银杏外种皮多糖对人癌细胞株的抑制作用及与阿霉素的协同效应
作者：许爱华 陈华圣 褚澄 王兴旺 张洪泉
单位：褚澄(扬州大学医学院96级医学系，扬州 225001)；许爱华 陈华圣 王兴旺 张洪泉(扬州大学医学院，扬州 225001)
关键词：银杏外种皮多糖；阿霉素；人BEL-7404肝癌细胞株；人SGC-7901胃腺癌细胞株；人SPC-A-1肺腺癌细胞株
中国新药杂志001106 [摘要]目的：检测银杏外种皮多糖(GBEP)的抗癌活性。方法：采用噻唑蓝(MTT)比色法，观察GBEP单用及与阿霉素合用在体外对人BEL-7404肝癌细胞株、SGC-7901胃腺癌细胞株及SPC-A-1肺腺癌细胞株的抑制作用。结果：GBEP在10～320μg/ml剂量下，体外作用24～72h，对3种人癌细胞株皆具有抑制作用，其抑制率随剂量增加和时间延长而增加，而IC50则随作用时间延长而减小。GBEP在10～160μg/ml剂量下，与0.4和4.0μg/ml的阿霉素合用，可提高对3种人癌细胞的抑制率。结论：GBEP单用对3种人癌细胞株的抑制作用具有量效关系及时效关系；GBEP与阿霉素合用，对3种人癌细胞株的抑制作用具有协同效应。
, 百拇医药
[中图分类号]R282.71;R979.14 [文献标识码]B
[文章编号]1003-3734(2000)11-0753-03
The inhibitory effect of Ginkgo biloba endocarp polysaccharides (GBEP)on human cancer cell strains and its synergic effect in combination with adriamycin
XU Ai-hua,CHEN Hua-sheng,WANG Xing-wang,ZHANG Hong-quan
(Medical College of Yangzhou University,Yangzhou 225001,China)
, 百拇医药
ZHU Cheng
(Class 1996,Department of Medicine,Medical College of Yangzhou University,Yangzhou 225001,China)
[Abstract]Objective:To detect the in vitro anticancer activities of GBEP.Methods:The inhibitory effect of single GBEP and combined therapy with adriamycin on human cancer cell strains of BEL-7404(liver),SGC-7901(stomach),and SPC-A-1(lung)were observed by MTT colorimetic method.Results:All 3 human cancer cell strains were significantly inhibited by single GBEP in dose of 10～320μg/ml for 24～72 h.Its inhibitory rate increased with increase of dose and prolongation of treatment time and its IC50 decreased with increase of treatment time.The inhibitory rate on the 3 human cancer cell strains can be increased by GBEP in dose of 10～160 μg/ml plus adriamycin in doses of 0.4 and 4.0μg/ml.Conclusion:Single GBEP exhibited dose and time effect on 3 human cancer cell strains and exhibited synergic effect while combined with adriamycin.
, http://www.100md.com
[Key words]GBEP;adriamycin;human liver cancer cell line;human stomach cancer cell line;human lung cancer cell line
银杏外种皮多糖(Ginkgo biloba endocarp polysaccharides,GBEP)是从银杏树的果实(银杏，俗称白果)的外种皮中提得的活性多糖。经研究发现其具有抑制动物肿瘤及促进荷瘤动物免疫功能的作用[1,2]。本实验用噻唑蓝(MTT)法观察了GBEP对人肝癌、胃癌及肺癌细胞生长的抑制作用及与阿霉素的协同效应。
材料和方法
1 药物及试剂
GBEP系本室从成熟的新鲜银杏外种皮中提取而得，干燥后为灰白色粉末。体外实验时，将其灭菌后溶解于RPMI1640培养液中，调pH至中性后置4℃冰箱中备用。RPMI1640培养粉：美国Gibco公司产品。MTT：美国Sigma公司产品。小牛血清及胰蛋白酶(trypsin,1∶250)为华美生物工程公司产品。阿霉素为深圳万乐药业有限公司产品，批号：981102。双蒸水自制。其余试剂用国产分析纯。
, 百拇医药
2 人癌细胞株
BEL-7404肝癌细胞株、SGC-7901胃腺癌细胞株及SPC-A-1肺腺癌细胞株，皆购自中国科学院上海细胞生物学研究所。体外培养，每2～3天传代1次。
3 方法
3.1 对3种人癌细胞株的抑制作用 分别取对数生长期的3种癌细胞，用0.25%胰蛋白酶消化适当时间后，立即用Hank's液洗涤数次，再用含10%小牛血清RPMI1640培养液将3种细胞浓度皆调整为1×105/ml。向96孔培养板中分别加入上述细胞悬液100μl ，将培养板置于5%CO2、37℃孵箱中培养24h后取出，分别加入含不同浓度GBEP的RPMI1640培养液各100μl，每个浓度设3个复孔，对照孔加入等容积RPMI1640培养液，继续分别培养24，48及72h，其中每隔24h取出培养板，弃去上清液后重新加药1次。培养结束前4h从各孔中吸出100μl上清液弃去，加入MTT 10μl(终浓度5mg/ml)，继续培养4h后按文献[3,4]方法加入酸化异丙醇，用酶联检测仪测定细胞增殖OD值(波长为570nm)。按公式“(1-药物孔OD值/对照孔OD值)×100%”，计算细胞抑制率。根据该抑制率计算相应的概率单位，用图解法[5]分别求出相应的半数抑制浓度(IC50)。
, 百拇医药
3.2 与阿霉素的协同效应 将3种细胞浓度仍调为1×105/ml，向96孔培养板中加入细胞悬液100μl，培养24h后再向培养板中分别加入不同浓度的GBEP和阿霉素各50μl。设不加药物的阴性对照孔和单加GBEP或阿霉素的对照孔，每孔总容积皆为200μl，继续培养24h，其余检测及计算方法皆同3.1项下操作。
结 果
1 在不同时间单用GBEP对3种人癌细胞株抑制作用的量效曲线
结果见图1，图2，图3。
图1 GBEP对BEL-7404肝癌细胞株抑制的量效曲线
, http://www.100md.com
图2 GBEP对SGC-7901胃癌细胞株抑制的量效曲线
图3 GBEP对SPC-A-1肺腺癌细胞株抑制的量效曲线
结果显示，GBEP在10～320μg/ml剂量下，体外作用24～72h，对3种人癌细胞株都具有抑制作用，其抑制率随剂量增加和时间延长而增加。
2 在不同时间GBEP对3种人癌细胞株的IC50
结果见表1。
表1 在不同时间GBEP对3种人癌细胞株的IC50 (μg/ml) 细胞种类
24h
, http://www.100md.com
48h
72h
BEL-7404
>320
182
129
SGC-7901
105
43
30
SPC-A-1
170
49
, http://www.100md.com
37
表1结果显示，GBEP对3种人癌细胞株的IC50皆随作用时间的延长而减小。 SGC-7901和SPC-A-1细胞株在GBEP作用48h和72h时，其IC50皆小于50μg/ml。GBEP与SGC-7901细胞株作用72h时，IC50为30μg/ml。
3 GBEP与阿霉素联用对3种人癌细胞株的抑制作用
GBEP在10～160μg/ml剂量下分别与0.4，4.0μg/ml剂量的阿霉素联用对3种人癌细胞株的抑制作用结果见表2。表2 GBEP与阿霉素联用对3种人癌细胞的抑制作用 (抑制率%) GBEP(μg/ml)
BEL-7404肝癌
SGC-7901胃癌
, http://www.100md.com
SPC-A-1肺癌
0
0.4
4.0
0
0.4
4.0
0
0.4
4.0
0
/
22.8
, 百拇医药 52.6
/
26.4
58.6
/
31.2
67.3
10
15.9
30.6
58.3
18.6
39.2
, 百拇医药
72.4
23.5
46.4
72.5
20
21.2
42.4
67.9
29.4
48.8
81.9
30.2
57.6
, 百拇医药
84.1
40
29.0
53.7
73.4
37.3
54.7
90.1
36.5
69.2
93.6
80
35.8
, 百拇医药
64.0
81.8
41.9
61.3
95.6
41.6
80.8
100.0
160
39.6
76.4
88.9
56.6
, 百拇医药
81.0
100.0
49.3
92.3
100.0
表2结果显示，GBEP在10～160μg/ml剂量下，与0.4和4.0μg/ml剂量的阿霉素合用，可提高对3种人癌细胞的抑制率。
讨 论
GBEP体外加药，对人BEL-7404肝癌、SGC-7901胃癌及SPC-A-1肺癌细胞具有直接抑制作用，在10～320μg/ml剂量下，呈现量效关系及时效关系。从抑制率和IC50比较来看，3种细胞株对GBEP的敏感性顺序为SGC-7901>SPC-A-1>BEL-7404，这与GBEP制剂在临床对胃癌疗效较好(待发表资料)的结果是一致的。
, http://www.100md.com
本实验将GBEP与阿霉素联合应用，显示对上述3种人癌细胞株的抑制作用具有一定的协同效应。在10～160μg/ml剂量下，对BEL-7404，SGC-7901和SPC-A-1细胞株的抑制率比单用剂量为0.4和4.0μg/ml的阿霉素分别提高了7.8%～53.6%和5.7%～36.3%，12.8%～54.6%和13.8%～41.4%以及15.2%～61.1%和8.8%～36.6%。可以看出，GBEP与低剂量的阿霉素合用其协同效应更加显著。提示GBEP在临床与阿霉素等化疗药物联用时，一方面可提高疗效，另一方面可通过减少化疗药物的用量而减少不良反应，有待进一步研究。
基金项目：江苏省教委自然科学基金资助课题(省教94161，99KJD360001)，该项目阶段性研究成果已于1997年获“江苏省中医药科技成果进步奖二等奖”。
[作者简介]许爱华(1957-)，女，扬州大学医学院副教授，主要从事药理学教学、肿瘤免疫药理及新药开发研究。
, 百拇医药
[参考文献]
[1]许爱华，陈华圣，项晓仁，等.银杏外种皮多糖对小鼠肿瘤的抑制作用[J].中药药理与临床，1996，12(5)∶24-26.
[2]许爱华，陈华圣，夏叶玲，等.银杏外种皮多糖对荷瘤小鼠免疫功能的影响[J].中药新药与临床药理，1996，7(3)∶22-24.
[3]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Methods,1983，65∶55-56.
[4]Campling BG,Pym J,Baker MH,et al.Chemosensitivity testing of small cell lung cancer using the MTT assay[J].Br J Cancer,1991，63∶75-76.
[5]林琼芳.半数效量概率单位法[A].见：杨树勤主编.中国医学百科全书.医学统计学[M].上海：上海科学技术出版社，1985.197-202.
收稿日期：2000-06-07
修回日期：2000-08-18, 百拇医药
单位：褚澄(扬州大学医学院96级医学系，扬州 225001)；许爱华 陈华圣 王兴旺 张洪泉(扬州大学医学院，扬州 225001)
关键词：银杏外种皮多糖；阿霉素；人BEL-7404肝癌细胞株；人SGC-7901胃腺癌细胞株；人SPC-A-1肺腺癌细胞株
中国新药杂志001106 [摘要]目的：检测银杏外种皮多糖(GBEP)的抗癌活性。方法：采用噻唑蓝(MTT)比色法，观察GBEP单用及与阿霉素合用在体外对人BEL-7404肝癌细胞株、SGC-7901胃腺癌细胞株及SPC-A-1肺腺癌细胞株的抑制作用。结果：GBEP在10～320μg/ml剂量下，体外作用24～72h，对3种人癌细胞株皆具有抑制作用，其抑制率随剂量增加和时间延长而增加，而IC50则随作用时间延长而减小。GBEP在10～160μg/ml剂量下，与0.4和4.0μg/ml的阿霉素合用，可提高对3种人癌细胞的抑制率。结论：GBEP单用对3种人癌细胞株的抑制作用具有量效关系及时效关系；GBEP与阿霉素合用，对3种人癌细胞株的抑制作用具有协同效应。
, 百拇医药
[中图分类号]R282.71;R979.14 [文献标识码]B
[文章编号]1003-3734(2000)11-0753-03
The inhibitory effect of Ginkgo biloba endocarp polysaccharides (GBEP)on human cancer cell strains and its synergic effect in combination with adriamycin
XU Ai-hua,CHEN Hua-sheng,WANG Xing-wang,ZHANG Hong-quan
(Medical College of Yangzhou University,Yangzhou 225001,China)
, 百拇医药
ZHU Cheng
(Class 1996,Department of Medicine,Medical College of Yangzhou University,Yangzhou 225001,China)
[Abstract]Objective:To detect the in vitro anticancer activities of GBEP.Methods:The inhibitory effect of single GBEP and combined therapy with adriamycin on human cancer cell strains of BEL-7404(liver),SGC-7901(stomach),and SPC-A-1(lung)were observed by MTT colorimetic method.Results:All 3 human cancer cell strains were significantly inhibited by single GBEP in dose of 10～320μg/ml for 24～72 h.Its inhibitory rate increased with increase of dose and prolongation of treatment time and its IC50 decreased with increase of treatment time.The inhibitory rate on the 3 human cancer cell strains can be increased by GBEP in dose of 10～160 μg/ml plus adriamycin in doses of 0.4 and 4.0μg/ml.Conclusion:Single GBEP exhibited dose and time effect on 3 human cancer cell strains and exhibited synergic effect while combined with adriamycin.
, http://www.100md.com
[Key words]GBEP;adriamycin;human liver cancer cell line;human stomach cancer cell line;human lung cancer cell line
银杏外种皮多糖(Ginkgo biloba endocarp polysaccharides,GBEP)是从银杏树的果实(银杏，俗称白果)的外种皮中提得的活性多糖。经研究发现其具有抑制动物肿瘤及促进荷瘤动物免疫功能的作用[1,2]。本实验用噻唑蓝(MTT)法观察了GBEP对人肝癌、胃癌及肺癌细胞生长的抑制作用及与阿霉素的协同效应。
材料和方法
1 药物及试剂
GBEP系本室从成熟的新鲜银杏外种皮中提取而得，干燥后为灰白色粉末。体外实验时，将其灭菌后溶解于RPMI1640培养液中，调pH至中性后置4℃冰箱中备用。RPMI1640培养粉：美国Gibco公司产品。MTT：美国Sigma公司产品。小牛血清及胰蛋白酶(trypsin,1∶250)为华美生物工程公司产品。阿霉素为深圳万乐药业有限公司产品，批号：981102。双蒸水自制。其余试剂用国产分析纯。
, 百拇医药
2 人癌细胞株
BEL-7404肝癌细胞株、SGC-7901胃腺癌细胞株及SPC-A-1肺腺癌细胞株，皆购自中国科学院上海细胞生物学研究所。体外培养，每2～3天传代1次。
3 方法
3.1 对3种人癌细胞株的抑制作用 分别取对数生长期的3种癌细胞，用0.25%胰蛋白酶消化适当时间后，立即用Hank's液洗涤数次，再用含10%小牛血清RPMI1640培养液将3种细胞浓度皆调整为1×105/ml。向96孔培养板中分别加入上述细胞悬液100μl ，将培养板置于5%CO2、37℃孵箱中培养24h后取出，分别加入含不同浓度GBEP的RPMI1640培养液各100μl，每个浓度设3个复孔，对照孔加入等容积RPMI1640培养液，继续分别培养24，48及72h，其中每隔24h取出培养板，弃去上清液后重新加药1次。培养结束前4h从各孔中吸出100μl上清液弃去，加入MTT 10μl(终浓度5mg/ml)，继续培养4h后按文献[3,4]方法加入酸化异丙醇，用酶联检测仪测定细胞增殖OD值(波长为570nm)。按公式“(1-药物孔OD值/对照孔OD值)×100%”，计算细胞抑制率。根据该抑制率计算相应的概率单位，用图解法[5]分别求出相应的半数抑制浓度(IC50)。
, 百拇医药
3.2 与阿霉素的协同效应 将3种细胞浓度仍调为1×105/ml，向96孔培养板中加入细胞悬液100μl，培养24h后再向培养板中分别加入不同浓度的GBEP和阿霉素各50μl。设不加药物的阴性对照孔和单加GBEP或阿霉素的对照孔，每孔总容积皆为200μl，继续培养24h，其余检测及计算方法皆同3.1项下操作。
结 果
1 在不同时间单用GBEP对3种人癌细胞株抑制作用的量效曲线
结果见图1，图2，图3。
图1 GBEP对BEL-7404肝癌细胞株抑制的量效曲线
, http://www.100md.com
图2 GBEP对SGC-7901胃癌细胞株抑制的量效曲线
图3 GBEP对SPC-A-1肺腺癌细胞株抑制的量效曲线
结果显示，GBEP在10～320μg/ml剂量下，体外作用24～72h，对3种人癌细胞株都具有抑制作用，其抑制率随剂量增加和时间延长而增加。
2 在不同时间GBEP对3种人癌细胞株的IC50
结果见表1。
表1 在不同时间GBEP对3种人癌细胞株的IC50 (μg/ml) 细胞种类
24h
, http://www.100md.com
48h
72h
BEL-7404
>320
182
129
SGC-7901
105
43
30
SPC-A-1
170
49
, http://www.100md.com
37
表1结果显示，GBEP对3种人癌细胞株的IC50皆随作用时间的延长而减小。 SGC-7901和SPC-A-1细胞株在GBEP作用48h和72h时，其IC50皆小于50μg/ml。GBEP与SGC-7901细胞株作用72h时，IC50为30μg/ml。
3 GBEP与阿霉素联用对3种人癌细胞株的抑制作用
GBEP在10～160μg/ml剂量下分别与0.4，4.0μg/ml剂量的阿霉素联用对3种人癌细胞株的抑制作用结果见表2。表2 GBEP与阿霉素联用对3种人癌细胞的抑制作用 (抑制率%) GBEP(μg/ml)
BEL-7404肝癌
SGC-7901胃癌
, http://www.100md.com
SPC-A-1肺癌
0
0.4
4.0
0
0.4
4.0
0
0.4
4.0
0
/
22.8
, 百拇医药 52.6
/
26.4
58.6
/
31.2
67.3
10
15.9
30.6
58.3
18.6
39.2
, 百拇医药
72.4
23.5
46.4
72.5
20
21.2
42.4
67.9
29.4
48.8
81.9
30.2
57.6
, 百拇医药
84.1
40
29.0
53.7
73.4
37.3
54.7
90.1
36.5
69.2
93.6
80
35.8
, 百拇医药
64.0
81.8
41.9
61.3
95.6
41.6
80.8
100.0
160
39.6
76.4
88.9
56.6
, 百拇医药
81.0
100.0
49.3
92.3
100.0
表2结果显示，GBEP在10～160μg/ml剂量下，与0.4和4.0μg/ml剂量的阿霉素合用，可提高对3种人癌细胞的抑制率。
讨 论
GBEP体外加药，对人BEL-7404肝癌、SGC-7901胃癌及SPC-A-1肺癌细胞具有直接抑制作用，在10～320μg/ml剂量下，呈现量效关系及时效关系。从抑制率和IC50比较来看，3种细胞株对GBEP的敏感性顺序为SGC-7901>SPC-A-1>BEL-7404，这与GBEP制剂在临床对胃癌疗效较好(待发表资料)的结果是一致的。
, http://www.100md.com
本实验将GBEP与阿霉素联合应用，显示对上述3种人癌细胞株的抑制作用具有一定的协同效应。在10～160μg/ml剂量下，对BEL-7404，SGC-7901和SPC-A-1细胞株的抑制率比单用剂量为0.4和4.0μg/ml的阿霉素分别提高了7.8%～53.6%和5.7%～36.3%，12.8%～54.6%和13.8%～41.4%以及15.2%～61.1%和8.8%～36.6%。可以看出，GBEP与低剂量的阿霉素合用其协同效应更加显著。提示GBEP在临床与阿霉素等化疗药物联用时，一方面可提高疗效，另一方面可通过减少化疗药物的用量而减少不良反应，有待进一步研究。
基金项目：江苏省教委自然科学基金资助课题(省教94161，99KJD360001)，该项目阶段性研究成果已于1997年获“江苏省中医药科技成果进步奖二等奖”。
[作者简介]许爱华(1957-)，女，扬州大学医学院副教授，主要从事药理学教学、肿瘤免疫药理及新药开发研究。
, 百拇医药
[参考文献]
[1]许爱华，陈华圣，项晓仁，等.银杏外种皮多糖对小鼠肿瘤的抑制作用[J].中药药理与临床，1996，12(5)∶24-26.
[2]许爱华，陈华圣，夏叶玲，等.银杏外种皮多糖对荷瘤小鼠免疫功能的影响[J].中药新药与临床药理，1996，7(3)∶22-24.
[3]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Methods,1983，65∶55-56.
[4]Campling BG,Pym J,Baker MH,et al.Chemosensitivity testing of small cell lung cancer using the MTT assay[J].Br J Cancer,1991，63∶75-76.
[5]林琼芳.半数效量概率单位法[A].见：杨树勤主编.中国医学百科全书.医学统计学[M].上海：上海科学技术出版社，1985.197-202.
收稿日期：2000-06-07
修回日期：2000-08-18, 百拇医药