地高辛标记人IL-2cDNA探针的制备及临床初步应用
作者：吴福国 韩晓琳 张向阳 邱翠娥 朱立平
单位：吴福国 韩晓琳 张向阳 邱翠娥(山东济宁医学院生物化学教研室，济宁272113)；朱立平(中国医学科学院基础所单克隆抗体室)
关键词：IL-2；mRNA；类风湿性关节炎
细胞与分子免疫学杂志990108
摘要 目的：制备IL-2地高辛标记探针，探讨类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血淋巴细胞IL-2mRNA的表达情况。方法：采用斑点杂交技术，对6例正常对照和12例RA患者进行研究。结果：①从pUC12质粒中扩增制备了长度为1kb的IL-2cDNA片段，用地高辛标记后制备成探针。其敏感性达1pg同源DNA，且特异性较高。②12例RA患者外周血淋巴细胞IL2mRNA表达的相对光密度值为0.72±0.14(IL-2/β-actin)，而6例健康对照组IL-2mRNA表达的相对光密度值为0.26±0.17(IL-2/β-actin)，两组相比差异显著(P<0.01)。结论：RA患者IL-2基因的表达水平存在一定程度的失调；IL-2 mRNA表达的检测，对探讨RA的发病机制，以及对RA患者的诊断有一定的帮助。
, 百拇医药
中国图书资料分类号 R392.1R593.22
Preparation of digoxigenin-labeled human IL-2 cDNA probe and its preliminary application in rheumatoid arthritis
Wu Fuguo, Han Xiaolin, Zhang Xiangyang, Qiu Cui'e, Zhu Liping 1 (Department of Biochemistry, Jining Medical College, Jining 272113)
Keywords interleukin-2 messenger RNA rheumatoid arthritis
Abstract Aim: To prepare digoxigenin-labeled human IL-2 cDNA probe and evaluate the expression of IL-2 mRNA in patients with rheumatoid arthritis(RA). Methods: Dot blot hybridization of RNA extracted from the peripheral blood lymphocytes of 12 patients with active RA and 6 healthy controls was performed with the prepared probe. Results: ① The sensitivity and specificity of digoxigenin-labeled probe were high. ② The relative optical density(IL-2/β-actin) for IL-2 mRNA in 12 patients with RA and 6 healthy controls was 0.72± 0.14 and 0.26± 0.17, respectively. There was a significant difference in the expression of IL-2 mRNA between the patients and controls (P<0.01).Conclusion: the abnormal experssion of IL-2 gene may help to explain the mechanisms of triggering disease in patidnts with RA.
, 百拇医药
IL-2主要由活化的T淋巴细胞产生，通过与其受体结合而发挥作用。Russell等〔1,2〕报道，RA患者外周血中活化的T淋巴细胞增加，血清IL-2含量增高，可溶性IL-2R含量亦升高，可见RA患者存在着严重的T淋巴细胞功能紊乱。但以前均是从细胞或血清水平上进行研究，还未见到从基因转录水平上进行研究的报道。本实验通过制备地高辛标记的人IL-2cDNA探针，并用该探针半定量检测RA患者外周血淋巴细胞IL-2mRNA表达的变化，探讨了RA的发病机理。
1 材料和方法
1.1 地高辛配基标记人IL-2cDNA探针的制备
1.1.1 试剂 地高辛标记的多聚核苷酸及检测试剂盒，DNA+Hind Ⅲ marker,为德国Boehringer Mannheim公司产品。限制性核酸内切酶EcoR I,Pst I和BamH I,为中国协和医科大学科技开发公司产品。pGEM-3Z质粒(含0.56kb长的β-actin)片段，由中国协和医科大学基础医学院许成素教授转赠。硝酸纤维素薄膜为美国Bio-Rad公司产品。溴乙锭为瑞士Fluka公司产品。异硫氰酸胍(GIT)为德国Merck-Schuchardt公司产品。琼脂糖、SDS、十二烷酰肌氨酸钠和MOPS，均为美国Sigma公司产品。其余试剂均为国产分析纯级。
, 百拇医药
1.1.2 DNA片段的扩增 质粒pUC12(全长2.69kb)含人IL-2cDNA片段(长1kb),由中国协和医科大学基础医学院崔莲仙教授赠送。将该质粒转化大肠杆菌HD5α，经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、转化的阳性菌落，接种到含氨苄青霉素的LB培养液中，培养8h后，加氯霉素继续培养扩增质粒。收集后用碱变性法提取质粒，最后用PEG沉淀法纯化质粒，详细步骤见文献〔3〕。
1.1.3 酶切与目的片段的回收〔3〕 将纯化的质粒经PstI酶切后电泳，低熔点胶回收目的片段。经酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化片段，即可得目的基因片段。
1.1.4 探针的制备将纯化的目的基因在95℃水溶液中变性10min,立即置-20℃冰箱10min。加入6聚核苷酸混合物及dNTP标记用混合底物。在Klenow大片段酶存在下，37℃反应16h，煮沸10min后，置-20℃保存备用。
1.2 RA患者及其外周血淋巴细胞总RNA的提取 12例RA患者均符合美国风湿病学会1982年RA的分类标准，均处于活动期。抽血前均未服用过对免疫功能有影响的药物。健康对照6人，为本科室人员。抽取静脉血10ml肝素抗凝，常规分离淋巴细胞(淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品)，用一步法〔4〕提取细胞总RNA，于-20℃保存备用。
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1.3 斑点印迹杂交 分别取10μgRNA样品点样。杂交方法详见文献〔5〕。所获结果用Shimadzn Dual-Wave Length TLC Scanner CS-910扫描仪扫描。以定量的β-actin mRNA作为内对照，经标准化后对IL-2mRNA做半定量比较。
2 结果
2.1 IL-2cDNA片段的制备 取20μl含IL-2cDNA的质粒pUC12(DNA含量为0.82mg/L),加入到PstI酶切缓冲液中，离心后置37℃水浴2h。变性后经琼脂糖凝胶电泳分离IL-2 cDNA片段(以λDNA/Hind III为分子量标准)，低熔点胶回收，抽提后即得到长度为1kb的IL-2 cDNA片段(图1)。
图1 含IL-2c DNA的pUC12质粒的酶切鉴定
, 百拇医药
Fig 1 Pst I restriction endonuclease digestion of IL-2 cDNA plasmid
A: Before being cut; B:After being cut; C:Standard markers (λ DNA/Hind III)
2.2 地高辛标记的IL-2cDNA探针的特性鉴定 由图2可知，地高辛标记探针的敏感性可达1pg,不亚于放射性同位素标记的探针。采用地高辛标记的不含IL-2cDNA的pGEM-4Z质粒检测探针的特异性，未见显色，表明地高辛标记探针的特异性较高。
图2 地高辛标记的DNA探针与相同的未标记DNA片段的斑点杂交
Fig 2 Hybridization of digoxigenin-dUTP labeled IL-2 cDNA with unlabeled IL-2 cDNA
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2.3 RA患者外周血淋巴细胞IL-2mRNA的表达 用该探针检测了12例RA患者和6例健康对照者的外周血淋巴细胞IL2mRNA的表达变化(图3)。将斑点杂交结果用扫描仪半定量，经β-actin标准化后，发现患者IL-2mRNA的相对光密度(0.72±0.14)明显高于健康对照组(0.26±0.17),两者差异非常显著(P>0.01)。
图3 12例RA患者IL-2mRNA与其探针的斑点印迹杂交
Fig 3 Dot blot hybridization of total RNA of 12 RA patients with the IL-2 cDNA probe
A:Hybridization of RNA from the 7 th to the 12 th patients IL-2 cDNA probe; B:Hybridization of RNA from the 1 th to the 6 th patients IL-2 cDNA probe; C: Hybridization of RNA from the 1 th to the 6 th patients cDNA probe; D:Hybridization of RNA from the 1 th to the 6 th healthy controls with β-actin cDNA probe; E:Hybridization of RNA from the 1 th to the 6 th healthy controls with the IL-2 cDNA probe
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3 讨论
RA是一种病因复杂的自身免疫性疾病，其发病机制至今仍不清楚。许多学者认为，T淋巴细胞亚群比率异常在发病机制中可能起重要的作用。Nakao等〔6〕报道，活动期RA患者CD4+CD45RA+T细胞(诱导性抑制T细胞)在外周血及关节滑液中均比正常人显著降低；而CD4+CD29+T细胞(T辅助细胞)则较正常人显著升高。我们以往的研究〔7〕也表明，RA患者CD4+/CD8+T细胞的比值与活化的CD25+T淋巴细胞数比正常人增加，反映在分子水平上，血清IL-2和IL-2R含量亦增高〔2，8〕。IL-2含量的增高是在转录水平上的调控，还是在翻译水平上的调控？我们的结果表明，IL-2的表达至少在转录水平上是增加的，而IL-2Rp55链在基因转录水平上的表达，亦比正常对照组增高(结果在山东省第二届生物化学和分子生物学学术会议上交流)。由此可见，RA患者在基因表达水平上存在细胞因子的调节失衡。而RA患者细胞因子基因表达的异常，可能正是其免疫功能紊乱的分子基础。但由于我们观察的病例数较少，还需进一步地观察。然而，上述结果则可从一个侧面反映RA的发病机制相当复杂，它涉及到细胞、分子和基因多个层次的调节失衡。
, http://www.100md.com
*1991年卫生部科研基金和1996年山东省卫生厅科研基金资助项目，No.960502
作者简介：吴福国，男，34岁，副教授，硕士
济宁市建设路38号，Tel.(0537)2253911-2134
参考文献
[1]Russell AS. Activated lymphocytes in the periph eral blood of patients with rheumatoid arthritis. J Rheumatol，1990；17:589～596
[2]钱孝贤，余步云.可溶性IL-2R与类风湿性关节炎.中华内科杂志，1996；7：477～450
, 百拇医药
[3]Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Recovery of DNA from low-melting-temperature. Molecular Cloning, Second Edition. 1989；6：30～31
[4]吴福国，朱立平，崔莲仙，等.提取人外周血淋巴细胞总RNA3种方法的比较.上海免疫学杂志，1995；15(3):165～167
[5]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Dot and slot hybridization of RNA. Molecular Cloning, Second Edition，1989；7：53～55
[6]Nakao H, Eguchi K, Kawakami A，et al. Phenotypic characterization of lymphocytes infiltrating synovial tissue from patients with RA: analysis of lymphocytes isolated from minced synovial tissue by dual immunofluorescent staining. J Rheumatol, 1990；17(2):142～148
[7]吴福国，刘玉庆，张向阳，等.类风湿性关节炎患者T淋巴细胞亚群分析.济宁医学院学报，1998；2∶15～18
[8]Rubin LA, Nelson DL. The soluble interleukin 2 receptor: biology, function, and clinical application. Ann Intern Med, 1990；113:619～622
(收稿 1998-06-16 修回 1998-08-03), http://www.100md.com
单位：吴福国 韩晓琳 张向阳 邱翠娥(山东济宁医学院生物化学教研室，济宁272113)；朱立平(中国医学科学院基础所单克隆抗体室)
关键词：IL-2；mRNA；类风湿性关节炎
细胞与分子免疫学杂志990108
摘要 目的：制备IL-2地高辛标记探针，探讨类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血淋巴细胞IL-2mRNA的表达情况。方法：采用斑点杂交技术，对6例正常对照和12例RA患者进行研究。结果：①从pUC12质粒中扩增制备了长度为1kb的IL-2cDNA片段，用地高辛标记后制备成探针。其敏感性达1pg同源DNA，且特异性较高。②12例RA患者外周血淋巴细胞IL2mRNA表达的相对光密度值为0.72±0.14(IL-2/β-actin)，而6例健康对照组IL-2mRNA表达的相对光密度值为0.26±0.17(IL-2/β-actin)，两组相比差异显著(P<0.01)。结论：RA患者IL-2基因的表达水平存在一定程度的失调；IL-2 mRNA表达的检测，对探讨RA的发病机制，以及对RA患者的诊断有一定的帮助。
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中国图书资料分类号 R392.1R593.22
Preparation of digoxigenin-labeled human IL-2 cDNA probe and its preliminary application in rheumatoid arthritis
Wu Fuguo, Han Xiaolin, Zhang Xiangyang, Qiu Cui'e, Zhu Liping 1 (Department of Biochemistry, Jining Medical College, Jining 272113)
Keywords interleukin-2 messenger RNA rheumatoid arthritis
Abstract Aim: To prepare digoxigenin-labeled human IL-2 cDNA probe and evaluate the expression of IL-2 mRNA in patients with rheumatoid arthritis(RA). Methods: Dot blot hybridization of RNA extracted from the peripheral blood lymphocytes of 12 patients with active RA and 6 healthy controls was performed with the prepared probe. Results: ① The sensitivity and specificity of digoxigenin-labeled probe were high. ② The relative optical density(IL-2/β-actin) for IL-2 mRNA in 12 patients with RA and 6 healthy controls was 0.72± 0.14 and 0.26± 0.17, respectively. There was a significant difference in the expression of IL-2 mRNA between the patients and controls (P<0.01).Conclusion: the abnormal experssion of IL-2 gene may help to explain the mechanisms of triggering disease in patidnts with RA.
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IL-2主要由活化的T淋巴细胞产生，通过与其受体结合而发挥作用。Russell等〔1,2〕报道，RA患者外周血中活化的T淋巴细胞增加，血清IL-2含量增高，可溶性IL-2R含量亦升高，可见RA患者存在着严重的T淋巴细胞功能紊乱。但以前均是从细胞或血清水平上进行研究，还未见到从基因转录水平上进行研究的报道。本实验通过制备地高辛标记的人IL-2cDNA探针，并用该探针半定量检测RA患者外周血淋巴细胞IL-2mRNA表达的变化，探讨了RA的发病机理。
1 材料和方法
1.1 地高辛配基标记人IL-2cDNA探针的制备
1.1.1 试剂 地高辛标记的多聚核苷酸及检测试剂盒，DNA+Hind Ⅲ marker,为德国Boehringer Mannheim公司产品。限制性核酸内切酶EcoR I,Pst I和BamH I,为中国协和医科大学科技开发公司产品。pGEM-3Z质粒(含0.56kb长的β-actin)片段，由中国协和医科大学基础医学院许成素教授转赠。硝酸纤维素薄膜为美国Bio-Rad公司产品。溴乙锭为瑞士Fluka公司产品。异硫氰酸胍(GIT)为德国Merck-Schuchardt公司产品。琼脂糖、SDS、十二烷酰肌氨酸钠和MOPS，均为美国Sigma公司产品。其余试剂均为国产分析纯级。
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1.1.2 DNA片段的扩增 质粒pUC12(全长2.69kb)含人IL-2cDNA片段(长1kb),由中国协和医科大学基础医学院崔莲仙教授赠送。将该质粒转化大肠杆菌HD5α，经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、转化的阳性菌落，接种到含氨苄青霉素的LB培养液中，培养8h后，加氯霉素继续培养扩增质粒。收集后用碱变性法提取质粒，最后用PEG沉淀法纯化质粒，详细步骤见文献〔3〕。
1.1.3 酶切与目的片段的回收〔3〕 将纯化的质粒经PstI酶切后电泳，低熔点胶回收目的片段。经酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化片段，即可得目的基因片段。
1.1.4 探针的制备将纯化的目的基因在95℃水溶液中变性10min,立即置-20℃冰箱10min。加入6聚核苷酸混合物及dNTP标记用混合底物。在Klenow大片段酶存在下，37℃反应16h，煮沸10min后，置-20℃保存备用。
1.2 RA患者及其外周血淋巴细胞总RNA的提取 12例RA患者均符合美国风湿病学会1982年RA的分类标准，均处于活动期。抽血前均未服用过对免疫功能有影响的药物。健康对照6人，为本科室人员。抽取静脉血10ml肝素抗凝，常规分离淋巴细胞(淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品)，用一步法〔4〕提取细胞总RNA，于-20℃保存备用。
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1.3 斑点印迹杂交 分别取10μgRNA样品点样。杂交方法详见文献〔5〕。所获结果用Shimadzn Dual-Wave Length TLC Scanner CS-910扫描仪扫描。以定量的β-actin mRNA作为内对照，经标准化后对IL-2mRNA做半定量比较。
2 结果
2.1 IL-2cDNA片段的制备 取20μl含IL-2cDNA的质粒pUC12(DNA含量为0.82mg/L),加入到PstI酶切缓冲液中，离心后置37℃水浴2h。变性后经琼脂糖凝胶电泳分离IL-2 cDNA片段(以λDNA/Hind III为分子量标准)，低熔点胶回收，抽提后即得到长度为1kb的IL-2 cDNA片段(图1)。
图1 含IL-2c DNA的pUC12质粒的酶切鉴定
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Fig 1 Pst I restriction endonuclease digestion of IL-2 cDNA plasmid
A: Before being cut; B:After being cut; C:Standard markers (λ DNA/Hind III)
2.2 地高辛标记的IL-2cDNA探针的特性鉴定 由图2可知，地高辛标记探针的敏感性可达1pg,不亚于放射性同位素标记的探针。采用地高辛标记的不含IL-2cDNA的pGEM-4Z质粒检测探针的特异性，未见显色，表明地高辛标记探针的特异性较高。
图2 地高辛标记的DNA探针与相同的未标记DNA片段的斑点杂交
Fig 2 Hybridization of digoxigenin-dUTP labeled IL-2 cDNA with unlabeled IL-2 cDNA
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2.3 RA患者外周血淋巴细胞IL-2mRNA的表达 用该探针检测了12例RA患者和6例健康对照者的外周血淋巴细胞IL2mRNA的表达变化(图3)。将斑点杂交结果用扫描仪半定量，经β-actin标准化后，发现患者IL-2mRNA的相对光密度(0.72±0.14)明显高于健康对照组(0.26±0.17),两者差异非常显著(P>0.01)。
图3 12例RA患者IL-2mRNA与其探针的斑点印迹杂交
Fig 3 Dot blot hybridization of total RNA of 12 RA patients with the IL-2 cDNA probe
A:Hybridization of RNA from the 7 th to the 12 th patients IL-2 cDNA probe; B:Hybridization of RNA from the 1 th to the 6 th patients IL-2 cDNA probe; C: Hybridization of RNA from the 1 th to the 6 th patients cDNA probe; D:Hybridization of RNA from the 1 th to the 6 th healthy controls with β-actin cDNA probe; E:Hybridization of RNA from the 1 th to the 6 th healthy controls with the IL-2 cDNA probe
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3 讨论
RA是一种病因复杂的自身免疫性疾病，其发病机制至今仍不清楚。许多学者认为，T淋巴细胞亚群比率异常在发病机制中可能起重要的作用。Nakao等〔6〕报道，活动期RA患者CD4+CD45RA+T细胞(诱导性抑制T细胞)在外周血及关节滑液中均比正常人显著降低；而CD4+CD29+T细胞(T辅助细胞)则较正常人显著升高。我们以往的研究〔7〕也表明，RA患者CD4+/CD8+T细胞的比值与活化的CD25+T淋巴细胞数比正常人增加，反映在分子水平上，血清IL-2和IL-2R含量亦增高〔2，8〕。IL-2含量的增高是在转录水平上的调控，还是在翻译水平上的调控？我们的结果表明，IL-2的表达至少在转录水平上是增加的，而IL-2Rp55链在基因转录水平上的表达，亦比正常对照组增高(结果在山东省第二届生物化学和分子生物学学术会议上交流)。由此可见，RA患者在基因表达水平上存在细胞因子的调节失衡。而RA患者细胞因子基因表达的异常，可能正是其免疫功能紊乱的分子基础。但由于我们观察的病例数较少，还需进一步地观察。然而，上述结果则可从一个侧面反映RA的发病机制相当复杂，它涉及到细胞、分子和基因多个层次的调节失衡。
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*1991年卫生部科研基金和1996年山东省卫生厅科研基金资助项目，No.960502
作者简介：吴福国，男，34岁，副教授，硕士
济宁市建设路38号，Tel.(0537)2253911-2134
参考文献
[1]Russell AS. Activated lymphocytes in the periph eral blood of patients with rheumatoid arthritis. J Rheumatol，1990；17:589～596
[2]钱孝贤，余步云.可溶性IL-2R与类风湿性关节炎.中华内科杂志，1996；7：477～450
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[3]Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Recovery of DNA from low-melting-temperature. Molecular Cloning, Second Edition. 1989；6：30～31
[4]吴福国，朱立平，崔莲仙，等.提取人外周血淋巴细胞总RNA3种方法的比较.上海免疫学杂志，1995；15(3):165～167
[5]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Dot and slot hybridization of RNA. Molecular Cloning, Second Edition，1989；7：53～55
[6]Nakao H, Eguchi K, Kawakami A，et al. Phenotypic characterization of lymphocytes infiltrating synovial tissue from patients with RA: analysis of lymphocytes isolated from minced synovial tissue by dual immunofluorescent staining. J Rheumatol, 1990；17(2):142～148
[7]吴福国，刘玉庆，张向阳，等.类风湿性关节炎患者T淋巴细胞亚群分析.济宁医学院学报，1998；2∶15～18
[8]Rubin LA, Nelson DL. The soluble interleukin 2 receptor: biology, function, and clinical application. Ann Intern Med, 1990；113:619～622
(收稿 1998-06-16 修回 1998-08-03), http://www.100md.com