肠出血性大肠埃希菌0157∶H7型检测方法的建立*
作者：汪力亚 黄上媛 王丽 李景云周志江 苏维萍 宋华宾 张让堂
单位：汪力亚 黄上媛 王丽 李景云(解放军三O二医院微生物研究室，北京100039)；周志江 苏维萍 宋华宾 张让堂(解放军畜牧兽医大学)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990123
肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157∶H7血清型除引起肠出血性结肠炎(HC)易误诊为痢疾外，10%左右患者可出现溶血性尿毒综合征(HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)而危及生命。自1982年美国首次暴发HC，并分离出O157∶H7以来，发达国家中暴发流行此起彼伏〔1〕，已成为一种危害严重的传染病而引起各国政府的高度重视。我国近年来也时有发病〔2〕。因此，我们建立了一种快速、敏感、特异检测粪便标本中EHECO157∶H7的SPA协同凝集试验，以供临床检验诊断急用。
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当前，国内外对EHEC的实验室诊断方法，有乳胶凝集试验(LAT)〔3〕、免疫磁化分离法(IMS)〔4〕、ELISA〔5〕和直接免疫荧光法(DIFA)〔6〕。另外，徐建国〔7〕根据hlyAB(溶血素)基因的序列设计引物而建立的PCR法已通过试验验证。
我室以自制兔抗EHECO157IgG标记金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)菌体，建立了一种可简便、快速、特异、敏感，适用于临床检验和部队防疫筛检EHECO157∶H7的O157SPA协同凝集试验(COA)。
1 材料和方法
1.1 菌株 EHEC O157∶H7标准株和分离株(包括日本分离株6株，长春牛肉及牛粪各分离1株，均为解放军畜牧兽医大学惠赠)；金黄色葡萄球菌菌株CowanI(2611)及表皮葡萄球菌Cood46(26107)株，大肠埃希氏菌(E.coli ATCC 25922),产肠毒素性大肠杆菌(ETECLT 44813及ST44814，LT/ST44816),肠侵袭性大肠杆菌(EIEC 44852)，肠致病性大肠杆菌(EPEC)及弗劳地枸橼酸杆菌，均购于中国医学细菌保藏管理中心；临床分离的40株发酵山梨醇E.coli及17种26株肠道菌株，均系本室从病人粪便中分离并鉴定。
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1.2 兔抗EHEC0157IgG致敏SPA菌体的制备 ①将EHECO157∶H7标准株接种于胰酶大豆肉汤，置37℃过夜，经高压蒸气灭菌后，配成100亿/ml菌悬液，作为“O”抗原。②将O抗原加福氏不完全佐剂，经背部皮下多点免疫家兔(10亿/ml)；第2，3次以腹腔注射免疫(分别为10亿/ml，20亿/ml)，第4～6次静脉注射(依次为10，20及40亿/ml)，注射量均为1ml，每周2次，共6次。末次免疫1周后试血，血清O抗体试管凝集效价达1∶2560时，放血、分离血清。③常规用饱和硫酸铵盐析2次提取IgG，试管凝集效价为1∶2560。④SPACowanI株常规培养后取菌苔，用0.5%的福尔马林PBS处理后，配制成10%(V/V)SPA菌悬液(0.05%NaN3PBS),显微镜下观察无自凝；以同样方法制备质控对照株Cood46菌悬液。⑤取10%SPA稳定菌液1ml,用PBS洗1次，加O157IgG血清0.1ml，在37℃作用30min。加1%美兰0.1ml染菌体10min，用PBS洗离3次，再用含0.1%NaN3的PBS配成1%的菌悬液，即为O157IgG致敏SPA诊断试剂(O157-SPA)，4℃保存备用。同法制备正常兔血清IgG标记的SPA质控对照菌悬液(NRS-SPA)。
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1.3 O157-SPACOA的操作步骤及结果判定 取清洁玻片1张，加O157-SPA菌体试剂1滴，挑取山梨醇—麦康凯培养基上的无色菌落，充分混匀，摇动，于2min内观察结果。判断标准：“4+”者为10%凝集，且呈大块；“3+”者为75%凝集；“2+”者为50%凝集；“+”者为25%凝集，且颗粒很小，结果可疑；“-”者为无凝集。注意事项：对初筛凝集试验呈阳性者，尚要与质控对照株Cood46菌悬液和NRSSPA菌悬液做凝集试验，以排除非特异性凝集。另外，还需接种H7抗血清—山梨醇发醇培养管做制动试验，检测H7抗原，阳性者即为O157∶H7EHEC。
2 结果和讨论
2.1 O157-SPACOA的特异性 ①O157∶H7与E.coli的反应性：用O157-SPA与ETEC(LT44813，ST44814，LT/ST44816)，EIEC(44825)，EPEC，以及40株临床分离的发酵山梨醇的E.coli做O157-SPACOA均呈阴性。②O157-SPA与其它肠道菌的反应性：用O157-SPA与普通变形杆菌、福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、志贺氏I型菌、伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、0-1群和非0-1群霍乱弧菌、副溶血性弧菌、温和气单胞菌、类志贺邻单胞菌及弗劳地枸橼酸杆菌等17种26个菌株，均不发生凝集。
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2.2 O157-SPACOA法的敏感性 用无菌生理盐水(NS)配制EHECO157∶H7菌悬液至8.0,2.0,0.5麦氏比浊度(8×1011/L)，再倍比系列稀释后取10μl菌悬液，加等量O157-SPA试剂做COA。以含1百万个细菌仍可出现“++”特异凝集颗粒者为终点。所获结果与兔抗O157血清IgG(工作浓度1∶20)的玻片凝集试验做比较，敏感性可提高128倍。试验中设生理盐水加O157SPA；O157∶H7加NRSSPA及O157∶H7加1%Cood46菌悬液3项对照，其结果均呈阴性(见表1)。
表1 O157-SPACOA法的敏感性检测 检测方法
麦氏比浊度(亿菌/ml)
8.0
2.0
0.5
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0.125
0.065
0.032
O157:H7+O157-SPA
4+
4+
4+
3+
2+
-
O157:H7+NRS-SPA
-
-
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-
-
-
-
NS+O157-SPA
-
-
-
-
-
-
O157:H7+1%Cood46
-
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-
-
-
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血清玻片凝集
2+
-
-
-
-
-
*实际稀释菌数(1011/L)及凝集菌数(106/10μl)依次为：128，32，8，2，1，0.5个
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2.3 O157-SPACOA法的重复性 将经3次传代的3株O157∶H7菌分别配制9份菌悬液(0.5麦氏比浊度)，再与制备的3批O157-SPA试剂(9756＃，97528＃和97725＃)做O157SPACOA，结果均为“4+”的凝集。用10株EHECO157∶H7的菌落，与上述的3批O157-SPA试剂做O157-SPACOA，结果也均为“4+”的凝集。
我室所建立的O157-SPACOA法具有操作简便、快速，结果易于观察，敏感性较血清玻片凝集试验高128倍及特异性强等优点。经对近千份腹泻病人粪便标本的检测，均未出现非特异性凝集。另外，试剂稳定、重复性良好，可望用于EHECO157∶H7的临床检测、基层检疫和流行病学调查。
*国家自然科学基金资助项目，No.3970563
作者简介：汪力亚，女，50岁，副研究员，硕士
, 百拇医药
北京市丰台路26号，Tel.(010)63810541
参考文献
[1]Riley LW, Remis RS，Helgerson SD, et al. The hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype. N Engl J Med, 1983; 308: 681～685
[2]李景学，周国清，温宪芹,等.肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7的分离与鉴定.中国人兽共患病杂志，1994;10(6)：23～25
[3]March SB, Ratnam S. Latesx agglutination test for detection of Escherichia coli serotype O157. J Clin Microbiol, 1989; 27(7):1675～1677
, 百拇医药
[4]Helge K, Mittmnn CJ, Aleksic S, et al. Isolation of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 strains from patients with hemolytic-uremic syndrome by using immunomagnetic separation, DNA-based methods and direct culture. J Clin Microbiol, 1996; 34(3): 516～519
[5]Ball HJ, Finlay D, Zafar A, et al. The detection of verocytotoxins in bacterial cultures from human diarrhoeal samplles with monoclonal antibody-based ELISAs. J Clin Microbio, 1996; 44(4): 273～276
, 百拇医药
[6]Park CH, Hixon DC, Morrison WL, et al. Ripid diagnosis of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 directly from fecal specimens using immunofluorescence staining. Am J Clin Pathol, 1994; 101(1): 91～94
[7]徐建国，黄力保，吴纪民.聚合酶链反应检测出血性大肠埃希菌.中华医学检验杂志，1995;18(4)：225～228
(收稿 1998-04-21 修回 1998-06-17), 百拇医药
单位：汪力亚 黄上媛 王丽 李景云(解放军三O二医院微生物研究室，北京100039)；周志江 苏维萍 宋华宾 张让堂(解放军畜牧兽医大学)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990123
肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157∶H7血清型除引起肠出血性结肠炎(HC)易误诊为痢疾外，10%左右患者可出现溶血性尿毒综合征(HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)而危及生命。自1982年美国首次暴发HC，并分离出O157∶H7以来，发达国家中暴发流行此起彼伏〔1〕，已成为一种危害严重的传染病而引起各国政府的高度重视。我国近年来也时有发病〔2〕。因此，我们建立了一种快速、敏感、特异检测粪便标本中EHECO157∶H7的SPA协同凝集试验，以供临床检验诊断急用。
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当前，国内外对EHEC的实验室诊断方法，有乳胶凝集试验(LAT)〔3〕、免疫磁化分离法(IMS)〔4〕、ELISA〔5〕和直接免疫荧光法(DIFA)〔6〕。另外，徐建国〔7〕根据hlyAB(溶血素)基因的序列设计引物而建立的PCR法已通过试验验证。
我室以自制兔抗EHECO157IgG标记金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)菌体，建立了一种可简便、快速、特异、敏感，适用于临床检验和部队防疫筛检EHECO157∶H7的O157SPA协同凝集试验(COA)。
1 材料和方法
1.1 菌株 EHEC O157∶H7标准株和分离株(包括日本分离株6株，长春牛肉及牛粪各分离1株，均为解放军畜牧兽医大学惠赠)；金黄色葡萄球菌菌株CowanI(2611)及表皮葡萄球菌Cood46(26107)株，大肠埃希氏菌(E.coli ATCC 25922),产肠毒素性大肠杆菌(ETECLT 44813及ST44814，LT/ST44816),肠侵袭性大肠杆菌(EIEC 44852)，肠致病性大肠杆菌(EPEC)及弗劳地枸橼酸杆菌，均购于中国医学细菌保藏管理中心；临床分离的40株发酵山梨醇E.coli及17种26株肠道菌株，均系本室从病人粪便中分离并鉴定。
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1.2 兔抗EHEC0157IgG致敏SPA菌体的制备 ①将EHECO157∶H7标准株接种于胰酶大豆肉汤，置37℃过夜，经高压蒸气灭菌后，配成100亿/ml菌悬液，作为“O”抗原。②将O抗原加福氏不完全佐剂，经背部皮下多点免疫家兔(10亿/ml)；第2，3次以腹腔注射免疫(分别为10亿/ml，20亿/ml)，第4～6次静脉注射(依次为10，20及40亿/ml)，注射量均为1ml，每周2次，共6次。末次免疫1周后试血，血清O抗体试管凝集效价达1∶2560时，放血、分离血清。③常规用饱和硫酸铵盐析2次提取IgG，试管凝集效价为1∶2560。④SPACowanI株常规培养后取菌苔，用0.5%的福尔马林PBS处理后，配制成10%(V/V)SPA菌悬液(0.05%NaN3PBS),显微镜下观察无自凝；以同样方法制备质控对照株Cood46菌悬液。⑤取10%SPA稳定菌液1ml,用PBS洗1次，加O157IgG血清0.1ml，在37℃作用30min。加1%美兰0.1ml染菌体10min，用PBS洗离3次，再用含0.1%NaN3的PBS配成1%的菌悬液，即为O157IgG致敏SPA诊断试剂(O157-SPA)，4℃保存备用。同法制备正常兔血清IgG标记的SPA质控对照菌悬液(NRS-SPA)。
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1.3 O157-SPACOA的操作步骤及结果判定 取清洁玻片1张，加O157-SPA菌体试剂1滴，挑取山梨醇—麦康凯培养基上的无色菌落，充分混匀，摇动，于2min内观察结果。判断标准：“4+”者为10%凝集，且呈大块；“3+”者为75%凝集；“2+”者为50%凝集；“+”者为25%凝集，且颗粒很小，结果可疑；“-”者为无凝集。注意事项：对初筛凝集试验呈阳性者，尚要与质控对照株Cood46菌悬液和NRSSPA菌悬液做凝集试验，以排除非特异性凝集。另外，还需接种H7抗血清—山梨醇发醇培养管做制动试验，检测H7抗原，阳性者即为O157∶H7EHEC。
2 结果和讨论
2.1 O157-SPACOA的特异性 ①O157∶H7与E.coli的反应性：用O157-SPA与ETEC(LT44813，ST44814，LT/ST44816)，EIEC(44825)，EPEC，以及40株临床分离的发酵山梨醇的E.coli做O157-SPACOA均呈阴性。②O157-SPA与其它肠道菌的反应性：用O157-SPA与普通变形杆菌、福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、志贺氏I型菌、伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、0-1群和非0-1群霍乱弧菌、副溶血性弧菌、温和气单胞菌、类志贺邻单胞菌及弗劳地枸橼酸杆菌等17种26个菌株，均不发生凝集。
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2.2 O157-SPACOA法的敏感性 用无菌生理盐水(NS)配制EHECO157∶H7菌悬液至8.0,2.0,0.5麦氏比浊度(8×1011/L)，再倍比系列稀释后取10μl菌悬液，加等量O157-SPA试剂做COA。以含1百万个细菌仍可出现“++”特异凝集颗粒者为终点。所获结果与兔抗O157血清IgG(工作浓度1∶20)的玻片凝集试验做比较，敏感性可提高128倍。试验中设生理盐水加O157SPA；O157∶H7加NRSSPA及O157∶H7加1%Cood46菌悬液3项对照，其结果均呈阴性(见表1)。
表1 O157-SPACOA法的敏感性检测 检测方法
麦氏比浊度(亿菌/ml)
8.0
2.0
0.5
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O157:H7+O157-SPA
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血清玻片凝集
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*实际稀释菌数(1011/L)及凝集菌数(106/10μl)依次为：128，32，8，2，1，0.5个
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2.3 O157-SPACOA法的重复性 将经3次传代的3株O157∶H7菌分别配制9份菌悬液(0.5麦氏比浊度)，再与制备的3批O157-SPA试剂(9756＃，97528＃和97725＃)做O157SPACOA，结果均为“4+”的凝集。用10株EHECO157∶H7的菌落，与上述的3批O157-SPA试剂做O157-SPACOA，结果也均为“4+”的凝集。
我室所建立的O157-SPACOA法具有操作简便、快速，结果易于观察，敏感性较血清玻片凝集试验高128倍及特异性强等优点。经对近千份腹泻病人粪便标本的检测，均未出现非特异性凝集。另外，试剂稳定、重复性良好，可望用于EHECO157∶H7的临床检测、基层检疫和流行病学调查。
*国家自然科学基金资助项目，No.3970563
作者简介：汪力亚，女，50岁，副研究员，硕士
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参考文献
[1]Riley LW, Remis RS，Helgerson SD, et al. The hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype. N Engl J Med, 1983; 308: 681～685
[2]李景学，周国清，温宪芹,等.肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7的分离与鉴定.中国人兽共患病杂志，1994;10(6)：23～25
[3]March SB, Ratnam S. Latesx agglutination test for detection of Escherichia coli serotype O157. J Clin Microbiol, 1989; 27(7):1675～1677
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[4]Helge K, Mittmnn CJ, Aleksic S, et al. Isolation of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 strains from patients with hemolytic-uremic syndrome by using immunomagnetic separation, DNA-based methods and direct culture. J Clin Microbiol, 1996; 34(3): 516～519
[5]Ball HJ, Finlay D, Zafar A, et al. The detection of verocytotoxins in bacterial cultures from human diarrhoeal samplles with monoclonal antibody-based ELISAs. J Clin Microbio, 1996; 44(4): 273～276
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[6]Park CH, Hixon DC, Morrison WL, et al. Ripid diagnosis of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 directly from fecal specimens using immunofluorescence staining. Am J Clin Pathol, 1994; 101(1): 91～94
[7]徐建国，黄力保，吴纪民.聚合酶链反应检测出血性大肠埃希菌.中华医学检验杂志，1995;18(4)：225～228
(收稿 1998-04-21 修回 1998-06-17), 百拇医药