分泌抗人角蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定*
作者：张亮 刘玉峰 刘彦仿 张素珍 赵小东 李承新 兰风华
单位：张亮 刘玉峰 赵小东 李承新 兰风华(第四军医大学西京医院皮肤科,西安710032)；刘彦仿 张素珍(第四军医大学西京医院病理学教研室单克隆抗体室,西安710032)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990120
角蛋白(keratin)作为一组相对分子质量(Mr)为40000～70000不溶于水的细胞结构蛋白,在上皮细胞的发生、分化成熟过程中逐渐形成,是所有哺乳动物细胞骨架的中间丝之一,其组成因不同上皮而异。近年来,随着分子生物学技术的推广和应用,角蛋白的基础研究得到了不断深化;同时采用多种特异性抗角蛋白的mAb进行皮肤病的临床研究,也取得很大的进展。本实验选用从剥脱性皮炎型药疹患者皮屑中提取的角蛋白免疫动物,制备出3株抗人角蛋白的mAb,并对其进行了鉴定。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 角蛋白的提取 取剥脱性皮炎型药疹患者的皮屑,按常规方法提取角蛋白,以SDS-PAGE进行鉴定。
1.2 杂交瘤细胞株的建立 将提取的角蛋白浓度调至0.2g/L,加弗氏佐剂。经背部皮下多点加腹腔注射免疫Balb/c小鼠,共3次,每次间隔4周,于融合前3d,腹腔注射角蛋白加强免疫。以常规方法进行融合、筛选、克隆化及制备腹水。
1.3 mAb的鉴定
1.3.1 Ig亚类测定将阳性克隆培养上清浓缩10倍,用免疫双扩散法测定。所用系列兔抗鼠Ig血清,购自上海生物制品研究所。
1.3.2 mAb的特异性鉴定①免疫组化染色:应用SABC法分析mAb与正常人体组织的反应性。即取新鲜组织经4%多聚甲醛固定3h,低温石蜡包埋切片。以SABC试剂盒(武汉博士德生物工程公司产品)进行免疫组化染色。同时设以Sp2/0细胞诱生的腹水代替第一抗体作为阴性对照,以无关抗体作为替代对照。②免疫转印:将上述按常规方法提取的角蛋白及从高钙无血清条件下培养的角朊细胞中提取的角蛋白,经SDSPAGE分离后,再按常规方法转移至硝酸纤维膜上,依次用酪蛋白封闭、加各株mAb杂交瘤细胞培养上清(1∶10)与膜反应,以及用4氯萘酚系统显色。
, 百拇医药
2 结果
2.1 角蛋白的鉴定 SDS-PAGE的结果显示,按常规方法提取的角蛋白有6条带,其Mr为:63000,58000,56000,52500,50000和48000(图1)。
图1 抗人角蛋白mAb5G5和1A3C5对正常人表皮的免疫组化染色(×400)
A:mAb5G5的免疫组化染色;B:mAb1A3C5的免疫组化染色
2.2 杂交瘤细胞系的建立 融合后9d，肉眼可见生长的克隆,融合率为86%。共获得3株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞,命名为DHD,1A3C5和5G5。
2.3mAb的特性鉴定
, 百拇医药
2.3.1 mAb的Ig亚类mAbDHD和1A3C5为IgG1;mAb5G5为IgG2b。
2.3.2 免疫组化染色mAb5G5和1A3C5可特异地结合于正常人表皮,其中mAb5G5仅与正常表皮的基底层反应;mAb1A3C5可与棘层和颗粒层起反应(图1)。mAbDHD除可与正常表皮反应外,还可与肝脏、胰岛、结肠上皮和支气管柱状上皮等不同来源的上皮及腺体组织起反应。设立的各种对照结果均呈阴性。
2.3.3 免疫转印3株mAb对药疹患者的皮屑角蛋白及培养的角朊细胞角蛋白都有不同程度的识别,mAbDHD可以识别Mr为63000,58000,56000和52000的4条角蛋白带;mAb5G5可识别Mr50000和48000的2条角蛋白带;mAb1A3C5可识别Mr为63000,58000,56000,48000和46000的5条角蛋白带。其中在培养的角朊细胞角蛋白转印图中,Mr为63000,56000和50000的3条角蛋白带可被识别(图2)。
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图2 3株抗人角蛋白mAb的免疫转印分析
A:药疹患者皮屑角蛋白;B:培养的角朊细胞角蛋白
3 讨论
角蛋白作为一组广泛存在于上皮细胞的中间丝蛋白,其组成极其复杂。根据Moll等[2]的分类方法,来源于上皮的角蛋白至少有20种,它们在不同的正常上皮组织及病变组织中分布各有差异。角蛋白在正常表皮的分布:基底层为Mr较小的角蛋白K5/K14,而棘层、颗粒层至角质层为Mr相对较大的角蛋白K1/K10;但在某些增生性皮肤病中,基底层以上角朊细胞同时含有小Mr的角蛋白组分〔3〕,并且大Mr的角蛋白组分K1/K10逐渐被代表表皮过度增殖的K6/K16所代替〔4〕。我们选用这种患者的皮屑提取角蛋白尚未见有文献报道。经SDSPAGE鉴定,提取的角蛋白主要由Mr为63000(K3),58000(K5),56000(K6),52500(K8),50000(K14)和48000(K16)6条带组成,提示在过度增殖的表皮皮屑中,小Mr的角蛋白组分含量明显高于大Mr的角蛋白组分,并表明过度增殖的角蛋白K6/K16呈明显表达。
, http://www.100md.com
另外,3株mAb各自的免疫组化和免疫转印结果基本一致。mAb5G5可以识别Mr为50000(K14)的角蛋白,特异地与正常表皮基底层起反应;mAb1A3C5和DHD可识别大Mr的角蛋白,特异的与正常表皮棘层和颗粒细胞层起反应。mAb5G5和1A3C5仅特异地与表皮起反应,而mAbDHD除与表皮起反应外,还与肝脏等其它上皮及腺体来源的组织起反应,这是由于mAbDHD可识别Mr为52500(K8)的角蛋白,K8为肝脏及单层上皮细胞的标志蛋白〔2〕。值得注意的是,mAbDHD和1A3C5还可识别Mr为56000(K6)的角蛋白;mAb5G5和1A3C5可识别Mr为48000(K16)的角蛋白,同时mAb1A3C5还可识别Mr为46000(K17)的角蛋白,而K6/K16和K17在正常皮肤中不表达,仅在体外培养的角朊细胞和银屑病等增生性皮肤病中表达[5]。Vogel等[6]称K17为银屑病相关性细胞角蛋白。因此,我们认为，mAbDHD,5G5和1A3C5可用来进行银屑病等增生性皮肤病的病理诊断及其角蛋白组分的研究,同时还可对体外不同培养条件下的角朊细胞进行基础研究。目前我们正在对3株mAb的特性做进一步地分析研究,预期它们将在基础研究和临床病理诊断方面，显示出广泛的应用价值。
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助项目，No.39670625
作者简介:张亮,男,30岁,硕士生
西安市长乐西路15号,Tel.(029)3375410
参考文献
[1]Pas HH, De Jong MCJM, Jonkman MF, et al. Bullous pemphigoid: serum antibody titre and antigen specificity. Exp Dermatol, 1995; 4: 372～376
[2]Moll R, Franke WW, Schiller DL. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell, 1982; 31: 11～14
, 百拇医药
[3]陈懿德,姜志辉,王婕.六种增生性皮肤病表皮中角蛋白组分的检测.中华皮肤科杂志,1993;26:29～31
[4]Thewes M, Stabler R, Korge B，et al. Normal psoriatic epidermis expression of hyperproliferation associated keratins. Arch Dermatol Res, 1991; 283: 465～471
[5]Leigh IM, Navsaria H, Purkis PE，et al. Keratins (K16 and K17) as markers of keratinocyte hyperproliferation in psoriasis in vivo and in vitro. Br J Dermatol, 1995; 133: 501～510
[6]Vogel U, Denecke B, Troyanovsky SM，et al. Transcriptional activation of psoriasis-associated cytokeratin K17 by interferon-gamma. analysis of gamma-interferon activation sites. Eur J Biochem, 1995； 227：143～148
(收稿 1998-01-13 修回 1998-03-18), 百拇医药
单位：张亮 刘玉峰 赵小东 李承新 兰风华(第四军医大学西京医院皮肤科,西安710032)；刘彦仿 张素珍(第四军医大学西京医院病理学教研室单克隆抗体室,西安710032)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990120
角蛋白(keratin)作为一组相对分子质量(Mr)为40000～70000不溶于水的细胞结构蛋白,在上皮细胞的发生、分化成熟过程中逐渐形成,是所有哺乳动物细胞骨架的中间丝之一,其组成因不同上皮而异。近年来,随着分子生物学技术的推广和应用,角蛋白的基础研究得到了不断深化;同时采用多种特异性抗角蛋白的mAb进行皮肤病的临床研究,也取得很大的进展。本实验选用从剥脱性皮炎型药疹患者皮屑中提取的角蛋白免疫动物,制备出3株抗人角蛋白的mAb,并对其进行了鉴定。
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1 材料和方法
1.1 角蛋白的提取 取剥脱性皮炎型药疹患者的皮屑,按常规方法提取角蛋白,以SDS-PAGE进行鉴定。
1.2 杂交瘤细胞株的建立 将提取的角蛋白浓度调至0.2g/L,加弗氏佐剂。经背部皮下多点加腹腔注射免疫Balb/c小鼠,共3次,每次间隔4周,于融合前3d,腹腔注射角蛋白加强免疫。以常规方法进行融合、筛选、克隆化及制备腹水。
1.3 mAb的鉴定
1.3.1 Ig亚类测定将阳性克隆培养上清浓缩10倍,用免疫双扩散法测定。所用系列兔抗鼠Ig血清,购自上海生物制品研究所。
1.3.2 mAb的特异性鉴定①免疫组化染色:应用SABC法分析mAb与正常人体组织的反应性。即取新鲜组织经4%多聚甲醛固定3h,低温石蜡包埋切片。以SABC试剂盒(武汉博士德生物工程公司产品)进行免疫组化染色。同时设以Sp2/0细胞诱生的腹水代替第一抗体作为阴性对照,以无关抗体作为替代对照。②免疫转印:将上述按常规方法提取的角蛋白及从高钙无血清条件下培养的角朊细胞中提取的角蛋白,经SDSPAGE分离后,再按常规方法转移至硝酸纤维膜上,依次用酪蛋白封闭、加各株mAb杂交瘤细胞培养上清(1∶10)与膜反应,以及用4氯萘酚系统显色。
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2 结果
2.1 角蛋白的鉴定 SDS-PAGE的结果显示,按常规方法提取的角蛋白有6条带,其Mr为:63000,58000,56000,52500,50000和48000(图1)。
图1 抗人角蛋白mAb5G5和1A3C5对正常人表皮的免疫组化染色(×400)
A:mAb5G5的免疫组化染色;B:mAb1A3C5的免疫组化染色
2.2 杂交瘤细胞系的建立 融合后9d，肉眼可见生长的克隆,融合率为86%。共获得3株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞,命名为DHD,1A3C5和5G5。
2.3mAb的特性鉴定
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2.3.1 mAb的Ig亚类mAbDHD和1A3C5为IgG1;mAb5G5为IgG2b。
2.3.2 免疫组化染色mAb5G5和1A3C5可特异地结合于正常人表皮,其中mAb5G5仅与正常表皮的基底层反应;mAb1A3C5可与棘层和颗粒层起反应(图1)。mAbDHD除可与正常表皮反应外,还可与肝脏、胰岛、结肠上皮和支气管柱状上皮等不同来源的上皮及腺体组织起反应。设立的各种对照结果均呈阴性。
2.3.3 免疫转印3株mAb对药疹患者的皮屑角蛋白及培养的角朊细胞角蛋白都有不同程度的识别,mAbDHD可以识别Mr为63000,58000,56000和52000的4条角蛋白带;mAb5G5可识别Mr50000和48000的2条角蛋白带;mAb1A3C5可识别Mr为63000,58000,56000,48000和46000的5条角蛋白带。其中在培养的角朊细胞角蛋白转印图中,Mr为63000,56000和50000的3条角蛋白带可被识别(图2)。
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图2 3株抗人角蛋白mAb的免疫转印分析
A:药疹患者皮屑角蛋白;B:培养的角朊细胞角蛋白
3 讨论
角蛋白作为一组广泛存在于上皮细胞的中间丝蛋白,其组成极其复杂。根据Moll等[2]的分类方法,来源于上皮的角蛋白至少有20种,它们在不同的正常上皮组织及病变组织中分布各有差异。角蛋白在正常表皮的分布:基底层为Mr较小的角蛋白K5/K14,而棘层、颗粒层至角质层为Mr相对较大的角蛋白K1/K10;但在某些增生性皮肤病中,基底层以上角朊细胞同时含有小Mr的角蛋白组分〔3〕,并且大Mr的角蛋白组分K1/K10逐渐被代表表皮过度增殖的K6/K16所代替〔4〕。我们选用这种患者的皮屑提取角蛋白尚未见有文献报道。经SDSPAGE鉴定,提取的角蛋白主要由Mr为63000(K3),58000(K5),56000(K6),52500(K8),50000(K14)和48000(K16)6条带组成,提示在过度增殖的表皮皮屑中,小Mr的角蛋白组分含量明显高于大Mr的角蛋白组分,并表明过度增殖的角蛋白K6/K16呈明显表达。
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另外,3株mAb各自的免疫组化和免疫转印结果基本一致。mAb5G5可以识别Mr为50000(K14)的角蛋白,特异地与正常表皮基底层起反应;mAb1A3C5和DHD可识别大Mr的角蛋白,特异的与正常表皮棘层和颗粒细胞层起反应。mAb5G5和1A3C5仅特异地与表皮起反应,而mAbDHD除与表皮起反应外,还与肝脏等其它上皮及腺体来源的组织起反应,这是由于mAbDHD可识别Mr为52500(K8)的角蛋白,K8为肝脏及单层上皮细胞的标志蛋白〔2〕。值得注意的是,mAbDHD和1A3C5还可识别Mr为56000(K6)的角蛋白;mAb5G5和1A3C5可识别Mr为48000(K16)的角蛋白,同时mAb1A3C5还可识别Mr为46000(K17)的角蛋白,而K6/K16和K17在正常皮肤中不表达,仅在体外培养的角朊细胞和银屑病等增生性皮肤病中表达[5]。Vogel等[6]称K17为银屑病相关性细胞角蛋白。因此,我们认为，mAbDHD,5G5和1A3C5可用来进行银屑病等增生性皮肤病的病理诊断及其角蛋白组分的研究,同时还可对体外不同培养条件下的角朊细胞进行基础研究。目前我们正在对3株mAb的特性做进一步地分析研究,预期它们将在基础研究和临床病理诊断方面，显示出广泛的应用价值。
, 百拇医药
*国家自然科学基金资助项目，No.39670625
作者简介:张亮,男,30岁,硕士生
西安市长乐西路15号,Tel.(029)3375410
参考文献
[1]Pas HH, De Jong MCJM, Jonkman MF, et al. Bullous pemphigoid: serum antibody titre and antigen specificity. Exp Dermatol, 1995; 4: 372～376
[2]Moll R, Franke WW, Schiller DL. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell, 1982; 31: 11～14
, 百拇医药
[3]陈懿德,姜志辉,王婕.六种增生性皮肤病表皮中角蛋白组分的检测.中华皮肤科杂志,1993;26:29～31
[4]Thewes M, Stabler R, Korge B，et al. Normal psoriatic epidermis expression of hyperproliferation associated keratins. Arch Dermatol Res, 1991; 283: 465～471
[5]Leigh IM, Navsaria H, Purkis PE，et al. Keratins (K16 and K17) as markers of keratinocyte hyperproliferation in psoriasis in vivo and in vitro. Br J Dermatol, 1995; 133: 501～510
[6]Vogel U, Denecke B, Troyanovsky SM，et al. Transcriptional activation of psoriasis-associated cytokeratin K17 by interferon-gamma. analysis of gamma-interferon activation sites. Eur J Biochem, 1995； 227：143～148
(收稿 1998-01-13 修回 1998-03-18), 百拇医药