蒸发光散射检测器在环磷酰胺质量控制中的应用
作者：冯芳 马永建 蒋蕾 张正行 安登魁
单位：马永建(江苏省卫生防疫站，南京 210009)；冯芳 蒋蕾(中国药科大学药物分析教研室,南京 210009)；张正行 安登魁(中国药科大学药物分析教研室,南京 210009)
关键词：蒸发光散射检测器；反相高效液相色谱法；环磷酰胺及其分解产物
中国新药杂志000509 摘要 目的：考察蒸发光散射检测器(ELSD)在低熔点、小分子药物环磷酰胺质量控制中的应用。方法：采用 HPLC-ELSD法，Nucleosil C18 柱；甲醇-水为流动相。结果：简单、价廉的甲醇-水流动相体系即可分离并同时测定环磷酰胺及其分解产物，环磷酰胺的线性范围为1～10μɡ，回收率为99.62%，99.05%，100.02%，RSD分别是1.67%，2.13%，2.04%。结论：ELSD用于无生色团药物的质量控制，可克服UVD短波末端测定时存在的弊端。
, 百拇医药
APPLICATION OF EVAPORATIVE LIGHT-SCATTERING DETECTOR
IN THE QUALITY CONTROL OF CYCLOPHOSPHAMIDE
Feng Fang Ma Yongjian Jiang Lei
(Department of Pharmaceutical Analysis, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009)
ABSTRACT OBJECTIVE： Evaporative light-scattering detector (ELSD) was used in quality control of compound of small molecule and low melting point, cyclophosphamide, for the first time. METHODS： A HPLC method is adopted using a Nucleosil C18 column (5μm, 250mm×4.6mm), a ELSD detector and a mobile phase of methanol∶H2O=8∶2.RESULTS： Cyclophosphamide and its decomposition product can be simultaneously determined by the method. The linear range; recoveries; and RSD for cyclophosphamide were 1～10g; 99.6%, 99.05%, 100.02%; and 1.67%, 2.13%, 2.04% respectively. CONCLUSION： In determination of drugs without chromophore, UV detector has a lot of problems in the end of short wave, and these questions could be overcome by using ELSD.
, 百拇医药
KEY WORDS Evaporative light-scattering detector; HPLC; Cyclophosphamide and its decomposition
环磷酰胺是一种氮芥类化合物，用于淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤等多种疾病的治疗。该化合物稳定性差，受潮、受热易变质，失去生物活性[1]。目前，环磷酰胺分析有质谱法[2]、气-液色谱法[3]、反相高效液相色谱(RP-HPLC)法[4～7]。其中HPLC采用紫外短波末端(195～205nm)测定，灵敏度低，同时需用色谱纯乙腈作为流动相成分；此外，共存杂质的吸收系数不同，要准确反映环磷酰胺的纯度，必须有相应的标准品，采用面积归一化法显然不合适[4，5]。蒸发光散射检测器(ELSD)是一种新型广谱质量型检测器，具有对不同物质响应因子几乎相同，且可使用甲醇等在短波末端有吸收的有机改性剂等特点[8]，但其在低熔点、小分子化合物测定中的应用却很少见有报道。本实验首次采用HPLC-ELSD法，简便的甲醇-水体系，同时分离、分析了环磷酰胺及其分解产物。为了更好了解环磷酰胺的稳定性，本实验还对环磷酰胺在不同溶剂、不同温度下的分解情况进行了考察。
, 百拇医药
材料与方法
1 仪器与试剂
Waters Model 510 高效液相色谱仪; ELSD 500检测器(Alltech); 杭州英谱色谱工作站; 甲醇(分析纯，江苏淮阴塑料制品厂); 环磷酰胺对照品(江苏省药检所);注射用环磷酰胺(连云港恒瑞制药有限公司); 重蒸水(自制)。
2 色谱条件
色谱柱：Nucleosil C18(250mm×4.6mm)；柱温：室温； 流动相:甲醇-水(8∶2)； 流速：0.7ml/min；漂移管温度：80℃；气体流速：2.20 SLPM(标准升)。
结 果
1 线性关系考察
, 百拇医药
取环磷酰胺对照品约50mg,精密称定，置于100ml量瓶中，甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀,制得标准储备溶液；精密量取此液1.0,3.0,5.0，7.0，10.0ml，分置于不同的10ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，离心(3 000 r/min)，即制得环磷酰胺标准溶液系列。取上述标准溶液各20μl，进样，记录峰面积A。以A的对数值为纵坐标(Y)，环磷酰胺浓度的对数值为横坐标(X)，进行线性回归，得回归方程为：Y =1.52X+2.65,r=0.9992。线性范围：1～10μg。
2 回收率测定
精密称取已知含量的注射用环磷酰胺供试品约25mg,共3份，分别添加环磷酰胺对照品各15,25及35mg，按上述方法制备储备溶液。精密量取此3种储备液各 5.0ml于3个10ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀 ，离心(3 000 r/min)。取各溶液20μl进样，记录峰面积A，重复3次，求得环磷酰胺回收率分别为99.62% ，99.05% , 100.02%,RSD分别为 1.67%,2.13%,2.04%。
, 百拇医药
3 精密度考察
间隔0，1，3，5，7h及1，2，3，4，5d，分别取环磷酰胺标准品约25.0mg,精密称定,置于100ml量瓶中,甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀，离心后进样, 平行测定5次,记录峰面积，计算日内、日间精密度,RSD分别为0.89%和1.23%。
4 方法灵敏度
配置不同浓度环磷酰胺溶液，进样分析，考察测定方法对环磷酰胺的检测灵敏度。结果显示：进样量0.15μɡ时, 信噪比3∶1。
5 含量测定
分别取注射用环磷酰胺及其出口产品30.0mg,精密称定,置于100ml量瓶中,甲醇溶解、稀释定容, 摇匀，离心后进样、分析,平行测定3次，结果见表1。按中国药典(1995年版)注射用环磷酰胺测定步骤操作、测定，所得结果见表1。
, 百拇医药
表1 含量测定结果(%)
(n=3) 样品
检测器类型
UV
ELSD
环 磷 酰 胺
99.3
99.2
99.5
99.6
99.0
98.8
环磷酰胺(出口)
, 百拇医药
99.5
99.6
99.7
99.4
99.6
99.5
6 样品稳定性考察
取环磷酰胺适量, 精密称定，水溶解、制成浓度约300μɡ/ml溶液。将此溶液分别置于40，50，80℃，恒温环境，再经0.5,1,2,3,5h时间间隔取样测定，考察不同温度、不同时间环磷酰胺分解情况，以分解百分率对时间作图，结果图1。
图1 环磷酰胺的稳定性
, http://www.100md.com
讨 论
检测器及流动相的选择：基于环磷酰胺易分解且分解产物的紫外吸收与之不同的特点，本实验采用蒸发光散射检测器进行检测。考察不同配比的甲醇-水流动相，发现甲醇-水=8∶2时，环磷酰胺与其分解产物能够完全分离, 且保留时间适宜，见图2，R>4。
1 分解产物 2 环磷酰胺
图2 环磷酰胺与其分解产物HPLC行为
检测器参数的选择：适当升高漂移管温度，可减少雾化气体用量。但温度>90℃时，环磷酰胺峰响应大大减小，甚至不出现信号。这可能与环磷酰胺熔点很低(41～45℃)且分子较小有关。温度为80℃，气体流速2.20SLPM时,信噪比最大。
样品稳定性：环磷酰胺在40℃ 和50℃潮湿环境中较稳定，而在80℃水中0.5h 即明显分解，提示其保存应低温、干燥。本实验还对比了样品在水中和甲醇中的稳定性, 结果显示甲醇中分解速度较水中慢,常温下可放置36h，因此测定时用甲醇作溶剂较好。但若采用紫外检测器，甲醇也出现色谱峰，且峰位与环磷酰胺分解产物峰不能达基线分离，影响分解产物的准确测定。
, 百拇医药
参考文献
1，中华人民共和国药典(1990)二部注释.环磷酰胺.北京：化学工业出版社，1990.311
2，Duncan JH, Covin OM. Mass spectrometric study of the distribution of cyclophosphamide in humans. Toxicol Appl Pharmacol， 1973,24∶317
3，关世侠,王东凯,张俊杰,等.用GC法测定环磷酰胺多相脂质体在大鼠血中的浓度.沈阳药学院学报，1993,10(2)∶123
4，Kensler TT,Behme RJ , Brooke D. High-performance liquid chromatographic analysis of cyclophosphamide. J Pharm Sci, 1979,68(2)∶172
, http://www.100md.com
5，朱耀华,陈桂良,赵蔚君,等.环磷酰胺的HPLC 测定.中国医药工业杂志，1994,25(11)∶514
6，高晓彦,陶钧,顾学裘.环磷酰胺的含量分析方法及其在环磷酰胺多相脂质体化学稳定性研究中的应用.药物分析杂志，1987, 7 (5)∶290
7，Burton LC, James CA. Rapid method for the determination of ifosfamide and CP in plasma by HPLC with solid-phase extration. J Chromatogr， 1988，431∶450
8，Cebolla VL, Membrado L, Vela J， et al. Evaporative Light-scattering detection in the quantitative analysis of semivolatile polycyclic aromatic compounds by high-performence liquid chromatography. J Chromatogr Sci， 1997，35∶141
收稿：1999-11-30
修回：2000-02-28, 百拇医药
单位：马永建(江苏省卫生防疫站，南京 210009)；冯芳 蒋蕾(中国药科大学药物分析教研室,南京 210009)；张正行 安登魁(中国药科大学药物分析教研室,南京 210009)
关键词：蒸发光散射检测器；反相高效液相色谱法；环磷酰胺及其分解产物
中国新药杂志000509 摘要 目的：考察蒸发光散射检测器(ELSD)在低熔点、小分子药物环磷酰胺质量控制中的应用。方法：采用 HPLC-ELSD法，Nucleosil C18 柱；甲醇-水为流动相。结果：简单、价廉的甲醇-水流动相体系即可分离并同时测定环磷酰胺及其分解产物，环磷酰胺的线性范围为1～10μɡ，回收率为99.62%，99.05%，100.02%，RSD分别是1.67%，2.13%，2.04%。结论：ELSD用于无生色团药物的质量控制，可克服UVD短波末端测定时存在的弊端。
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APPLICATION OF EVAPORATIVE LIGHT-SCATTERING DETECTOR
IN THE QUALITY CONTROL OF CYCLOPHOSPHAMIDE
Feng Fang Ma Yongjian Jiang Lei
(Department of Pharmaceutical Analysis, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009)
ABSTRACT OBJECTIVE： Evaporative light-scattering detector (ELSD) was used in quality control of compound of small molecule and low melting point, cyclophosphamide, for the first time. METHODS： A HPLC method is adopted using a Nucleosil C18 column (5μm, 250mm×4.6mm), a ELSD detector and a mobile phase of methanol∶H2O=8∶2.RESULTS： Cyclophosphamide and its decomposition product can be simultaneously determined by the method. The linear range; recoveries; and RSD for cyclophosphamide were 1～10g; 99.6%, 99.05%, 100.02%; and 1.67%, 2.13%, 2.04% respectively. CONCLUSION： In determination of drugs without chromophore, UV detector has a lot of problems in the end of short wave, and these questions could be overcome by using ELSD.
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KEY WORDS Evaporative light-scattering detector; HPLC; Cyclophosphamide and its decomposition
环磷酰胺是一种氮芥类化合物，用于淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤等多种疾病的治疗。该化合物稳定性差，受潮、受热易变质，失去生物活性[1]。目前，环磷酰胺分析有质谱法[2]、气-液色谱法[3]、反相高效液相色谱(RP-HPLC)法[4～7]。其中HPLC采用紫外短波末端(195～205nm)测定，灵敏度低，同时需用色谱纯乙腈作为流动相成分；此外，共存杂质的吸收系数不同，要准确反映环磷酰胺的纯度，必须有相应的标准品，采用面积归一化法显然不合适[4，5]。蒸发光散射检测器(ELSD)是一种新型广谱质量型检测器，具有对不同物质响应因子几乎相同，且可使用甲醇等在短波末端有吸收的有机改性剂等特点[8]，但其在低熔点、小分子化合物测定中的应用却很少见有报道。本实验首次采用HPLC-ELSD法，简便的甲醇-水体系，同时分离、分析了环磷酰胺及其分解产物。为了更好了解环磷酰胺的稳定性，本实验还对环磷酰胺在不同溶剂、不同温度下的分解情况进行了考察。
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材料与方法
1 仪器与试剂
Waters Model 510 高效液相色谱仪; ELSD 500检测器(Alltech); 杭州英谱色谱工作站; 甲醇(分析纯，江苏淮阴塑料制品厂); 环磷酰胺对照品(江苏省药检所);注射用环磷酰胺(连云港恒瑞制药有限公司); 重蒸水(自制)。
2 色谱条件
色谱柱：Nucleosil C18(250mm×4.6mm)；柱温：室温； 流动相:甲醇-水(8∶2)； 流速：0.7ml/min；漂移管温度：80℃；气体流速：2.20 SLPM(标准升)。
结 果
1 线性关系考察
, 百拇医药
取环磷酰胺对照品约50mg,精密称定，置于100ml量瓶中，甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀,制得标准储备溶液；精密量取此液1.0,3.0,5.0，7.0，10.0ml，分置于不同的10ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，离心(3 000 r/min)，即制得环磷酰胺标准溶液系列。取上述标准溶液各20μl，进样，记录峰面积A。以A的对数值为纵坐标(Y)，环磷酰胺浓度的对数值为横坐标(X)，进行线性回归，得回归方程为：Y =1.52X+2.65,r=0.9992。线性范围：1～10μg。
2 回收率测定
精密称取已知含量的注射用环磷酰胺供试品约25mg,共3份，分别添加环磷酰胺对照品各15,25及35mg，按上述方法制备储备溶液。精密量取此3种储备液各 5.0ml于3个10ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀 ，离心(3 000 r/min)。取各溶液20μl进样，记录峰面积A，重复3次，求得环磷酰胺回收率分别为99.62% ，99.05% , 100.02%,RSD分别为 1.67%,2.13%,2.04%。
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3 精密度考察
间隔0，1，3，5，7h及1，2，3，4，5d，分别取环磷酰胺标准品约25.0mg,精密称定,置于100ml量瓶中,甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀，离心后进样, 平行测定5次,记录峰面积，计算日内、日间精密度,RSD分别为0.89%和1.23%。
4 方法灵敏度
配置不同浓度环磷酰胺溶液，进样分析，考察测定方法对环磷酰胺的检测灵敏度。结果显示：进样量0.15μɡ时, 信噪比3∶1。
5 含量测定
分别取注射用环磷酰胺及其出口产品30.0mg,精密称定,置于100ml量瓶中,甲醇溶解、稀释定容, 摇匀，离心后进样、分析,平行测定3次，结果见表1。按中国药典(1995年版)注射用环磷酰胺测定步骤操作、测定，所得结果见表1。
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表1 含量测定结果(%)
(n=3) 样品
检测器类型
UV
ELSD
环 磷 酰 胺
99.3
99.2
99.5
99.6
99.0
98.8
环磷酰胺(出口)
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99.5
99.6
99.7
99.4
99.6
99.5
6 样品稳定性考察
取环磷酰胺适量, 精密称定，水溶解、制成浓度约300μɡ/ml溶液。将此溶液分别置于40，50，80℃，恒温环境，再经0.5,1,2,3,5h时间间隔取样测定，考察不同温度、不同时间环磷酰胺分解情况，以分解百分率对时间作图，结果图1。
图1 环磷酰胺的稳定性
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讨 论
检测器及流动相的选择：基于环磷酰胺易分解且分解产物的紫外吸收与之不同的特点，本实验采用蒸发光散射检测器进行检测。考察不同配比的甲醇-水流动相，发现甲醇-水=8∶2时，环磷酰胺与其分解产物能够完全分离, 且保留时间适宜，见图2，R>4。
1 分解产物 2 环磷酰胺
图2 环磷酰胺与其分解产物HPLC行为
检测器参数的选择：适当升高漂移管温度，可减少雾化气体用量。但温度>90℃时，环磷酰胺峰响应大大减小，甚至不出现信号。这可能与环磷酰胺熔点很低(41～45℃)且分子较小有关。温度为80℃，气体流速2.20SLPM时,信噪比最大。
样品稳定性：环磷酰胺在40℃ 和50℃潮湿环境中较稳定，而在80℃水中0.5h 即明显分解，提示其保存应低温、干燥。本实验还对比了样品在水中和甲醇中的稳定性, 结果显示甲醇中分解速度较水中慢,常温下可放置36h，因此测定时用甲醇作溶剂较好。但若采用紫外检测器，甲醇也出现色谱峰，且峰位与环磷酰胺分解产物峰不能达基线分离，影响分解产物的准确测定。
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参考文献
1，中华人民共和国药典(1990)二部注释.环磷酰胺.北京：化学工业出版社，1990.311
2，Duncan JH, Covin OM. Mass spectrometric study of the distribution of cyclophosphamide in humans. Toxicol Appl Pharmacol， 1973,24∶317
3，关世侠,王东凯,张俊杰,等.用GC法测定环磷酰胺多相脂质体在大鼠血中的浓度.沈阳药学院学报，1993,10(2)∶123
4，Kensler TT,Behme RJ , Brooke D. High-performance liquid chromatographic analysis of cyclophosphamide. J Pharm Sci, 1979,68(2)∶172
, http://www.100md.com
5，朱耀华,陈桂良,赵蔚君,等.环磷酰胺的HPLC 测定.中国医药工业杂志，1994,25(11)∶514
6，高晓彦,陶钧,顾学裘.环磷酰胺的含量分析方法及其在环磷酰胺多相脂质体化学稳定性研究中的应用.药物分析杂志，1987, 7 (5)∶290
7，Burton LC, James CA. Rapid method for the determination of ifosfamide and CP in plasma by HPLC with solid-phase extration. J Chromatogr， 1988，431∶450
8，Cebolla VL, Membrado L, Vela J， et al. Evaporative Light-scattering detection in the quantitative analysis of semivolatile polycyclic aromatic compounds by high-performence liquid chromatography. J Chromatogr Sci， 1997，35∶141
收稿：1999-11-30
修回：2000-02-28, 百拇医药