山莨菪碱及β-七叶皂苷钠对内毒素致伤HUVECs能量代谢的保护作用
作者：石富胜 狄桂萍 杨正国 罗向东 杨宗城
单位：石富胜 狄桂萍 杨正国(山西大同解放军322医院，大同 037006)；罗向东 杨宗城(重庆市西南医院烧伤科，重庆 400038)
关键词：内毒素；培养人脐静脉内皮细胞；山莨菪碱；β-七叶 皂苷钠；能荷
中国新药杂志001009 [摘要] 目的：探讨内毒素(LPS)致伤后培养人脐静 脉内皮细胞(HUVECs)能量代谢的变化及山莨菪碱、β-七叶皂苷钠干预后对HUVECs能量代谢 的影响。方法：建立体外培养的HUVECs模型，致伤因素为LPS；测定 指标为 ATP，ADP及能荷(EC)。结果：低浓度LPS能激活内皮细胞，随 刺激时间的延长，培养HUVEC的EC降低，用山莨菪碱、β-七叶皂苷钠治疗后各时相点能量 和明显增加，其中β-七叶皂苷钠治疗效果优于山莨菪碱。结论：LP S对体外培养的HUVEC能量代谢有直接损伤作用，β-七叶皂苷钠有一定的抗损伤作用，在能 量储备方面优于山莨菪碱。
, 百拇医药
[中图分类号]R971 [文献标识码]B
[文章编号]1003-3734(2000)10-0691-03
The protective effects of anisodamine and escin
on ener gy metabolism of HUVECs injured by endotoxin
SHI Fu-sheng
(Hospital,PLA Stationed at Datong City,Datong 037006,Chin a;)
DI Gui-ping
(Hospital,PLA Stationed at Datong City,Datong 037006,Chin a;)
, 百拇医药
YANG Zheng-guo
(Hospital,PLA Stationed at Datong City,Datong 037006,Chin a;)
LUO Xiang-dong
(Department of Burns,Southwest Hospital of Chongqing City,Chongqing 400038,China)
YANG Zong-cheng
(Department of Burns,Southwest Hospital of Chongqing City,Chongqing 400038,China)
[Abstract] Objectives：To study thc protective effects of aniso daminc or escin on energy metabolism in cultured HUVECs injured by endotoxin.[ WT HZ]Methods:The energy metabolism and ATP,ADP,and AMP in cultured HUVECs in ju red by endotoxin were measured.Results:The decrease in energy metaboli sm of HUVECs dependent on the concentration of endotoxin and the time of conta ct.Tr eated with anisodamine or escin the energy metabolism in the corresponding poin ts significantly increased and the increase for escin was better than that of a nisodamine.Conclusions:Endotoxin has direct injurious effects on energ y metabolism in cultured in vitro HUVEC and escin has definite anti-injurious e ffects of some extent,and it is better than anisodamine in energy storage.
, 百拇医药
[Key word] LPS； HUVECs； anisodamine； escin；energy charge
血管内皮细胞损伤在烧伤患者的脏器损害发生、发展中具有极重要的作用,而 且是导致缺血再灌注损伤、最终引起全身多脏器功能损害的重要原因。内毒素(LPS) 可直接 损伤血管内皮细胞，在中毒性休克 、全身多脏器功能不全的病理过程中发挥重要作用。因 此,如何针对烧伤后LPS对血管内皮细胞损伤的防治,对烧伤治疗具有非常重要的意义。研究 表明，山莨菪碱(ANI)对烧伤患者、血管内皮细胞有一定的保护作用[1]，但用量 及不良反应较大，因此，探索新的药物具有非常重要的意义。β-七叶皂苷钠(ESC)作为 一种植物药物成分，对损伤人脐静脉内皮细胞(HUVECs)有一定的治疗作用，但其机制尚不 清楚。本研究以LPS作为致伤因素，对比观察ANI及ESC对HUVECs损伤后能量代谢的影响。
材料与方法
, http://www.100md.com
1 主要试剂及仪器
HUVEC株ECV-304(美国ATCC公司)，M199细胞培养液、LPS(O55∶B5)、细胞培养瓶、96孔培 养板(美国Sigma公司)，胰蛋白酶DIFCO 1∶250(SANTA CRUZ公司)，荧光分光光度计(美国B eckman公司)，低温离心机Biofuge 28RS(Heraeus公司)，其他药品均为国产分析纯试剂 。
2 方法
2.1 内皮细胞培养 采用ECV-304 HUVEC株，细胞常规复苏后接种于75ml培养 瓶中传代，培养液M199含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素、2ml谷氨酰胺，每 48h更换培养液1次，培养24～48h，实验开始前将细胞接种于细胞培养板在无血清培养液中 培养24h，37℃ 5%CO2孵育箱中共同孵育。
, 百拇医药 2.2 实验细胞分组 将培养板中的细胞随机(计算机法)分 成正常对照组：细胞在无血清M199中培养；ANI对照组：无血清培养液中只加ANI(终浓度10 μg/ml)；ESC对照组：无血清培养液中只加ESC(终浓度10μg/ml)；LPS致伤组：无血清 培养液中加LPS(终浓度2.0μg/ml )；ANI治疗组：无血清培养液中加LPS的同时加入ANI( 终浓度分别为LPS 2.0μg/ml，ANI 10μg/ml)；ESC治疗组：无血清培养液同时加 LPS ，ESC(终浓度分别为LPS 2.0μg/ml ，ESC 10μg/ml)；致伤时间为0和12h药物治疗组分 别在相应时间加入ESC，37℃ 5%CO2孵育箱中共同孵育，最后收集培养上清液待测指标 。
3 观察指标
采用反相高效液相色谱分析法测定：细胞取自75 ml细胞培养瓶，常规消化后离心，置预冷 的玻璃匀浆器中加入10%高氯酸2ml，冰浴匀浆 ,4℃离心15 000×g，15min，取上清液0.5ml 加入K2CO360μl摇匀，4℃离心15 000×g，15min,取上清液上柱测定。Glison 高效液 相色谱分析仪工作条件：色谱柱Sephrisorb C10 250mm×4.6mm，流动相：50ml PBS ，pH6.5，检测器：UV260nm，流速1 ml /min，进样量20 ml ，根据ATP，ADP，AMP 标准曲线，通过色谱工作站软件计算标本ATP ，ADP，AMP含量(μmol/mg蛋白)；能荷(E C)按公式计算，EC=[ATP+0.5×ADP]/[ATP+ADP+AMP]。
, 百拇医药
4 统计分析
采用华西医科大学医学统计程序包PEMS进行样本均数t检验，结果用
± s表示。以P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有非常显著性差异，P> 0.05为无差异。
结 果
1 LPS刺激后HUVECs的EC变化及ANI，ESC的调节作用
见表1。同一浓度LPS 刺激后，随刺激时间延长HUVEC所测的EC降低，与正常比较12h后明显 降低；而用ESC治疗后各时相点EC明显增加，12h增加幅度较大。
表1 LPS刺激12h后HUVEC测得EC变化及ANI，ESC
的作用 (±s，n=6，μmol/mg蛋白) 致伤时间(h)
, 百拇医药
LPS
LPS+ANI
LPS+ESC
0
0.866±0.03
0.876±0.02
0.808±0.05
12
0.674±0.02a
0.738±0.02
0.81±0.03b
组内比较，a:P<0.05;与LPS，LPS+ANI组相比，b:P<0.05
, 百拇医药
2 ANI，ESC治疗后ATP，ADP，AMP的变化
见图1。LPS刺激后ATP，ADP降低，而AMP生成增加；LPS+ANI治疗后，ATP，ADP较LPS致伤组 升高，但低于正常对照组，而AMP生成明显增加，提示ATP的消耗增加；LPS+ESC治疗后ATP， ADP较LPS致伤组升高，几乎接近正常对照，而AMP生成明显减少，提示ATP的消耗减少。
图1 ANI，ESC治疗后ATP，ADP，AMP的变化
讨 论
1 LPS对内皮细胞的损伤机制：在严重烧伤或创伤中LPS比细菌更容易进 入血液循环，因此在烧伤早期即可以发现血中LPS增高。LPS进入机体后,造成机体损害的进 一步加剧。LPS是G-杆菌细胞壁上的脂多糖部分，它的生物效应主要靠脂多糖的类脂A部分 [1]。但烧伤后引起HUVECs损伤的机制十分复杂，LPS在这一损伤中的作用报道 却较 少。LPS通常通过直接或间接两条途径作用于血管内皮，造成细胞的过强反应，细胞出现形 态和功能改变。内毒素的间接损伤是指LPS通过与免疫细胞膜上的CD14结合，诱导免疫细胞 释放多种细胞因子和炎性介质，最后再影响HUVECs的通路；直接损伤是指LPS直接作用在HUV ECs 上而产生的损伤效应。多数学者承认其间接作用，其原因是到目前为止所有研究表明内 皮细胞不能表达LPS CD14受体，但有部分学者则认为,LPS受体并不一定是LPS作用的专一受 体。Pan等[2]在体外实验已经证明，LPS可以抑制体外培养的肺血管内皮细胞的谷 氨酰胺转运功能，这一步很类似于TNF等细胞因子。Cooper等[3]发现,A20基因产物 可以抑制脂多糖诱导的内皮细胞激活反应。在无其他因素的影响下，LPS可增加牛肺动脉内皮细胞对125Ⅰ标记的白蛋白的通透性[4]。本实验证明LPS在无血清 培养液中刺激HUVECs，其分泌功能、能量代谢发生异常，提示LPS对培养的内皮细胞有直 接的损伤作用。并且损伤与激活同时存在，低剂量、早期刺激(6h)HUVEC使之激活 ，大剂量、中长(12，24h)时间刺激则使之损伤，表现在同一浓度LPS(2.0 μg/mg) 刺激培养的HUVEC，不同时间HUVECs的EC随时间的延长而降低，刺激24h EC值降到最 低。而用ESC治疗后培养的HUVECs的EC明显增加，尤其用药早期其EC增加显著，几乎接近正常。
, 百拇医药
2 ANI，ESC治疗后培养HUVECs的EC值较LPS损伤组增加， 其中ESC治疗组ATP，ADP储备高于ANI组。提示在HUVECs的能量代谢方面，ESC的治疗作用 优于ANI。EC是含高能磷酸键的腺苷的比值,作为测定细胞高能磷酸状态的指标,可有效评估 组织细胞的能量储备状态.,机体生命活动都需要生物能量维持，由食物氧化生成的能量大多 以ATP形式储备,严重烧伤后体内能量消耗急剧增加，实质脏器由于血循环障碍和内皮细胞受 损以致能量代谢失常,能量储备不足而发生损害，提示LPS对培养HUVECs膜有直接的损伤作 用。而ESC治疗后膜损伤减轻，EC增加，说明ESC有膜稳定的作用。ESC是植物挲罗子苷提取 的有效成分，具报导ESC有一定的抗氧化功能[5]，在抗内毒素损伤方面报道较少。 由于ESC是一种新的植物药物成分，对其在医学上的药理作用及应用仍有待进一步研究。
基金项目：国家自然基金重点课题(编号3983 0400)
[作者简介]石富胜(1964-)，男，副主任医师。主要从事烧伤后 血管内皮细胞损伤的防治方面的研究。
, 百拇医药
[参考文献]
[1] 罗小风，梁光萍，罗向东，等.类脂A和内毒素对人肾小球内皮细胞线立体 脱氢酶活性的影响[J].第三军医大学学报，1999，21(4)∶253-255.
[2] Pan M,Wasa M,Ryan U,et al.Inhibition of pulmonary microvascular endo thelial glutamine transport by glucocorti-coids and endotoxin[J].J Patentr Enteral Natur，1995,(19)∶477-481.
[3] Cooper JT,Stroka DM ,Btostian C,et al.A20 blocks endothelial cell ac tivation through a NF-Kaooa-dependent mechanism[J].J Biol Chem,1996,271 ∶18068-18073.
[4] Meyrick BO，Ryan US，Brigham KL.Direct rffect of E.coli endothelial l ayer of intimal explants[J].Am J Pathol，1986，122∶140-151.
[5] 石富胜，罗向东，杨宗城，等. β-七叶皂苷钠治疗后烧伤病人血管内皮细胞及其 功能变化的临床研究[J].烧伤整形专集，1998，(2)∶56-57.
收稿：2000-01-18
修回：2000-04-06, http://www.100md.com
单位：石富胜 狄桂萍 杨正国(山西大同解放军322医院，大同 037006)；罗向东 杨宗城(重庆市西南医院烧伤科，重庆 400038)
关键词：内毒素；培养人脐静脉内皮细胞；山莨菪碱；β-七叶 皂苷钠；能荷
中国新药杂志001009 [摘要] 目的：探讨内毒素(LPS)致伤后培养人脐静 脉内皮细胞(HUVECs)能量代谢的变化及山莨菪碱、β-七叶皂苷钠干预后对HUVECs能量代谢 的影响。方法：建立体外培养的HUVECs模型，致伤因素为LPS；测定 指标为 ATP，ADP及能荷(EC)。结果：低浓度LPS能激活内皮细胞，随 刺激时间的延长，培养HUVEC的EC降低，用山莨菪碱、β-七叶皂苷钠治疗后各时相点能量 和明显增加，其中β-七叶皂苷钠治疗效果优于山莨菪碱。结论：LP S对体外培养的HUVEC能量代谢有直接损伤作用，β-七叶皂苷钠有一定的抗损伤作用，在能 量储备方面优于山莨菪碱。
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[中图分类号]R971 [文献标识码]B
[文章编号]1003-3734(2000)10-0691-03
The protective effects of anisodamine and escin
on ener gy metabolism of HUVECs injured by endotoxin
SHI Fu-sheng
(Hospital,PLA Stationed at Datong City,Datong 037006,Chin a;)
DI Gui-ping
(Hospital,PLA Stationed at Datong City,Datong 037006,Chin a;)
, 百拇医药
YANG Zheng-guo
(Hospital,PLA Stationed at Datong City,Datong 037006,Chin a;)
LUO Xiang-dong
(Department of Burns,Southwest Hospital of Chongqing City,Chongqing 400038,China)
YANG Zong-cheng
(Department of Burns,Southwest Hospital of Chongqing City,Chongqing 400038,China)
[Abstract] Objectives：To study thc protective effects of aniso daminc or escin on energy metabolism in cultured HUVECs injured by endotoxin.[ WT HZ]Methods:The energy metabolism and ATP,ADP,and AMP in cultured HUVECs in ju red by endotoxin were measured.Results:The decrease in energy metaboli sm of HUVECs dependent on the concentration of endotoxin and the time of conta ct.Tr eated with anisodamine or escin the energy metabolism in the corresponding poin ts significantly increased and the increase for escin was better than that of a nisodamine.Conclusions:Endotoxin has direct injurious effects on energ y metabolism in cultured in vitro HUVEC and escin has definite anti-injurious e ffects of some extent,and it is better than anisodamine in energy storage.
, 百拇医药
[Key word] LPS； HUVECs； anisodamine； escin；energy charge
血管内皮细胞损伤在烧伤患者的脏器损害发生、发展中具有极重要的作用,而 且是导致缺血再灌注损伤、最终引起全身多脏器功能损害的重要原因。内毒素(LPS) 可直接 损伤血管内皮细胞，在中毒性休克 、全身多脏器功能不全的病理过程中发挥重要作用。因 此,如何针对烧伤后LPS对血管内皮细胞损伤的防治,对烧伤治疗具有非常重要的意义。研究 表明，山莨菪碱(ANI)对烧伤患者、血管内皮细胞有一定的保护作用[1]，但用量 及不良反应较大，因此，探索新的药物具有非常重要的意义。β-七叶皂苷钠(ESC)作为 一种植物药物成分，对损伤人脐静脉内皮细胞(HUVECs)有一定的治疗作用，但其机制尚不 清楚。本研究以LPS作为致伤因素，对比观察ANI及ESC对HUVECs损伤后能量代谢的影响。
材料与方法
, http://www.100md.com
1 主要试剂及仪器
HUVEC株ECV-304(美国ATCC公司)，M199细胞培养液、LPS(O55∶B5)、细胞培养瓶、96孔培 养板(美国Sigma公司)，胰蛋白酶DIFCO 1∶250(SANTA CRUZ公司)，荧光分光光度计(美国B eckman公司)，低温离心机Biofuge 28RS(Heraeus公司)，其他药品均为国产分析纯试剂 。
2 方法
2.1 内皮细胞培养 采用ECV-304 HUVEC株，细胞常规复苏后接种于75ml培养 瓶中传代，培养液M199含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素、2ml谷氨酰胺，每 48h更换培养液1次，培养24～48h，实验开始前将细胞接种于细胞培养板在无血清培养液中 培养24h，37℃ 5%CO2孵育箱中共同孵育。
, 百拇医药 2.2 实验细胞分组 将培养板中的细胞随机(计算机法)分 成正常对照组：细胞在无血清M199中培养；ANI对照组：无血清培养液中只加ANI(终浓度10 μg/ml)；ESC对照组：无血清培养液中只加ESC(终浓度10μg/ml)；LPS致伤组：无血清 培养液中加LPS(终浓度2.0μg/ml )；ANI治疗组：无血清培养液中加LPS的同时加入ANI( 终浓度分别为LPS 2.0μg/ml，ANI 10μg/ml)；ESC治疗组：无血清培养液同时加 LPS ，ESC(终浓度分别为LPS 2.0μg/ml ，ESC 10μg/ml)；致伤时间为0和12h药物治疗组分 别在相应时间加入ESC，37℃ 5%CO2孵育箱中共同孵育，最后收集培养上清液待测指标 。
3 观察指标
采用反相高效液相色谱分析法测定：细胞取自75 ml细胞培养瓶，常规消化后离心，置预冷 的玻璃匀浆器中加入10%高氯酸2ml，冰浴匀浆 ,4℃离心15 000×g，15min，取上清液0.5ml 加入K2CO360μl摇匀，4℃离心15 000×g，15min,取上清液上柱测定。Glison 高效液 相色谱分析仪工作条件：色谱柱Sephrisorb C10 250mm×4.6mm，流动相：50ml PBS ，pH6.5，检测器：UV260nm，流速1 ml /min，进样量20 ml ，根据ATP，ADP，AMP 标准曲线，通过色谱工作站软件计算标本ATP ，ADP，AMP含量(μmol/mg蛋白)；能荷(E C)按公式计算，EC=[ATP+0.5×ADP]/[ATP+ADP+AMP]。
, 百拇医药
4 统计分析
采用华西医科大学医学统计程序包PEMS进行样本均数t检验，结果用
± s表示。以P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有非常显著性差异，P> 0.05为无差异。结 果
1 LPS刺激后HUVECs的EC变化及ANI，ESC的调节作用
见表1。同一浓度LPS 刺激后，随刺激时间延长HUVEC所测的EC降低，与正常比较12h后明显 降低；而用ESC治疗后各时相点EC明显增加，12h增加幅度较大。
表1 LPS刺激12h后HUVEC测得EC变化及ANI，ESC
的作用 (
±s，n=6，μmol/mg蛋白) 致伤时间(h), 百拇医药
LPS
LPS+ANI
LPS+ESC
0
0.866±0.03
0.876±0.02
0.808±0.05
12
0.674±0.02a
0.738±0.02
0.81±0.03b
组内比较，a:P<0.05;与LPS，LPS+ANI组相比，b:P<0.05
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2 ANI，ESC治疗后ATP，ADP，AMP的变化
见图1。LPS刺激后ATP，ADP降低，而AMP生成增加；LPS+ANI治疗后，ATP，ADP较LPS致伤组 升高，但低于正常对照组，而AMP生成明显增加，提示ATP的消耗增加；LPS+ESC治疗后ATP， ADP较LPS致伤组升高，几乎接近正常对照，而AMP生成明显减少，提示ATP的消耗减少。
图1 ANI，ESC治疗后ATP，ADP，AMP的变化
讨 论
1 LPS对内皮细胞的损伤机制：在严重烧伤或创伤中LPS比细菌更容易进 入血液循环，因此在烧伤早期即可以发现血中LPS增高。LPS进入机体后,造成机体损害的进 一步加剧。LPS是G-杆菌细胞壁上的脂多糖部分，它的生物效应主要靠脂多糖的类脂A部分 [1]。但烧伤后引起HUVECs损伤的机制十分复杂，LPS在这一损伤中的作用报道 却较 少。LPS通常通过直接或间接两条途径作用于血管内皮，造成细胞的过强反应，细胞出现形 态和功能改变。内毒素的间接损伤是指LPS通过与免疫细胞膜上的CD14结合，诱导免疫细胞 释放多种细胞因子和炎性介质，最后再影响HUVECs的通路；直接损伤是指LPS直接作用在HUV ECs 上而产生的损伤效应。多数学者承认其间接作用，其原因是到目前为止所有研究表明内 皮细胞不能表达LPS CD14受体，但有部分学者则认为,LPS受体并不一定是LPS作用的专一受 体。Pan等[2]在体外实验已经证明，LPS可以抑制体外培养的肺血管内皮细胞的谷 氨酰胺转运功能，这一步很类似于TNF等细胞因子。Cooper等[3]发现,A20基因产物 可以抑制脂多糖诱导的内皮细胞激活反应。在无其他因素的影响下，LPS可增加牛肺动脉内皮细胞对125Ⅰ标记的白蛋白的通透性[4]。本实验证明LPS在无血清 培养液中刺激HUVECs，其分泌功能、能量代谢发生异常，提示LPS对培养的内皮细胞有直 接的损伤作用。并且损伤与激活同时存在，低剂量、早期刺激(6h)HUVEC使之激活 ，大剂量、中长(12，24h)时间刺激则使之损伤，表现在同一浓度LPS(2.0 μg/mg) 刺激培养的HUVEC，不同时间HUVECs的EC随时间的延长而降低，刺激24h EC值降到最 低。而用ESC治疗后培养的HUVECs的EC明显增加，尤其用药早期其EC增加显著，几乎接近正常。
, 百拇医药
2 ANI，ESC治疗后培养HUVECs的EC值较LPS损伤组增加， 其中ESC治疗组ATP，ADP储备高于ANI组。提示在HUVECs的能量代谢方面，ESC的治疗作用 优于ANI。EC是含高能磷酸键的腺苷的比值,作为测定细胞高能磷酸状态的指标,可有效评估 组织细胞的能量储备状态.,机体生命活动都需要生物能量维持，由食物氧化生成的能量大多 以ATP形式储备,严重烧伤后体内能量消耗急剧增加，实质脏器由于血循环障碍和内皮细胞受 损以致能量代谢失常,能量储备不足而发生损害，提示LPS对培养HUVECs膜有直接的损伤作 用。而ESC治疗后膜损伤减轻，EC增加，说明ESC有膜稳定的作用。ESC是植物挲罗子苷提取 的有效成分，具报导ESC有一定的抗氧化功能[5]，在抗内毒素损伤方面报道较少。 由于ESC是一种新的植物药物成分，对其在医学上的药理作用及应用仍有待进一步研究。
基金项目：国家自然基金重点课题(编号3983 0400)
[作者简介]石富胜(1964-)，男，副主任医师。主要从事烧伤后 血管内皮细胞损伤的防治方面的研究。
, 百拇医药
[参考文献]
[1] 罗小风，梁光萍，罗向东，等.类脂A和内毒素对人肾小球内皮细胞线立体 脱氢酶活性的影响[J].第三军医大学学报，1999，21(4)∶253-255.
[2] Pan M,Wasa M,Ryan U,et al.Inhibition of pulmonary microvascular endo thelial glutamine transport by glucocorti-coids and endotoxin[J].J Patentr Enteral Natur，1995,(19)∶477-481.
[3] Cooper JT,Stroka DM ,Btostian C,et al.A20 blocks endothelial cell ac tivation through a NF-Kaooa-dependent mechanism[J].J Biol Chem,1996,271 ∶18068-18073.
[4] Meyrick BO，Ryan US，Brigham KL.Direct rffect of E.coli endothelial l ayer of intimal explants[J].Am J Pathol，1986，122∶140-151.
[5] 石富胜，罗向东，杨宗城，等. β-七叶皂苷钠治疗后烧伤病人血管内皮细胞及其 功能变化的临床研究[J].烧伤整形专集，1998，(2)∶56-57.
收稿：2000-01-18
修回：2000-04-06, http://www.100md.com