抗人IL－5片段单克隆抗体的制备及其活性测定*
作者：史皆然 方佳 孙滨 卢芳 陈常庆
单位：史皆然 孙滨(第四军医大学西京医院呼吸内科,西安710032)；方佳 卢芳 陈常庆(中国科学院上海生物工程研究中心)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990121
根据hIL-5的结构、功能特点，设计并合成了hIL-5羧基端19肽，用以免疫小鼠。经融合、筛选出7株抗hIL-5单克隆抗体(mAb)。利用TF-1细胞对hIL-5依赖生长的特性，采用MTT法〔1〕对mAb进行了活性测定。
1 材料和方法
1.1 动物与细胞 Balb/c小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供；小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0和人红白血病细胞系(TF-1)，由中国科学院上海生物工程研究中心保存。
, 百拇医药
1.2 主要试剂 hIL-5标准品为英国PeproTech公司产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)购于华美公司；IL-5C末端19肽，由中国科学院上海生化所合成。
1.3 mAb的制备 参照文献[2],采用脾内加腹腔免疫，按常规方法融合、筛选及克隆化。
1.4 TF-1最适细胞密度的选择 收集处于对数生长期的TF-1细胞，洗涤3次后，用含10%FCS的RPMI-1640调整细胞数为1.6×1010/L，经倍比稀释后加于96孔培养板，每孔100μl，每个稀释度设3个复孔；每孔再加入10μg/LhIL-5标准品。37℃CO2孵箱中培养60h后，每孔加入20μlMTT液置CO2孵箱中培养4h～6h；每孔加入100μl裂解液过夜，于酶标仪(BIO-RAD)上测定A570nm的光吸收值，选出最适细胞生长密度。
, 百拇医药 1.5 hIL-5最适浓度的选择 将不同稀释度的hIL-5标准品加于96孔培养板，每个稀释度设3个复孔，再每孔加100μl最适细胞密度(2×109/L)的TF-1细胞悬液，同上进行MTT比色测定，选出hIL-5的最适工作浓度。
1.6 mAb对TF-1细胞增殖的抑制作用 将最适TF-1细胞悬液及最适hIL-5工作液，加于96孔培养板，每孔再加入不同稀释度的7株抗hIL-5mAb腹水(每孔20μl)；同时设hIL-5和培养基对照，同法进行MTT比色测定，并计算mAb对TF-1细胞增殖的抑制率。
2 结果
2.1 mAb的制备 以人工合成的19肽为免疫原，进行脾内和腹腔基础免疫，经融合、筛选及克隆化，得到7株抗hIL-5mAb的杂交瘤细胞(1H11，3D6，2H10，3H7，3E12，3G5和3D4)。将7株杂交瘤细胞连续培养2月余，分泌mAb的特性不变，并可在小鼠体内诱生出mAb腹水。
, 百拇医药
2.2 TF-1细胞最适培养密度及hIL-5最佳工作浓度的选择 对不同TF-1细胞密度的MTT比色结果表明，细胞密度增加到一定程度时，受细胞代谢的影响，A570nm反而降低，故选定2.0×109/L为最适细胞密度。不同hIL-5浓度对TF-1细胞的作用结果表明，当hIL-5浓度低于4μg/L时，A570nm开始下降，因此选定8μg/L为hIL-5的最适工作浓度。
2.3 抗hIL-5mAb对TF-1细胞增殖的抑制作用 7株mAb中有5株(2H10,3G5,3D6,1H11和3H7)的阻断抑制率超过50%，分别为81.3%,77.4%,75.6%,67.8%和57.1%(图1)。
图1 7株mAb对TF-1细胞增殖的抑制作用
, http://www.100md.com 3 讨论
IL-5主要由T淋巴细胞产生〔3〕。成熟hIL-5是由两个反向平行的单体以链间二硫键连接而成的同源二聚体。其中1个单体的前3个α螺旋和2个β折叠与另1个单体的第4个α螺旋所组成的Cytokinefold是其与受体相结合的结构基础〔4〕。互换人、鼠IL-5的C末端36个氨基酸后，其生物学活性可发生种属特异性改变，表明IL5与α受体亚基的结合是由其C末端的α螺旋所决定的。针对Met107用CNBr裂解法和氧化法研究发现，hIL-5C末端8个氨基酸是其生物学活性区〔5〕。为此，我们设计、合成了hIL-5C末端19肽，作为抗原替代完整的IL-5分子，制备抗hIL-5的mAb。经细胞融合获得7株对hIL-5具有结合活性的mAb，其中有5株mAb具有抑制TF-1细胞增殖的活性，表明这些mAb具有较好的特异性，为进一步应用打下了良好的基础。
*国家自然科学基金资助项目，No.39470324
, 百拇医药
作者简介：史皆然，男，30岁，主治医师，硕士
西安市长乐西路15号，Tel.(029)3375237
参考文献
[1]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application of class-specific antibody in mouse serum. J Immunol Meth， 1983； 65(1-2):55～64
[2]徐志凯主编.《实用单克隆抗体技术》.西安:陕西科技出版社,1991:51～107
[3]Robinson DS, Durham SR, Kay AB. Cytokines in asthma.Thorax,1993; 48(7): 845～853
, 百拇医药
[4]Michael VM, Anne MH,Millard Hl,et al. Anvel dimmer configuration revealed by the crystal structure at 2,4 a resolution of human interleukin-5. Nature， 1993; 363(13):172～ 176
[5]Metcalf D. The molecular biology and functions of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood,1996;67(2):257～267
[6]Kodama S,Tsuruoka N ,Tsujimoto M. Role of the C-terminus in the biological activity of human interleukin-5.Biochem Biophys Res Commun，1991; 178(2):514～519
(收稿 1998-06-01 修回 1998-07-02), 百拇医药
单位：史皆然 孙滨(第四军医大学西京医院呼吸内科,西安710032)；方佳 卢芳 陈常庆(中国科学院上海生物工程研究中心)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990121
根据hIL-5的结构、功能特点，设计并合成了hIL-5羧基端19肽，用以免疫小鼠。经融合、筛选出7株抗hIL-5单克隆抗体(mAb)。利用TF-1细胞对hIL-5依赖生长的特性，采用MTT法〔1〕对mAb进行了活性测定。
1 材料和方法
1.1 动物与细胞 Balb/c小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供；小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0和人红白血病细胞系(TF-1)，由中国科学院上海生物工程研究中心保存。
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1.2 主要试剂 hIL-5标准品为英国PeproTech公司产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)购于华美公司；IL-5C末端19肽，由中国科学院上海生化所合成。
1.3 mAb的制备 参照文献[2],采用脾内加腹腔免疫，按常规方法融合、筛选及克隆化。
1.4 TF-1最适细胞密度的选择 收集处于对数生长期的TF-1细胞，洗涤3次后，用含10%FCS的RPMI-1640调整细胞数为1.6×1010/L，经倍比稀释后加于96孔培养板，每孔100μl，每个稀释度设3个复孔；每孔再加入10μg/LhIL-5标准品。37℃CO2孵箱中培养60h后，每孔加入20μlMTT液置CO2孵箱中培养4h～6h；每孔加入100μl裂解液过夜，于酶标仪(BIO-RAD)上测定A570nm的光吸收值，选出最适细胞生长密度。
, 百拇医药 1.5 hIL-5最适浓度的选择 将不同稀释度的hIL-5标准品加于96孔培养板，每个稀释度设3个复孔，再每孔加100μl最适细胞密度(2×109/L)的TF-1细胞悬液，同上进行MTT比色测定，选出hIL-5的最适工作浓度。
1.6 mAb对TF-1细胞增殖的抑制作用 将最适TF-1细胞悬液及最适hIL-5工作液，加于96孔培养板，每孔再加入不同稀释度的7株抗hIL-5mAb腹水(每孔20μl)；同时设hIL-5和培养基对照，同法进行MTT比色测定，并计算mAb对TF-1细胞增殖的抑制率。
2 结果
2.1 mAb的制备 以人工合成的19肽为免疫原，进行脾内和腹腔基础免疫，经融合、筛选及克隆化，得到7株抗hIL-5mAb的杂交瘤细胞(1H11，3D6，2H10，3H7，3E12，3G5和3D4)。将7株杂交瘤细胞连续培养2月余，分泌mAb的特性不变，并可在小鼠体内诱生出mAb腹水。
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2.2 TF-1细胞最适培养密度及hIL-5最佳工作浓度的选择 对不同TF-1细胞密度的MTT比色结果表明，细胞密度增加到一定程度时，受细胞代谢的影响，A570nm反而降低，故选定2.0×109/L为最适细胞密度。不同hIL-5浓度对TF-1细胞的作用结果表明，当hIL-5浓度低于4μg/L时，A570nm开始下降，因此选定8μg/L为hIL-5的最适工作浓度。
2.3 抗hIL-5mAb对TF-1细胞增殖的抑制作用 7株mAb中有5株(2H10,3G5,3D6,1H11和3H7)的阻断抑制率超过50%，分别为81.3%,77.4%,75.6%,67.8%和57.1%(图1)。
图1 7株mAb对TF-1细胞增殖的抑制作用
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IL-5主要由T淋巴细胞产生〔3〕。成熟hIL-5是由两个反向平行的单体以链间二硫键连接而成的同源二聚体。其中1个单体的前3个α螺旋和2个β折叠与另1个单体的第4个α螺旋所组成的Cytokinefold是其与受体相结合的结构基础〔4〕。互换人、鼠IL-5的C末端36个氨基酸后，其生物学活性可发生种属特异性改变，表明IL5与α受体亚基的结合是由其C末端的α螺旋所决定的。针对Met107用CNBr裂解法和氧化法研究发现，hIL-5C末端8个氨基酸是其生物学活性区〔5〕。为此，我们设计、合成了hIL-5C末端19肽，作为抗原替代完整的IL-5分子，制备抗hIL-5的mAb。经细胞融合获得7株对hIL-5具有结合活性的mAb，其中有5株mAb具有抑制TF-1细胞增殖的活性，表明这些mAb具有较好的特异性，为进一步应用打下了良好的基础。
*国家自然科学基金资助项目，No.39470324
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作者简介：史皆然，男，30岁，主治医师，硕士
西安市长乐西路15号，Tel.(029)3375237
参考文献
[1]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application of class-specific antibody in mouse serum. J Immunol Meth， 1983； 65(1-2):55～64
[2]徐志凯主编.《实用单克隆抗体技术》.西安:陕西科技出版社,1991:51～107
[3]Robinson DS, Durham SR, Kay AB. Cytokines in asthma.Thorax,1993; 48(7): 845～853
, 百拇医药
[4]Michael VM, Anne MH,Millard Hl,et al. Anvel dimmer configuration revealed by the crystal structure at 2,4 a resolution of human interleukin-5. Nature， 1993; 363(13):172～ 176
[5]Metcalf D. The molecular biology and functions of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood,1996;67(2):257～267
[6]Kodama S,Tsuruoka N ,Tsujimoto M. Role of the C-terminus in the biological activity of human interleukin-5.Biochem Biophys Res Commun，1991; 178(2):514～519
(收稿 1998-06-01 修回 1998-07-02), 百拇医药