脑因子的制备及其特性鉴定
作者：狄凤桐 朱和平 狄宁 郭美香 魏文清 何福全
单位：狄凤桐 朱和平 狄宁 郭美香 魏文清 何福全(解放军253医院，呼和浩特010051)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990124
近十几年来，各国学者应用人胎脑组织等已制备出多种神经营养因子，如神经生长因子(NGF)、腺苷、热休克蛋白等。但上述神经因子大多为肽类物质，难以透过血脑屏障而发挥作用；另外是来源困难，需采用基因工程技术制备重组制品，这在一般医院现时尚难以做到。为此，我们从1992年起，即开展了脑因子的研制，并经内蒙古生物制药厂等单位，对其进行了无菌试验、热原试验、过敏试验、毒性试验、以及pH、氨基酸含量与SOD含量等的测定，结果均符合我国药典(1990)的规定。培养检查无真菌、普通细菌及厌氧菌等生长。冷冻的人胎脑细胞混悬液注入脑内，几乎不产生体液免疫反应。现报道如下：
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 脑组织标本 为新鲜的幼乳牛脑组织，由内蒙古生物制药厂提供。
1.2 主要试剂和仪器 SDS-PAGE中所用的各种试剂和蛋白水解酶，以及电泳仪均为国产制品。脑活素为奥地利Ebave药厂在中国办的凯建药品有限公司的产品。日立835-50型氨基酸测定仪及uv-250紫外分光光度扫描仪均为日本产品。
1.3 脑因子的制备 取新鲜幼乳牛脑组织去筋膜、血管后，匀浆，反复融冻数次，用0.1mol/LHCl调pH到酸性，按比例加入一定量的蛋白水解酶，于25℃水解过夜，离心(10000r/min×15min);取上清，用中空纤维超滤器除去其中的大分子物质，以0.1mol/LHCl调pH至6.9，通过滤膜(孔径0.02μm)抽滤除菌，分装、待用。
1.4 脑因子的特性鉴定
, 百拇医药
1.4.1 纯度分析采用uv-250紫外分光光度扫描仪扫描后，根据制品的吸收峰，判定其纯度。
1.4.2 分子量测定采用SDS-PAGE进行测定。所用凝胶的交联度为5%，凝胶浓度为7%。
1.4.3 氨基酸及SOD含量测定分别采用氨基酸测定仪及酶联免疫吸附法进行测定。
1.5 脑因子对脑细胞的刺激作用 取日本大白兔15只(实验组10只，对照组5只)，雌雄兼用，每只体重3kg。动物头部剃毛，常规消毒，注1%奴佛卡因2ml于额顶局部麻醉。依次切开头皮，颅骨及硬脑膜，从左额顶区切去8mm3脑组织。缺损区止血后，实验组兔注入脑因子1ml～2ml(对照组注入同等量的无菌生理盐水)，关闭颅骨，缝合头皮，观察动物术后情况，并于术后55d,处死动物取材做病理学检查。
2 结果和讨论
, 百拇医药
2.1 脑因子的特性鉴定 ①本室制备的脑因子与进口脑活素经紫外分光光度计扫描后，分别于263nm和270nm～280nm处出显现单一吸收峰。二者的峰值相接近，且有部分重叠(图1)。②本室制备的脑因子与进口脑活素经SDS-PAGE鉴定后，均出现两条区带，但脑因子的两条带下移(图2)。③脑因子中氨基酸含量测定的结果表明，总酸为156.072g/L(占36%)，必需游离氨基酸为136.2g/L(占90%)，与进口脑活素所含必需游离氨基酸(约85%)基本相同。④经对20份脑因子和20份脑活素做SOD含量(
±SD)测定表明，前者为15.99±4.37；后者为16.96±4.30，无统计学意义(P>0.05)。
图1 脑因子与脑活素的紫外分光光度计扫描
, 百拇医药
图2 脑因子与脑活性素的SDS-PAGE
注：1，3:脑因子；2，4:脑活素；5:Marker(Mr)
2.2 脑因子促进脑细胞生长的作用 ①大体观察：注入脑因子实验组10只兔，可见脑缺损区的脑组织呈粉白色，色泽光滑与周围脑组织有血管相通。②镜下观察：可见交织在一起的星形胶质细胞(数量较多)和神经元细胞(数量较少)，并发现修复区与原脑组织之间有血管相通，提示修复区的脑细胞已存活。对照组5只兔，大体观察时可见脑损伤区凹陷不平呈灰白色，有疤痕形成，与周围脑组织无血管相通。镜下观察时，脑神经元细胞呈凸凹状，细胞核萎缩，胶质细胞增生，有纤维变性，部分有钙化。
以上所获结果表明，本室研制的脑因子与进口脑活素相比较，纯度均较良好(均为单一吸收峰)，但脑因子的相对分子质量较进口脑活素略小(在SDS-PAGE图谱中前者的区带下移)；二者的必需游离氨基酸及SOD的含量基本相同。将脑因子注入去除少许动物脑组织的脑缺损区后，具有刺激脑细胞增殖，促进脑缺损区修复的活性。另外，脑因子具有制备方法简便，成本低廉，易于大量生产等优点。但对其作用机理，以及临床应用的前景尚需进一步研究。
作者简介：狄凤桐，男，56岁，主任医师
呼和浩特市新城区爱民路5号,Tel.(0471)6515511
参考文献
[1]朱和平，方建华，王希良，等.脑水解物的制备.中国免疫学杂志，1995:11(增刊)：625～626
[2]许绍芳，莫浣英，黄登凯，等.神经生物学.上海：上海医科大学出版社，1990：142～162
(收稿 1998-04-10 修回 1998-06-13), http://www.100md.com
单位：狄凤桐 朱和平 狄宁 郭美香 魏文清 何福全(解放军253医院，呼和浩特010051)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990124
近十几年来，各国学者应用人胎脑组织等已制备出多种神经营养因子，如神经生长因子(NGF)、腺苷、热休克蛋白等。但上述神经因子大多为肽类物质，难以透过血脑屏障而发挥作用；另外是来源困难，需采用基因工程技术制备重组制品，这在一般医院现时尚难以做到。为此，我们从1992年起，即开展了脑因子的研制，并经内蒙古生物制药厂等单位，对其进行了无菌试验、热原试验、过敏试验、毒性试验、以及pH、氨基酸含量与SOD含量等的测定，结果均符合我国药典(1990)的规定。培养检查无真菌、普通细菌及厌氧菌等生长。冷冻的人胎脑细胞混悬液注入脑内，几乎不产生体液免疫反应。现报道如下：
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1 材料和方法
1.1 脑组织标本 为新鲜的幼乳牛脑组织，由内蒙古生物制药厂提供。
1.2 主要试剂和仪器 SDS-PAGE中所用的各种试剂和蛋白水解酶，以及电泳仪均为国产制品。脑活素为奥地利Ebave药厂在中国办的凯建药品有限公司的产品。日立835-50型氨基酸测定仪及uv-250紫外分光光度扫描仪均为日本产品。
1.3 脑因子的制备 取新鲜幼乳牛脑组织去筋膜、血管后，匀浆，反复融冻数次，用0.1mol/LHCl调pH到酸性，按比例加入一定量的蛋白水解酶，于25℃水解过夜，离心(10000r/min×15min);取上清，用中空纤维超滤器除去其中的大分子物质，以0.1mol/LHCl调pH至6.9，通过滤膜(孔径0.02μm)抽滤除菌，分装、待用。
1.4 脑因子的特性鉴定
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1.4.1 纯度分析采用uv-250紫外分光光度扫描仪扫描后，根据制品的吸收峰，判定其纯度。
1.4.2 分子量测定采用SDS-PAGE进行测定。所用凝胶的交联度为5%，凝胶浓度为7%。
1.4.3 氨基酸及SOD含量测定分别采用氨基酸测定仪及酶联免疫吸附法进行测定。
1.5 脑因子对脑细胞的刺激作用 取日本大白兔15只(实验组10只，对照组5只)，雌雄兼用，每只体重3kg。动物头部剃毛，常规消毒，注1%奴佛卡因2ml于额顶局部麻醉。依次切开头皮，颅骨及硬脑膜，从左额顶区切去8mm3脑组织。缺损区止血后，实验组兔注入脑因子1ml～2ml(对照组注入同等量的无菌生理盐水)，关闭颅骨，缝合头皮，观察动物术后情况，并于术后55d,处死动物取材做病理学检查。
2 结果和讨论
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2.1 脑因子的特性鉴定 ①本室制备的脑因子与进口脑活素经紫外分光光度计扫描后，分别于263nm和270nm～280nm处出显现单一吸收峰。二者的峰值相接近，且有部分重叠(图1)。②本室制备的脑因子与进口脑活素经SDS-PAGE鉴定后，均出现两条区带，但脑因子的两条带下移(图2)。③脑因子中氨基酸含量测定的结果表明，总酸为156.072g/L(占36%)，必需游离氨基酸为136.2g/L(占90%)，与进口脑活素所含必需游离氨基酸(约85%)基本相同。④经对20份脑因子和20份脑活素做SOD含量(
±SD)测定表明，前者为15.99±4.37；后者为16.96±4.30，无统计学意义(P>0.05)。图1 脑因子与脑活素的紫外分光光度计扫描
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图2 脑因子与脑活性素的SDS-PAGE
注：1，3:脑因子；2，4:脑活素；5:Marker(Mr)
2.2 脑因子促进脑细胞生长的作用 ①大体观察：注入脑因子实验组10只兔，可见脑缺损区的脑组织呈粉白色，色泽光滑与周围脑组织有血管相通。②镜下观察：可见交织在一起的星形胶质细胞(数量较多)和神经元细胞(数量较少)，并发现修复区与原脑组织之间有血管相通，提示修复区的脑细胞已存活。对照组5只兔，大体观察时可见脑损伤区凹陷不平呈灰白色，有疤痕形成，与周围脑组织无血管相通。镜下观察时，脑神经元细胞呈凸凹状，细胞核萎缩，胶质细胞增生，有纤维变性，部分有钙化。
以上所获结果表明，本室研制的脑因子与进口脑活素相比较，纯度均较良好(均为单一吸收峰)，但脑因子的相对分子质量较进口脑活素略小(在SDS-PAGE图谱中前者的区带下移)；二者的必需游离氨基酸及SOD的含量基本相同。将脑因子注入去除少许动物脑组织的脑缺损区后，具有刺激脑细胞增殖，促进脑缺损区修复的活性。另外，脑因子具有制备方法简便，成本低廉，易于大量生产等优点。但对其作用机理，以及临床应用的前景尚需进一步研究。
作者简介：狄凤桐，男，56岁，主任医师
呼和浩特市新城区爱民路5号,Tel.(0471)6515511
参考文献
[1]朱和平，方建华，王希良，等.脑水解物的制备.中国免疫学杂志，1995:11(增刊)：625～626
[2]许绍芳，莫浣英，黄登凯，等.神经生物学.上海：上海医科大学出版社，1990：142～162
(收稿 1998-04-10 修回 1998-06-13), http://www.100md.com