磁性免疫微球的合成及其在基因重组IL-2纯化中的应用
作者：郭立安 陈万录 朱宝泉 陈代杰
单位：郭立安 陈万录(第四军医大学中心实验室，西安710032)；朱宝泉 陈代杰(上海医药工业研究院)
关键词：磁性分离；IL-2；亲和色谱；磁性免疫微球
细胞与分子免疫学杂志990114
摘要 本文在合成Fe3O4磁性材料的基础上，制备出agarose-Fe3O4磁性载体微球，并通过优化合成条件，建立了一套制备磁性微球的合成方法。将其与抗rhIL-2单克隆抗体(mAb)连接制备的免疫磁性微球一步纯化rhIL-2后,经SDS-PAGE、光密度扫描和CTLL细胞活性测定表明，纯度为
93%，活性回收率为80%，比活性为2.0×109IU/g蛋白质。结果说明磁性免疫微球不失为一种简单、快速分离蛋白质的方法。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类号 Q511
Synthesis of immunomagnetic microsphere and its separation for recombinant human IL-2
Guo Li ’an， Chen Wanlu， Zhu Baoquan1 Chen Daijie1 ( Central Laboratory, the Fourth Military Medical University, Xi 'an 710032)
Keywords magnetic separation IL-2 affinity separation immunomagnetic microsphere
Abstract The synthesis of immunomagnetic microsphere(IMMS)of monoclonal antibodies (mAb) to recombinant human IL-2 (rhIL-2) as ligand bounded to Fe3O4-agarose magnetic microsphere (MMS) and separation for rhIL-2 from suspension of inclusion body have been studied in this paper. The magnetic microsphere was prepared by physical wrapper encirclement. After reaction, the magnetic powers were enveloped in the middle of agarose. And then, magnetic microsphere was coupled with anti-rhIL-2 mAbs to form immunomagnetic microsphere. The coupling methods of mAb with MMS were CNBr methods. The IMMS was used to separate rhIL-2 from suspension of inclusion body. The purity of rhIL-2 purified by one step reached 93% , specific activity 2.0× 106IU/mg protein, ratio of activity 80%.
, 百拇医药
There are two main advantages of IMMS in separating protein. First, this method can separate protein from suspension. Second, it is very simple and fast.
磁性免疫微球(IMMS)是近年研究的一类新型功能性材料，它是在磁性微球(MMS)载体表面通过化学或物理方法连接上具有一定免疫活性的物质作为配体而研制成的；又因其具有磁性，因此可在外加磁场的作用下,方便地进行分离同配体相对应的分子。磁性免疫微球目前已应用于细胞标记、细胞分离、临床PCR检测和肿瘤导向治疗等的研究[1～3〕,但用于蛋白质分离的方面研究较少。为此，我们在合成磁性载体的基础上，建立了一套制备磁性免疫微球的方法，并首次成功地研制出抗rhIL-2mAb磁性免疫微球，经对rhIL-2的包涵体裂解液进行一步纯化获得了结果的满意。
, http://www.100md.com 1 材料和方法
1.1 试剂及仪器 浓NH3·H2O(西安化学试剂厂)，FeCl2·4H2O(北京57601化工厂)，FeCl3·6H2O(天津市耀华化工厂)；rhIL-2包涵体裂解液粗品和抗rhIL-2mAb(本校免疫学教研室惠赠)；琼脂糖(上海东海制药厂，电泳用品)。D25电动搅拌机(杭州微电机厂)；扫描电镜(S-520,Hitachi)；Olympus倒置显微镜(Tokyo)；薄层扫描仪(Shimazu)。
1.2 Fe3O4顺磁性材料的合成分别称取12gFeCl2·4H2O和12gFeCl3·6H2O配成150ml溶液。在反应瓶中混匀后，置于水浴锅中，加热70℃，边搅拌边快速滴加浓NH3·H2O55ml，于10min内完成反应。生成的黑色沉淀用磁铁或离心进行快速分离，用蒸馏水洗涤4次，最后离心、收集磁性液体，4℃冰箱保存备用。合成的磁性颗粒用扫描电镜观察，直径大小约为0.3μm左右。
, 百拇医药
1.3 磁性agarose载体的合成 按表1中的条件进行。
表1 合成MMS的条件
Tab 1 Synthetical conditions of MMS Type
of mms
agarose
(g)
magnetic
(g)
H2O
(ml)
C7H8
, http://www.100md.com
(ml)
CCl4
(ml)
Span
(ml)
Type of
flask
rpm
MMS0
4.5
1.0
50
75
, http://www.100md.com
25
0.25
triangle
1000
MMS1
3.0
1.0
50
75
25
0.25
triangle
1000
, 百拇医药
MMS2
1.5
1.0
50
75
25
0.25
triangle
1000
MMS3
1.5
0.5
25
, http://www.100md.com
75
25
0.25
triangle
1000
MMS4
1.5
0.5
25
75
25
0.50
triangle
, 百拇医药
1000
MMS5
1.5
0.5
25
75
25
500ml
1000
MMS6
3.0
1.0
50
, http://www.100md.com
75
25
0.25
500ml
1000
MMS7
3.0
1.0
50
75
25
500ml
1000
, 百拇医药
MMS8
3.0
1.0
50
75
25
0.5
250ml
1000
MMS9
3.0
1.0
50
, 百拇医药
75
25
0.25
250ml
1000
MMS10
3.0
1.0
50
75
25
250ml
1000
, 百拇医药
MMS11
3.0
1.0
50
75
25
0.25
250ml
500
MMS12
3.0
1.0
50
, 百拇医药
75
25
0.25
250ml
1000
MMS13
3.0
1.0
50
75
25
0.25
250ml
, 百拇医药
1500
1.4 抗IL-2mAb与磁性微球的偶联 采用CNBr活化法。取5mlMMS在布氏漏斗上用蒸馏水充分洗涤后，加入1/10MMS体积的5mol/L磷酸缓冲液(每升含3.33mol/LK3PO4和1.67mol/LKH2PO4)混合，置冰水浴中预冷。另按每毫升MMS加200mgCNBr称取固体CNBr，加入少量蒸馏水，在电磁搅拌器上搅拌使之完全溶解。然后在电磁搅拌并在冰浴冷却的情况下，向MMS中滴加CNBr液，在2min内加完。并在冰浴下继续搅拌8min，整个活化过程中pH应维持在11～12之间。搅拌结束后，在布氏漏斗上抽滤，并迅速用预冷蒸馏水(为MMS体积的10倍量)和0.1mol/LNaHCO3(为MMS体积的5倍量)洗涤，于90s内完成。洗涤后的MMS转移到盛有60mg抗IL-2mAb的烧杯中。
活化的MMS与其配体混合后，在冰浴中继续搅拌10h，搅拌速度应很缓慢约60r/min，以防止MMS的破碎。然后在4℃过夜，使配体和MMS充分结合。结合抗IL2mAb后的MMS即为IMMS，通过磁铁或通过静止后将其与上清液分离开，加入生理盐水悬浮并洗涤后，倾去上清液，再重复洗涤3次(经洗涤后的IMMS放置在生理盐水中备用)，测量每次上清液的体积和游离抗IL-2mAb的含量。上清中蛋白质的含量使用Lowry's方法测定。抗IL-2mAb的偶联量按以下公式计算。
, 百拇医药
2 结果
2.1 MMS的大小分布 采用表1中的合成条件，所获MMS的大小分布见表2。
表2 合成MMS大小的分布
Tab 2 Distribution of size of MMS(%) Type of MMS
Size (mech)
>10
10～30
30～50
50～100
100～200
, http://www.100md.com 200～400
>400
MMS0
2.1
33.0
56.4
6.4
1.5
0.6
MMS1
3.4
23.1
62.8
, 百拇医药
7.1
2.8
0.8
MMS2
0.9
25.2
60.0
8.7
5.0
0.2
MMS3
12.0
0.7
, 百拇医药
17.6
42.2
23.2
3.5
0.8
MMS4
13.8
8.1
53.4
20.7
2.0
1.1
MMS5
, http://www.100md.com
17.9
16.0
47.8
12.9
4.7
0.7
MMS6
4.8
7.2
47.6
31.7
7.6
1.1
, http://www.100md.com
MMS7
69.8
0.6
15.0
5.5
4.5
4.6
MMS8
3.8
0.6
58.8
29.1
5.4
, 百拇医药
2.3
MMS9
3.3
0.4
56.4
35.3
2.3
2.3
MMS10
2.6
0.5
41.2
28.1
, 百拇医药
7.8
19.4
0.4
MMS11
5.2
0.3
35.5
32.5
9.6
15.6
1.3
MMS12
4.7
, 百拇医药
2.1
15.0
34.8
21.6
21.6
0.2
MMS13
6.2
1.6
4.0
10.1
47.1
44.6
, 百拇医药
6.4
2.2 MMS与mAb的偶联 将MMS与抗rhIL-2mAb进行偶联后，所获结果见表3。表3 抗 rhIL-2 mAb偶联到MMS的偶联率和偶联量
Tab 3 The percentage and capacity of coupling anti-rhIL-2 mAb to MMS Parameter
Batch
First
Second
Third
percentage(%)
87.5
, 百拇医药
83.3
80.8
Capacity(mg/ml MMS)
10.5
10.0
9.7
2.3 IMMS对rhIL-2的纯化 将10ml包涵体SDS裂解液(蛋白质浓度为2mg/ml)直接进行稀释，加入IMMS10ml(mAb偶联量为10.5mg/mlIMMS)，4℃放置过夜，用磁铁吸附IMMS，倾去上清，IMMS用30ml生理盐水-0.01mol/LTris-HCl洗涤2次，用10ml3mol/LKSCN的解离液，将rhIL-2从IMMS上解析下来，上清液即为rhIL-2溶液，并用磁铁回收IMMS(IMMS可循环使用)。将解析液进行SDS-PAGE，考马斯亮兰染色，薄层扫描仪测定rhIL-2的纯度为93%(图1)；用CTLL细进行生物学活性测定表明，比活性为2.0×106IU/mg蛋白质,活性回收率为80%。由于rhIL-2的复性比较复杂，故未进行深入地研究，只是对提纯的产品进行了纯度鉴定。
, 百拇医药
图1 IMMS纯化rhIL-2后的SDS-PAGE结果
Fig 1 The SDS-PAGE of rhIL-2 purified by IMMS
1:Purified rhIL 2 by IMMS;2:Crude sample;3:Molecular markers
3 讨论
3.1 影响磁性微球大小的因素
3.1.1 agarose含量对载体颗粒大小的影响
agarose含量的高低主要影响载体的孔径和硬度。在表1的MMS0，MMS1和MMS2中，agarose的用量分别为4.5，3.0和1.5g时载体的分布情况。从表2可看出，载体颗粒的分布无明显的差别，但对表面孔径则有较大的影响。基于用经典亲和色谱分离蛋白质经验，以4%或6%agarose胶的浓度较好[4]，故在MMS分离中我们选择6%的胶浓度作为研究的对象。
, 百拇医药
3.1.2 磁性液体含量磁性液体用量从0.5g增加至1.0g和1.5g时，合成的MMS对磁的感应明显增强。当将3000高斯的磁铁放于容器侧壁时，MMS完全吸附到侧壁的时间是:磁液用量为1.5g时为3min；1.0g时为5min；1.5g时为10min。当磁液用量再进一步增加时，将有更多的磁性颗粒暴露在MMS的表面，导致MMS的表面结构遭到一定程度的破坏，故选择1.0g的磁性液体作为研究对象。
3.1.3 有机溶剂用量对载体分布的影响MMS3是将agarose-H2O-Fe3O4的用量减少为MMS2的一半时合成的结果，相当于有机溶剂用量增加一倍时对载体颗粒的影响。从表2中可以看出，MMS3颗粒主要分布范围在50～200目之间；而MMS2则主要分布在30～100目之间。增加有机溶剂的用量可减小载体颗粒的粒度，在500ml和250ml反应瓶中也显示出相似的结果。
3.1.4 表面活性剂用量Span85作为表面活性剂，其主要作用是将agarose小微滴均匀地分散于有机溶剂中。当Span85的用量增大时，载体的颗粒分布就相对较窄。表2显示的是，Span85的用量对载体颗粒分布结果的影响(MMS8，MMS9和MMS10)。当不加span85时，往往出现大块未被分散的agarose。
, 百拇医药
3.1.5 搅拌速度搅拌速度可直接影响载体颗粒的大小和均匀性。搅拌速度越快，形成的颗粒越小，颗粒的分布范围就相对较窄。当搅拌速度为500，1000和1500r/min时，载体颗粒的粒度分别为30～100，50～200和100～400目(见表2中的MMS11，MMS12和MMS13)。
3.1.6 瓶子的形状和大小我们选用了3种规格的反应瓶，一种为250ml的三角瓶，另一种为250ml的圆底烧瓶，还有一种为500ml的圆底烧瓶。发现500ml的圆底烧瓶效果最差。原因可能是瓶子的体积太大，或合成载体的液体量太少，从而造成搅拌不均匀所致。
通过以上研究，我们确定了制备MMS载体的较好条件为:磁性液体用量为1.0g，agarose为
3.0g，水为50ml，搅拌速度为1000r/min，Span为0.25ml,有机液体甲苯为75ml，CCl4为25ml及250ml的圆底反应瓶。
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3.2 磁性颗粒的粒度 用扫描电镜观察，合成的磁性颗粒粒度大小约为0.3μm～0.6μm左右，完全可满足合成MMS的要求。在实际生产和科研中，使用的agarose微球的大小通常为30μm～
200μm。
3.3 CNBr用量对偶联量的影响 CNBr的用量直接决定着偶联量的大小。当CNBr用量为50mg，100mg和200mg/mlMMS时，可加入过量的mAb进行偶联。而就抗rhIL2mAb而言，其对应的偶联量依次为:3.5mg，6.0mg和10.5mgmAb/mlMMS。随着CNBr用量的增加，抗rhIL-2mAb的偶联量也增加，与经典的亲和色谱结果相一致[4]。从实际分离效果来看，单位体积的MMS偶联mAb的量越低，分离效果就相对越差，故选用CNBr用量为200mg/ml的MMS作为偶联mAb的条件。
3.4 偶联率与偶联量的关系 当CNBr的加入量固定为200mg/mlMMS时，抗rhIL-2mAb的偶联率与偶联量间的关系如图2所示。对抗rhIL-2mAb的偶联来说，当mAb的用量低于7mg/mlMMS时，几乎100%的抗rhIL-2mAb被连接在MMS载体上。之后，随着每mlMMS载体mAb用量的增加，偶联率逐渐降低。当mAb的用量达15mg/mlMMS量时，其偶联量可达10.5mg/mlMMS，再增加mAb的用量偶联量也不再增加。
, 百拇医药
图2 抗IL-2 mAb与MMS的偶联率与加入量的关系
Fig 2 The relationship of the coupling rate and the dose of anti-IL-2 mAb to MMS
3.5 IMMS在rhIL-2分离纯化中的应用 以往从包涵体入手纯化rhIL-2时，需经过高速离心后才能进行色谱分离。本文在rhIL-2的纯化中，只是将含大量不溶性颗粒的包涵体裂解液直接做简单的稀释后，就可用IMMS进行分离纯化，而且仅一步分离纯化就可使rhIL-2的纯度达到93%以上。本法避免了许多不必要的操作步骤，达到了分离纯化的简单、快速。我们采用本法还对rhIFN-α进行了纯化，也获得良好的纯化效果[5]。
作者简介：郭立安，男，36岁，副教授，博士
西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374573
, 百拇医药
参考文献
[1]Bruce IJ, Davies MJ, Howard K, et al. Magnetizable solid-phase supports for purification of nucleic acids. J Pharm Pharmacol ,1996;48: 147～149
[2]Hawkins T. M13 single-strand purification using a biotinylated probe and streptavidin coated magnetic beads. DNA Seq， 1992; 3: 65～69
[3]Dekker RHF. Immobilization of a lactase onto a magnetic support by covalent attachment to polyethyleneimine-glutaraldehyde-activated magnetite. Applied Biochem Biotechnol,1989; 22：289～310
[4]郭立安主编.高效液相色谱法纯化蛋白质理论与技术.第1版，西安：陕西科学技术出版社，1993：261～301
[5]郭立安，朱宝泉，陈代杰.使用磁性亲和载体纯化基因重组人干扰素-α.第四军医大学学报，1998；20(1):85～88
(收稿 1998-10-09 修回 1998-10-22), http://www.100md.com
单位：郭立安 陈万录(第四军医大学中心实验室，西安710032)；朱宝泉 陈代杰(上海医药工业研究院)
关键词：磁性分离；IL-2；亲和色谱；磁性免疫微球
细胞与分子免疫学杂志990114
摘要 本文在合成Fe3O4磁性材料的基础上，制备出agarose-Fe3O4磁性载体微球，并通过优化合成条件，建立了一套制备磁性微球的合成方法。将其与抗rhIL-2单克隆抗体(mAb)连接制备的免疫磁性微球一步纯化rhIL-2后,经SDS-PAGE、光密度扫描和CTLL细胞活性测定表明，纯度为
93%，活性回收率为80%，比活性为2.0×109IU/g蛋白质。结果说明磁性免疫微球不失为一种简单、快速分离蛋白质的方法。
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中国图书资料分类号 Q511
Synthesis of immunomagnetic microsphere and its separation for recombinant human IL-2
Guo Li ’an， Chen Wanlu， Zhu Baoquan1 Chen Daijie1 ( Central Laboratory, the Fourth Military Medical University, Xi 'an 710032)
Keywords magnetic separation IL-2 affinity separation immunomagnetic microsphere
Abstract The synthesis of immunomagnetic microsphere(IMMS)of monoclonal antibodies (mAb) to recombinant human IL-2 (rhIL-2) as ligand bounded to Fe3O4-agarose magnetic microsphere (MMS) and separation for rhIL-2 from suspension of inclusion body have been studied in this paper. The magnetic microsphere was prepared by physical wrapper encirclement. After reaction, the magnetic powers were enveloped in the middle of agarose. And then, magnetic microsphere was coupled with anti-rhIL-2 mAbs to form immunomagnetic microsphere. The coupling methods of mAb with MMS were CNBr methods. The IMMS was used to separate rhIL-2 from suspension of inclusion body. The purity of rhIL-2 purified by one step reached 93% , specific activity 2.0× 106IU/mg protein, ratio of activity 80%.
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There are two main advantages of IMMS in separating protein. First, this method can separate protein from suspension. Second, it is very simple and fast.
磁性免疫微球(IMMS)是近年研究的一类新型功能性材料，它是在磁性微球(MMS)载体表面通过化学或物理方法连接上具有一定免疫活性的物质作为配体而研制成的；又因其具有磁性，因此可在外加磁场的作用下,方便地进行分离同配体相对应的分子。磁性免疫微球目前已应用于细胞标记、细胞分离、临床PCR检测和肿瘤导向治疗等的研究[1～3〕,但用于蛋白质分离的方面研究较少。为此，我们在合成磁性载体的基础上，建立了一套制备磁性免疫微球的方法，并首次成功地研制出抗rhIL-2mAb磁性免疫微球，经对rhIL-2的包涵体裂解液进行一步纯化获得了结果的满意。
, http://www.100md.com 1 材料和方法
1.1 试剂及仪器 浓NH3·H2O(西安化学试剂厂)，FeCl2·4H2O(北京57601化工厂)，FeCl3·6H2O(天津市耀华化工厂)；rhIL-2包涵体裂解液粗品和抗rhIL-2mAb(本校免疫学教研室惠赠)；琼脂糖(上海东海制药厂，电泳用品)。D25电动搅拌机(杭州微电机厂)；扫描电镜(S-520,Hitachi)；Olympus倒置显微镜(Tokyo)；薄层扫描仪(Shimazu)。
1.2 Fe3O4顺磁性材料的合成分别称取12gFeCl2·4H2O和12gFeCl3·6H2O配成150ml溶液。在反应瓶中混匀后，置于水浴锅中，加热70℃，边搅拌边快速滴加浓NH3·H2O55ml，于10min内完成反应。生成的黑色沉淀用磁铁或离心进行快速分离，用蒸馏水洗涤4次，最后离心、收集磁性液体，4℃冰箱保存备用。合成的磁性颗粒用扫描电镜观察，直径大小约为0.3μm左右。
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1.3 磁性agarose载体的合成 按表1中的条件进行。
表1 合成MMS的条件
Tab 1 Synthetical conditions of MMS Type
of mms
agarose
(g)
magnetic
(g)
H2O
(ml)
C7H8
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(ml)
CCl4
(ml)
Span
(ml)
Type of
flask
rpm
MMS0
4.5
1.0
50
75
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25
0.25
triangle
1000
MMS1
3.0
1.0
50
75
25
0.25
triangle
1000
, 百拇医药
MMS2
1.5
1.0
50
75
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0.25
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MMS3
1.5
0.5
25
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25
0.25
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1.5
0.5
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75
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0.50
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1000
MMS5
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0.5
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500ml
1000
MMS6
3.0
1.0
50
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75
25
0.25
500ml
1000
MMS7
3.0
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MMS8
3.0
1.0
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25
0.5
250ml
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MMS9
3.0
1.0
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MMS10
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MMS11
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MMS12
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1.4 抗IL-2mAb与磁性微球的偶联 采用CNBr活化法。取5mlMMS在布氏漏斗上用蒸馏水充分洗涤后，加入1/10MMS体积的5mol/L磷酸缓冲液(每升含3.33mol/LK3PO4和1.67mol/LKH2PO4)混合，置冰水浴中预冷。另按每毫升MMS加200mgCNBr称取固体CNBr，加入少量蒸馏水，在电磁搅拌器上搅拌使之完全溶解。然后在电磁搅拌并在冰浴冷却的情况下，向MMS中滴加CNBr液，在2min内加完。并在冰浴下继续搅拌8min，整个活化过程中pH应维持在11～12之间。搅拌结束后，在布氏漏斗上抽滤，并迅速用预冷蒸馏水(为MMS体积的10倍量)和0.1mol/LNaHCO3(为MMS体积的5倍量)洗涤，于90s内完成。洗涤后的MMS转移到盛有60mg抗IL-2mAb的烧杯中。
活化的MMS与其配体混合后，在冰浴中继续搅拌10h，搅拌速度应很缓慢约60r/min，以防止MMS的破碎。然后在4℃过夜，使配体和MMS充分结合。结合抗IL2mAb后的MMS即为IMMS，通过磁铁或通过静止后将其与上清液分离开，加入生理盐水悬浮并洗涤后，倾去上清液，再重复洗涤3次(经洗涤后的IMMS放置在生理盐水中备用)，测量每次上清液的体积和游离抗IL-2mAb的含量。上清中蛋白质的含量使用Lowry's方法测定。抗IL-2mAb的偶联量按以下公式计算。
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2 结果
2.1 MMS的大小分布 采用表1中的合成条件，所获MMS的大小分布见表2。
表2 合成MMS大小的分布
Tab 2 Distribution of size of MMS(%) Type of MMS
Size (mech)
>10
10～30
30～50
50～100
100～200
, http://www.100md.com 200～400
>400
MMS0
2.1
33.0
56.4
6.4
1.5
0.6
MMS1
3.4
23.1
62.8
, 百拇医药
7.1
2.8
0.8
MMS2
0.9
25.2
60.0
8.7
5.0
0.2
MMS3
12.0
0.7
, 百拇医药
17.6
42.2
23.2
3.5
0.8
MMS4
13.8
8.1
53.4
20.7
2.0
1.1
MMS5
, http://www.100md.com
17.9
16.0
47.8
12.9
4.7
0.7
MMS6
4.8
7.2
47.6
31.7
7.6
1.1
, http://www.100md.com
MMS7
69.8
0.6
15.0
5.5
4.5
4.6
MMS8
3.8
0.6
58.8
29.1
5.4
, 百拇医药
2.3
MMS9
3.3
0.4
56.4
35.3
2.3
2.3
MMS10
2.6
0.5
41.2
28.1
, 百拇医药
7.8
19.4
0.4
MMS11
5.2
0.3
35.5
32.5
9.6
15.6
1.3
MMS12
4.7
, 百拇医药
2.1
15.0
34.8
21.6
21.6
0.2
MMS13
6.2
1.6
4.0
10.1
47.1
44.6
, 百拇医药
6.4
2.2 MMS与mAb的偶联 将MMS与抗rhIL-2mAb进行偶联后，所获结果见表3。表3 抗 rhIL-2 mAb偶联到MMS的偶联率和偶联量
Tab 3 The percentage and capacity of coupling anti-rhIL-2 mAb to MMS Parameter
Batch
First
Second
Third
percentage(%)
87.5
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83.3
80.8
Capacity(mg/ml MMS)
10.5
10.0
9.7
2.3 IMMS对rhIL-2的纯化 将10ml包涵体SDS裂解液(蛋白质浓度为2mg/ml)直接进行稀释，加入IMMS10ml(mAb偶联量为10.5mg/mlIMMS)，4℃放置过夜，用磁铁吸附IMMS，倾去上清，IMMS用30ml生理盐水-0.01mol/LTris-HCl洗涤2次，用10ml3mol/LKSCN的解离液，将rhIL-2从IMMS上解析下来，上清液即为rhIL-2溶液，并用磁铁回收IMMS(IMMS可循环使用)。将解析液进行SDS-PAGE，考马斯亮兰染色，薄层扫描仪测定rhIL-2的纯度为93%(图1)；用CTLL细进行生物学活性测定表明，比活性为2.0×106IU/mg蛋白质,活性回收率为80%。由于rhIL-2的复性比较复杂，故未进行深入地研究，只是对提纯的产品进行了纯度鉴定。
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图1 IMMS纯化rhIL-2后的SDS-PAGE结果
Fig 1 The SDS-PAGE of rhIL-2 purified by IMMS
1:Purified rhIL 2 by IMMS;2:Crude sample;3:Molecular markers
3 讨论
3.1 影响磁性微球大小的因素
3.1.1 agarose含量对载体颗粒大小的影响
agarose含量的高低主要影响载体的孔径和硬度。在表1的MMS0，MMS1和MMS2中，agarose的用量分别为4.5，3.0和1.5g时载体的分布情况。从表2可看出，载体颗粒的分布无明显的差别，但对表面孔径则有较大的影响。基于用经典亲和色谱分离蛋白质经验，以4%或6%agarose胶的浓度较好[4]，故在MMS分离中我们选择6%的胶浓度作为研究的对象。
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3.1.2 磁性液体含量磁性液体用量从0.5g增加至1.0g和1.5g时，合成的MMS对磁的感应明显增强。当将3000高斯的磁铁放于容器侧壁时，MMS完全吸附到侧壁的时间是:磁液用量为1.5g时为3min；1.0g时为5min；1.5g时为10min。当磁液用量再进一步增加时，将有更多的磁性颗粒暴露在MMS的表面，导致MMS的表面结构遭到一定程度的破坏，故选择1.0g的磁性液体作为研究对象。
3.1.3 有机溶剂用量对载体分布的影响MMS3是将agarose-H2O-Fe3O4的用量减少为MMS2的一半时合成的结果，相当于有机溶剂用量增加一倍时对载体颗粒的影响。从表2中可以看出，MMS3颗粒主要分布范围在50～200目之间；而MMS2则主要分布在30～100目之间。增加有机溶剂的用量可减小载体颗粒的粒度，在500ml和250ml反应瓶中也显示出相似的结果。
3.1.4 表面活性剂用量Span85作为表面活性剂，其主要作用是将agarose小微滴均匀地分散于有机溶剂中。当Span85的用量增大时，载体的颗粒分布就相对较窄。表2显示的是，Span85的用量对载体颗粒分布结果的影响(MMS8，MMS9和MMS10)。当不加span85时，往往出现大块未被分散的agarose。
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3.1.5 搅拌速度搅拌速度可直接影响载体颗粒的大小和均匀性。搅拌速度越快，形成的颗粒越小，颗粒的分布范围就相对较窄。当搅拌速度为500，1000和1500r/min时，载体颗粒的粒度分别为30～100，50～200和100～400目(见表2中的MMS11，MMS12和MMS13)。
3.1.6 瓶子的形状和大小我们选用了3种规格的反应瓶，一种为250ml的三角瓶，另一种为250ml的圆底烧瓶，还有一种为500ml的圆底烧瓶。发现500ml的圆底烧瓶效果最差。原因可能是瓶子的体积太大，或合成载体的液体量太少，从而造成搅拌不均匀所致。
通过以上研究，我们确定了制备MMS载体的较好条件为:磁性液体用量为1.0g，agarose为
3.0g，水为50ml，搅拌速度为1000r/min，Span为0.25ml,有机液体甲苯为75ml，CCl4为25ml及250ml的圆底反应瓶。
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3.2 磁性颗粒的粒度 用扫描电镜观察，合成的磁性颗粒粒度大小约为0.3μm～0.6μm左右，完全可满足合成MMS的要求。在实际生产和科研中，使用的agarose微球的大小通常为30μm～
200μm。
3.3 CNBr用量对偶联量的影响 CNBr的用量直接决定着偶联量的大小。当CNBr用量为50mg，100mg和200mg/mlMMS时，可加入过量的mAb进行偶联。而就抗rhIL2mAb而言，其对应的偶联量依次为:3.5mg，6.0mg和10.5mgmAb/mlMMS。随着CNBr用量的增加，抗rhIL-2mAb的偶联量也增加，与经典的亲和色谱结果相一致[4]。从实际分离效果来看，单位体积的MMS偶联mAb的量越低，分离效果就相对越差，故选用CNBr用量为200mg/ml的MMS作为偶联mAb的条件。
3.4 偶联率与偶联量的关系 当CNBr的加入量固定为200mg/mlMMS时，抗rhIL-2mAb的偶联率与偶联量间的关系如图2所示。对抗rhIL-2mAb的偶联来说，当mAb的用量低于7mg/mlMMS时，几乎100%的抗rhIL-2mAb被连接在MMS载体上。之后，随着每mlMMS载体mAb用量的增加，偶联率逐渐降低。当mAb的用量达15mg/mlMMS量时，其偶联量可达10.5mg/mlMMS，再增加mAb的用量偶联量也不再增加。
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图2 抗IL-2 mAb与MMS的偶联率与加入量的关系
Fig 2 The relationship of the coupling rate and the dose of anti-IL-2 mAb to MMS
3.5 IMMS在rhIL-2分离纯化中的应用 以往从包涵体入手纯化rhIL-2时，需经过高速离心后才能进行色谱分离。本文在rhIL-2的纯化中，只是将含大量不溶性颗粒的包涵体裂解液直接做简单的稀释后，就可用IMMS进行分离纯化，而且仅一步分离纯化就可使rhIL-2的纯度达到93%以上。本法避免了许多不必要的操作步骤，达到了分离纯化的简单、快速。我们采用本法还对rhIFN-α进行了纯化，也获得良好的纯化效果[5]。
作者简介：郭立安，男，36岁，副教授，博士
西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374573
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参考文献
[1]Bruce IJ, Davies MJ, Howard K, et al. Magnetizable solid-phase supports for purification of nucleic acids. J Pharm Pharmacol ,1996;48: 147～149
[2]Hawkins T. M13 single-strand purification using a biotinylated probe and streptavidin coated magnetic beads. DNA Seq， 1992; 3: 65～69
[3]Dekker RHF. Immobilization of a lactase onto a magnetic support by covalent attachment to polyethyleneimine-glutaraldehyde-activated magnetite. Applied Biochem Biotechnol,1989; 22：289～310
[4]郭立安主编.高效液相色谱法纯化蛋白质理论与技术.第1版，西安：陕西科学技术出版社，1993：261～301
[5]郭立安，朱宝泉，陈代杰.使用磁性亲和载体纯化基因重组人干扰素-α.第四军医大学学报，1998；20(1):85～88
(收稿 1998-10-09 修回 1998-10-22), http://www.100md.com