肝癌细胞间隙连接蛋白Cx32，Cx43的流式细胞仪分析
作者：马向东 隋延仿 王文亮 徐力青
单位：马向东 隋延仿 王文亮 徐力青(第四军医大学病理学教研室,西安710032)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990116
细胞间隙连接(gapjunction)基因是最近发现的另一类非突变型抑癌基因[1]。通过该基因表达的蛋白产物—间隙连接蛋白(connexin,Cx)所构成的间隙连接通道，进行相邻细胞间能量和信息的传递,在细胞生长、分化控制中起重要的作用[2]。同时，Cx表达的降低与多种肿瘤的形成及恶性程度相关[3]。我们对其中Cx32，Cx43与肝癌细胞发生的关系进行了研究。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 细胞系 人肝癌细胞系HHCC，SMMC-7721及正常人肝细胞系QZG，由中国科学院上海细胞生物所提供。以含100ml/L热灭活胎牛血清(美国Gibco公司)、1×105IU/L青霉素及1×105IU/L链霉素的RPMI-1640培养液(美国Gibco公司)常规培养。
1.2 抗体 小鼠抗人Cx32mAb及小鼠抗人Cx43 mAb 为美国 Zymed 公司产品。FITC标记的羊抗鼠mAb IgG，为美国Zymed公司产品。FITC无关小鼠购于北京中山公司。
1.3 间接免疫荧光染色 ①收集1×109/LHHCC，SMMC-7721和QZG细胞，分别加入20ml/L正常山羊血清的RPMI-1640培养液，于4℃封闭30min。②分别加入过量抗Cx32mAb，抗Cx43mAb；QZG细胞加入无关小鼠mAbIgG作为阴性对照，4℃孵育30min，以0.01mol/LPBS洗2次。③加入1∶100FITC标记的羊抗鼠mAbIgG，4℃孵育30min，以0.01mol/LPBS洗2次。
, 百拇医药
1.4 流式细胞仪分析 将细胞制成500μl单细胞悬液，过300目筛网，用ELITEESP流式细胞仪(美国Coulter公司)进行抗原检测。
2 结果
HHCC，SMMC-7721和QZG细胞中，Cx32，Cx43蛋白的免疫荧光检测结果见图1～3。QZG细胞加入无关小鼠 mAbIgG的阴性对照，细胞无阳性表达。Cx32和Cx43蛋白阳性细胞计数率的比较，结果见表1。
表1 3种细胞系Cx32，Cx43蛋白阳性细胞计数(%) 细胞系
阳性细胞计数率(%)
Cx32
Cx43
HHCC
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1.9
7.3
SMMC-7721
1.7
2.3
QZG
99.0*
99.1*
*与HHCC及SMMC-7721相比较，P<0.01
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图1 HHCC细胞Cx32和Cx43的流式细胞仪检测
A:为Cx32蛋白阳性细胞计数率1.9%;B:为Cx43蛋白阳性细胞计数率7.3%
图2 SMMC-7721细胞Cx32和Cx43的流式细胞仪检测
A:为Cx32蛋白阳性细胞计数率1.7%；B：为Cx43蛋白阳性细胞计数率2.3%
图3 QZG细胞Cx32和Cx43的流式细胞仪检测
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A:为Cx32蛋白阳性细胞计数率99.0%；B：为Cx43蛋白阳性细胞计数率99.1%
3 讨论
间隙连接几乎存在于哺乳动物的所有组织、细胞中。目前已克隆出该基因家族中至少有13个成员，其基因序列有高度同源性，其在各组织、细胞间的表达，既有组织特异性，又有交叉反应性〔4〕。近来研究发现，多种肿瘤细胞不存在或仅有较弱水平的Cx表达[5]。Cx32和Cx43基因是与肝细胞密切相关的连接基因，二者在正常肝细胞系QZG中的高表达(分别为99.0%和99.1%)产物，对正常肝细胞功能的维持起主要作用。Cx32和Cx43蛋白在肝癌细胞系中的表达显著减少，HHCC中仅为1.9%和7.3%；SMMC7721中仅为1.7%和2.3%，与正常肝细胞中的高表达存在显著性差异(P<0.01) 。以上结果充分说明，连接蛋白基因Cx32和Cx43表达的降低可导致细胞间隙连接通讯(gap junction intercellular communication, GJIC)的减弱或消失，使癌细胞失去正常的生长控制，与肝细胞癌的形成密切相关，很可能是肝细胞癌形成的重要分子机制。
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作者简介：马向东，女，28岁，住院医师，博士生
西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374547
参考文献
[1]Krutovskikh V, Mazzoleni G, Mironov N,et al. Altered homologous and heterologous gap-junction intecellular communication in primary human liver tumors associated with aberrant protein localization but not gene mutation of connexin 32. Int J Cancer, 1994;54: 87～94
[2]Kumar NN, Gilula NB. The gap junction communication channel. Cell, 1996; 84: 381～388
, 百拇医药
[3]Holder JW, Elmope E, Barrett JC. Gap junction function and cancer. Cancer Res, 1993; 53: 3475～3485
[4]Haefliger JA, Bruzzone R, Jenkins NA，et al. Four novel members of the connexin family of gap junction proteins. J Biol Chem,1992; 267(3): 2057～2064
[5]Tsuda H, Asamoto M, Baba H,et al. Cell proliferation and advancement of hepatocarcinogenesis in the rat are associated with a decrease in connexin 32 expression. Carcinogenesis,1995;16(1): 101～105
(收稿 1998-04-22 修回 1998-05-20), http://www.100md.com
单位：马向东 隋延仿 王文亮 徐力青(第四军医大学病理学教研室,西安710032)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990116
细胞间隙连接(gapjunction)基因是最近发现的另一类非突变型抑癌基因[1]。通过该基因表达的蛋白产物—间隙连接蛋白(connexin,Cx)所构成的间隙连接通道，进行相邻细胞间能量和信息的传递,在细胞生长、分化控制中起重要的作用[2]。同时，Cx表达的降低与多种肿瘤的形成及恶性程度相关[3]。我们对其中Cx32，Cx43与肝癌细胞发生的关系进行了研究。
1 材料和方法
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1.1 细胞系 人肝癌细胞系HHCC，SMMC-7721及正常人肝细胞系QZG，由中国科学院上海细胞生物所提供。以含100ml/L热灭活胎牛血清(美国Gibco公司)、1×105IU/L青霉素及1×105IU/L链霉素的RPMI-1640培养液(美国Gibco公司)常规培养。
1.2 抗体 小鼠抗人Cx32mAb及小鼠抗人Cx43 mAb 为美国 Zymed 公司产品。FITC标记的羊抗鼠mAb IgG，为美国Zymed公司产品。FITC无关小鼠购于北京中山公司。
1.3 间接免疫荧光染色 ①收集1×109/LHHCC，SMMC-7721和QZG细胞，分别加入20ml/L正常山羊血清的RPMI-1640培养液，于4℃封闭30min。②分别加入过量抗Cx32mAb，抗Cx43mAb；QZG细胞加入无关小鼠mAbIgG作为阴性对照，4℃孵育30min，以0.01mol/LPBS洗2次。③加入1∶100FITC标记的羊抗鼠mAbIgG，4℃孵育30min，以0.01mol/LPBS洗2次。
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1.4 流式细胞仪分析 将细胞制成500μl单细胞悬液，过300目筛网，用ELITEESP流式细胞仪(美国Coulter公司)进行抗原检测。
2 结果
HHCC，SMMC-7721和QZG细胞中，Cx32，Cx43蛋白的免疫荧光检测结果见图1～3。QZG细胞加入无关小鼠 mAbIgG的阴性对照，细胞无阳性表达。Cx32和Cx43蛋白阳性细胞计数率的比较，结果见表1。
表1 3种细胞系Cx32，Cx43蛋白阳性细胞计数(%) 细胞系
阳性细胞计数率(%)
Cx32
Cx43
HHCC
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1.9
7.3
SMMC-7721
1.7
2.3
QZG
99.0*
99.1*
*与HHCC及SMMC-7721相比较，P<0.01
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图1 HHCC细胞Cx32和Cx43的流式细胞仪检测
A:为Cx32蛋白阳性细胞计数率1.9%;B:为Cx43蛋白阳性细胞计数率7.3%
图2 SMMC-7721细胞Cx32和Cx43的流式细胞仪检测
A:为Cx32蛋白阳性细胞计数率1.7%；B：为Cx43蛋白阳性细胞计数率2.3%
图3 QZG细胞Cx32和Cx43的流式细胞仪检测
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A:为Cx32蛋白阳性细胞计数率99.0%；B：为Cx43蛋白阳性细胞计数率99.1%
3 讨论
间隙连接几乎存在于哺乳动物的所有组织、细胞中。目前已克隆出该基因家族中至少有13个成员，其基因序列有高度同源性，其在各组织、细胞间的表达，既有组织特异性，又有交叉反应性〔4〕。近来研究发现，多种肿瘤细胞不存在或仅有较弱水平的Cx表达[5]。Cx32和Cx43基因是与肝细胞密切相关的连接基因，二者在正常肝细胞系QZG中的高表达(分别为99.0%和99.1%)产物，对正常肝细胞功能的维持起主要作用。Cx32和Cx43蛋白在肝癌细胞系中的表达显著减少，HHCC中仅为1.9%和7.3%；SMMC7721中仅为1.7%和2.3%，与正常肝细胞中的高表达存在显著性差异(P<0.01) 。以上结果充分说明，连接蛋白基因Cx32和Cx43表达的降低可导致细胞间隙连接通讯(gap junction intercellular communication, GJIC)的减弱或消失，使癌细胞失去正常的生长控制，与肝细胞癌的形成密切相关，很可能是肝细胞癌形成的重要分子机制。
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作者简介：马向东，女，28岁，住院医师，博士生
西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374547
参考文献
[1]Krutovskikh V, Mazzoleni G, Mironov N,et al. Altered homologous and heterologous gap-junction intecellular communication in primary human liver tumors associated with aberrant protein localization but not gene mutation of connexin 32. Int J Cancer, 1994;54: 87～94
[2]Kumar NN, Gilula NB. The gap junction communication channel. Cell, 1996; 84: 381～388
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[3]Holder JW, Elmope E, Barrett JC. Gap junction function and cancer. Cancer Res, 1993; 53: 3475～3485
[4]Haefliger JA, Bruzzone R, Jenkins NA，et al. Four novel members of the connexin family of gap junction proteins. J Biol Chem,1992; 267(3): 2057～2064
[5]Tsuda H, Asamoto M, Baba H,et al. Cell proliferation and advancement of hepatocarcinogenesis in the rat are associated with a decrease in connexin 32 expression. Carcinogenesis,1995;16(1): 101～105
(收稿 1998-04-22 修回 1998-05-20), http://www.100md.com