.6，288nm处有最大吸收值。其红外吸收峰S-632-A1出现在3 575，3 425，1 710/cm处,而S-632-A2则出现在3 420，3 200，1 720/cm处。
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3.1.4 抗生素S-632-A1,A2的生物学性质 Kohberger等[1]于1959年报道了链霉戊二酰亚胺(streptimidone)即S-632-A1的生物学活性，该抗生素具有抗酵母、真菌、原虫的活性。Noriyuki Saito等[8]1974年报道了S-632-A2(9-methylstreptimidone)的生物学性质，该抗生素抗细菌和真菌的活性很低，但有抗酵母活性，用琼脂平板方法S-632-A2可以抑制一些组织细胞的生长，象HeLa S3细胞、兔肾细胞等，应用同样方法S-632-A2可抑制脊髓灰质炎病毒在HeLa细胞上的斑点形成，可抑制鸡胚纤维原细胞上水疱性口炎病毒(VSV)和新城疫病毒(NDV)。现有学者证明S-632-A可抑制柯萨奇病毒的表达(有待发表)。使用小鼠(dd种)测其LD50为280mg/kg(ip),210mg/kg(iv)。是小莉等[6]发现A组分的混合物S-632-A具有诱导HL-60细胞分化的活性，许多戊二酰亚胺类抗生素具有诱导分化活性，例如acetoxycloheximide,cycloheximide[9],epiderstatin[10,11]都有转变ras-转化细胞形态的活性，但 Urakawa等发现的抗生素S-632-C(不是戊二酰亚胺类抗生素)也具有该活性，说明戊二酰亚胺环不是引起这种形态转变的关键结构[7]。
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3.2 抗生素S-632-B 此类抗生素又分2种S-632-B1,B2,是Otani等[12]于1989年分离鉴定，二者系立体异构体,其异构位置可能在2位碳或者是环氧环的绝对构型的差异，因为谱学数据表明二者6位双键都是E-构型，8，9位上的氢都是顺式取代，5位碳的构型都为S-构型。具体二者之间的手性差异还有待于进一步研究。它们的分子式如下：
3.2.1 分离流程 发酵液如前所述分成A,B两个活性部分，其中B组分减压除去溶剂后得到淡黄色油状物，将该物溶于乙腈-水中，不溶物离心除去,上清液经ODS柱层析(50cm×1.5cm,MM1515,Ymazen Co.)，洗脱液乙腈∶水为20∶80,HPLC检测单峰的活性部分合并后减压除去有机溶剂冷冻干燥而分离得到此2种抗生素。
3.2.2 结构鉴定 S-632-B1,B2的紫外最大吸收出现在206～207nm和280～282nm处，在232nm处无最大吸收表明其分子中没有共轭双烯，其碳谱数据表明8，9位出现2个次甲基碳而不是S-632-A2分子中的2个烯碳，这2个碳的化学位移和它们较大的碳-氢耦合常数(172～180Hz)都表明存在一个环氧环。此外氢谱数据也表明8位上是环氧基[12]。但碳谱和氢谱数据都表明二者无明显区别，可是二者在HPLC保留时间上有差异，谱学数据表明二者5，6，8，9位的立体结构都相同，所以二者之间的区别可能在2位上或环氧环的绝对构型上。
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3.2.3 抗生素S-632-B1,B2的理化性质 由于二者系同分异构体，故这2种抗生素的理化性质极其相似，首先二者在外观上都为淡黄色油状物，比旋光度在25℃时S-632-B1为+68°(c 1.0 ,氯仿)，S-632-B2为+73°(c 1.0,氯仿)。其分子式都为C17H25NO5。紫外吸收S-632-B1出现在206，282nm处，而S-632-B2出现在207，280 nm处。红外吸收S-632-B1,B2则分别出现在3 490，2 915，1 710，1 697/cm和3 350，2 970，2 920，1 725 /cm处。
3.2.4 抗生素S-632-B1,B2的生物学性质 抗生素S-632-B1,B2都显示出对Saccharomyces sp.较强活性，但是对丝状真菌，G+,G-菌均无活性，二者的抗真菌谱相似。其细胞毒活性是通过作图法测出其IC50为0.03,3μg/ml。S-632-B1注射入BDF1小鼠体内，80mg/kg对白血病P388未见抑制。其LD50大于80mg/kg(ip)。S-632-B1可以抑制[3H]-亮氨酸掺入5%TCA不溶物，表明蛋白合成是其作用靶点。抑制蛋白合成的作用这几种抗生素都有，但S-632-B1的活性最强。
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综上所述，对菌种S-632的研究虽然取得了较大进展，但还有许多领域值得进行深入探讨，仅在其发酵液成分的复杂性上就有许多工作可做，到目前为止虽然我们在对其研究过程中发现了多种新抗生素，但其产生的多烯类抗生素S-632-D还没有被分离纯化。单就其产生的戊二酰亚胺类抗生素而言，也有许多方面有待我们进一步研究，S-632-A的诱导分化作用能否在肿瘤的治疗上有所突破，S-632-A2的抗酵母、抗病毒活性在农业、养殖业上的应用也有待于我们进一步研究。
参考文献
1，Kohberger DL , Fisher MW,Galbraith MW,et al .Biological studies of streptimidone, a new antibiotic. Antibiot Chemoth, 1959, 10∶9
2，Becker AM ， Rickards RW.The absolute configuration of the glutarimide antibiotics streptimidone and 9-methlstreptimidone. Helv Chim Acta, 1976, 59∶2393
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3，Otani T,QW Yu.New glutarimide antibiotics,S-632-B1 and B2 Ⅰ.Taxonomy of producing strain,fermentation and biological properties.J Antibiotics ,1989, 42∶647
4，于其伟，范翠敏.链霉菌产生的新抗癌抗生素S632分化诱导研究 Ⅰ.产生菌的分类鉴定.中国学术期刊文摘，1998，10(4)∶1268
5，Williams ST, Wellington EMH. Micromorphology and fine structure of actinomycetes.In ： Goodfellow M，Board RG eds.Microbial Classification and Identification. New York:Academic Press, 1980.139～165
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6，是小莉，于其伟，李电东.戊二酰亚胺类抗生素S632对人早幼粒白血病细胞HL-60的分化诱导作用.中国肿瘤临床，1995，22(增刊)∶57
7，Urakawa A,Otani T，Yoshida Ken-ichro. Isolation,stucture determination and biological activities of a novel antifungal antibiotic,S-632-C,closely related to glutarimide antibiotics.J Antibiotics,1993，46∶1827
8，Saito N,Kitame F,Kikuchi M,et al. Studies on a new antiviral antibiotic, 9-methylstreptimidone.J Antibiotics,1974, 27∶206
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9，Ogawara H ，Hasumi Y,Higashi K, et al. Acetoxycycloheximide and cycloheximide convert transformed morphology of ras-transformed cells to normal morphology.J Antibiotics, 1989,42∶1530
10，Sonoda T,Osada H, Uramoto M, et al. Epiderstatin, a new inhibitor of the mitogenic activity induced by epidermal growth factor.Ⅱ Structure elucidation. J Antibiotics，1989，42∶1607
11，Osada H,Sasaki M, Sonoda T . Epiderstatin induces the flat reversion of nrk cells transformed by temperature-sensitive rous sarcoma virus. Biosci Biotech Biochem，1992， 56∶1801
12，Otani T, ZX Lou， QW Yu，et al. New glutarimide antibiotics ,S-632-B1 and B2.Ⅱ. Isolation,physico-chemical properties and chemical stucture. J Antibiotics， 1989，42∶654
收稿：1999-11-30
修回：2000-02-15, http://www.100md.com