鉴别HCV－C蛋白上HLA－A2限制的CTL识别表位的研究*
作者：周红超 徐德忠 张鹏 闫永平 张景霞 赵小宁 朱勇 金伯泉
单位：周红超 徐德忠 张鹏 闫永平 张景霞 赵小宁(第四军医大学 流行病学教研室，西安710032)；朱勇 金伯泉(第四军医大学 免疫学教研室，西安710032)
关键词：丙型肝炎病毒；细胞毒性T细胞；HLA-A2；表位
细胞与分子免疫学杂志990103
摘要 本文先用计算机预测、后用51Cr4h释放分析证实的方法，对丙型肝炎病毒(HCV)核心区蛋白(C蛋白)上，HLAA2限制性CTL识别表位进行了鉴别。结果发现，2名感染HCV的HLA-A2阳性供血员的外周血单个核细胞(PBMC)对ALAHGVRAL(core150～158)肽段标记的自体靶细胞有溶解作用，杀伤率分别为37.5%和15.8%;用抗CD4mAb阻断后杀伤率无明显变化，而用抗CD8mAb阻断后明显减少,提示该条肽段可能为HLAA2限制性CTL识别表位。
, 百拇医药
中国图书资料分类号 R392.11
Identification of the epitopes on HCV core protein recognized by HLA-A2 restricted cytotoxic T lymphocytes
ZHOU Hong Chao, XU De Zhong, ZHANG Peng, YAN Yong Ping, ZHANG Jing Xia, ZHAO Xiao Ning, ZHU Yong1, JIN Bo Quan1 ( Department of Epidemiology, 1Department of Immunology, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Keywords hepatitis C virus cytotoxic T lymphocyte HLA-A2 epitope
, 百拇医药
Abstract In this paper,we attempted to identify epitopes recognized by the HLA-A2 restricted cytotoxic T lymphocyte (CTL) on hepatitis C virus (HCV) core protein utilizing the method of computer prediction before conforming by 4 h 51Cr-release assay.The results showed that Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) obtained from two HLA-A2 positive donors who infected with HCV could lyse autologous target cells labled with peptide “ ALAHGVRAL(core 150～158)” . The specific lysis of the cells from the two donors were 37.5% and 15.8% , respectively. Blocking of the response with anti-CD4 showed that the specific lysis had no signifcant decrease. But blocking of CTL response with anti-CD8 could abolish lysis. It indicated that the peptide was the candidate epitope recognized by the HLA-A2 restricted CTL.
, 百拇医药
急性HCV感染患者约有50%～60%慢性化，其中20%最终发展为肝癌〔1〕，有关机制目前尚不清楚。最近有的学者发现，在HCV结构和非结构蛋白上存在一些CTL识别表位，推测CTL介导的细胞免疫应答可能在抗HCV感染免疫中起重要作用〔2，3〕。
CD8+CTL对感染细胞的杀伤是通过其T细胞受体与感染细胞表面含有内源性合成肽(9～11肽)的HLA-Ⅰ类分子相互作用而完成的。每种HLA分子都有其特异的多肽结合基序。目前许多HLA-Ⅰ类分子的多肽结合基序已见报道，其中以HLA-A2分子结合肽基序研究最为清楚〔4〕。国外学者〔5〕曾针对HLA-A2分子的特点，对丙型肝炎患者中HLA-A2分子限制性CTL识别表位进行了研究，我们〔6〕也曾用自行设计的计算机评分系统，对文献报道的HLA-A2分子结合的HCV9肽进行了评分，结果发现，所有肽的得分均大于或等于144分。但有关根据HLA-A2分子肽结合基序先进行计算机预测，后对HCV蛋白上CTL识别表位进行鉴别的方法尚少见报道。本文在以往研究的基础上，对HCVC蛋白上预测的HLA-A2限制性CTL识别表位进行了实验鉴。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 研究对象 为在某医院输血科收集的抗-HCV阳性供血员及健康供血员各15例，参照HLA及HCV血清学检测结果，选择其中的8例作为研究对锡，其中包括HCV感染供血员6例，健康供血员2例。研究对象的特征和治疗史见表1。随访期内所有抗-HCV阳性供血员均未接受任何治疗，且HBV及HIV血清学标志均呈阴性。
1.2 HLA的型别检测 从HCV感染的供血员及健康供血员中分离PBMC，用微量细胞毒方法测定供血员的HLA型别。HLA配型板购自OneLambda公司。分型结果见表1。
表1 用于研究CTL对HCV表位应答的患者的临床资料、HLA-A型别及血清学检测特征
Tab 1 Clinical data,HLA-A types, and serological features of patients studied for CTL response to HCV epitopes Patients or controls
, http://www.100md.com
HLA A type
Determination of anti- HCV
PCR detection
Experiment group
Li A2 A31
Zhang A2 A11
Tang A2 A33
Zhang A2 A11
+
+
+
, 百拇医药
+
+
+
+
+
Patient control group
Li A11
Zhu A3 A33
+
+
+
+
Healthy control group
, 百拇医药
Zheng A2 A11
Wang A2 A24
-
-
-
-
Note:All subjects was not treated and had been followed-up for one year
1.3 HLA-A2限制性CTL识别表位的预测 根据我们以往报道〔6〕的计算机预测方法，对1型HCV株C蛋白上HLA-A2限制性CTL识别表位进行了预测。方法简述如下：运用C语言编制计算机程序，首先完成HCVcDNA到HCV氨基酸序列的变换，然后从HCV氨基酸序列中，顺序查找含有HLA-A2分子多肽结合基序特征的肽段，即第2位为亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)或异亮氨酸(I)，最后1位为L或缬氨酸(V)的9～11肽。最后参照Nijman的评分标准〔5〕，对选出的HCV抗原肽进行评分。即锚定氨基酸计6分，强结合信号氨基酸(辅锚定氨基酸)计4分，弱结合信号氨基酸计2分，将各氨基酸得分相乘，乘积即为该肽的分数。得分大于或等于144分的肽段，即为预测所得的CTL识别表位。
, 百拇医药
1.4 多肽合成及配制 从预测结果中选出4条多肽，即YLLPRRGPRL(core35～44),NLGKVIDTL(core118～126),DLMGYIPLV(core132～140),ALAHGVRAL(core150～158)，然后在美国ResearchGenetics公司392型多肽合成仪上进行合成。4条多肽的纯度分别为83.0%，>90.0%，>90.0%和62.7%。使用时将冻干肽放置至室温，然后溶解于不完全RPMI1640培养基中，稀释至1g/L。
1.5 PBMC的分离及CTL增殖 用淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技公司生产)从供血员的肝素抗凝血中分离出PBMC，然后用RPMI-1640液洗3次，再悬浮于含10%FCS的RPMI-1640完全培养基(添加有谷氨酰胺10mg/L，青霉素5×104U/L，链霉素50mg/L和Hepes5mmol/L)中。以4×106细胞/孔的浓度接种PBMC于24孔板中。试验当天用ConA(20μg/孔)对PBMC进行刺激。第3d，每孔添加含rIL-2的完全RPMI-1640培养基1ml，使rIL-2终浓度为2×104U/L。第7d，用合成肽(终浓度为15mg/L)、rIL-2(终浓度为4×104U/L)及自体饲养细胞(在3000rad剂量下照射的自体PBMC)再进行刺激。试验第12d，用合成肽及rIL-2又刺激1次。试验第16d，以培养的PBMC作为效应细胞进行4h51Cr释放分析。
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1.6 自体淋巴母细胞细胞系(B-LCL)的制备 分离患者的PBMC，洗涤后悬浮于20%FCSRPMI-1640培养基中，然后以2×106细胞/孔的浓度接种于24孔板中。每孔再加入EBV上清1ml，37℃孵育2h，中间每15min振摇1次。洗涤后，用含CSA(终浓度为1mg/L)的20%FCSRPMI-1640培养基混悬，然后接种于24孔板中，使每孔细胞数为(1～2)×106。3d后换液，补加含CSA的新鲜RPMI-1640培养基。7d后加无CSA的新鲜RPMI1640培养基，10d后即建立永生化的BLCL。
1.7 4h51Cr释放分析 将靶细胞(B-LCL)和多肽(终浓度200mg/L)孵育过夜，然后用3.7×106Bq51Cr(购自美国杜邦公司)标记1h。取10%FCSRPMI1640洗涤3次，重悬细胞浓度为1×108/L，加入96孔U型培养板中，每孔加100μl(1×104细胞)，每份3个复孔。每孔加入100μl不同细胞浓度的自体效应细胞，效靶比分别为100∶1，50∶1，1∶1。最大释放孔加入100μl5%TritonX-100(Fisher科学生产公司生产)；自然释放组加入100μl完全培养基，于CO2孵箱中4h后，离心，每孔取出100μl上清，用γ计数仪(FJ-2008，西安262厂制造)测定cpm值。然后按下列公式计算特异性杀伤率(%)。杀伤率大于15%者判为特异性杀伤〔7〕。
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1.8 mAb的阻断试验 在细胞杀伤实验中，首先分别向96孔板中加入1∶50的抗CD4、抗CD8mAb(DAKO公司生产)，然后再测定CTL的应答。
2 结果
2.1 HLA-A2限制性CTL识别表位的预测 用计算机程序对HCVC蛋白进行分析，共发现有7条肽段的得分大于或等于144分。其中第①、④号肽，即YLLPRRGPRL(core35～44)和DLMGYIPLV(core132～140)肽段为文献报道〔6〕的HLA-A2.1限制性CTL识别表位；第⑦号肽，即FLLALLSCL(core177～185)与文献报道〔6〕的另一表位LLALLSCLTV(core178～187)基本一致。其余肽段尚未见为HLA-A2限制性CTL识别表位的报道。从预测的7条肽中选出其中的4条，即(①、②、④、和⑤号肽)进行人工合成，用于细胞杀伤实验。
表2 HCVC蛋白上HLA-A2分子限制性CTL识别表位的预测结果
, 百拇医药
Tab 2 Predicted results of epitopes recognized by HLA-A2 restricted CTL on HCV C protein No.
Peptide sequence
Peptide site
Score
①
YLLPRRGPRLa
35～ 44
144
②
NLGKVIDTL
, 百拇医药
118～ 126
576
③
TLTCGFADL
125～ 133
144
④
DLMGYIPLVa
132～ 140
576
⑤
ALAHGVRAL
, 百拇医药
150～ 158
576
⑥
NLPGCSFSIFL
168～ 176
288
⑦
FLLALLSCLb
177～ 185
144
a:Reported epitopes recognized by HLA-A2.1 restricted CTL； b:Almost consistent with the reported epitope LLALLSCLTV(core 178～ 187)
, 百拇医药
2.2合成肽对供血员外周血中CTL的活化当PBMC在体外接受两次多肽刺激后，4名HLAA2(+),HCVRNA(+)供血员中，有两名供血员的PBMC显示对⑤号肽标记的自体靶细胞有溶解作用，其中一名的杀伤率达37.5%(表3)。另一名供血员的PBMC对⑤号肽标记的自体靶细胞杀伤率为15.8%。用抗CD4mAb阻断后杀伤率无明显变化；而用抗CD8mAb阻断后杀伤率明显减少(图1)。
表3 C蛋白上预测多肽对CTL的诱导活性△
Tab 3 CTL activity induced by predicted peptides on C protein Patient or controls
HLA type
51Cr-release(% lysis)
, http://www.100md.com
A
B
①
②
④
⑤
Experiment group
Li
2
31
51
16
-2.6
, http://www.100md.com 9.6
0.5
NT
Zhang
2
11
8
27
0.4
NT
2.4
6.9
Tang
2
, 百拇医药
33
44
55
-3.8
5.1
3.3
37.5
Zhang
2
11
62
35
-1.1
, 百拇医药 9.8
8.4
12.2
Healthy controls
Zheng
2
11
62
39
-2.9
8.0
6.8
0.2
, http://www.100md.com
Wang
2
24
61
46
0.2
NT
3.7
10.0
Patient controls
Li
11
62
, 百拇医药
35
-2.6
2.6
2.3
1.8
Zhu
3
33
17
35
-2.5
1.6
0
, http://www.100md.com 2.5
△ CTL activity induced by peptides at E/T ratio of 50∶ 1; NT: No test； ① ,② ,④ and⑤ represent YLLPRRGPRL(core 35～ 44), NLGKVIDTL(core 118～ 126)， DLMGYIPLV(core 132～ 140) and ALAHGVRAL(core 150～ 158), respectively.
图1用mAb阻断来源于张某CTL的活性
Fig 1 Blocking of CTL activity of Mr. Zhang with mAbs
3 讨论
, 百拇医药
CTL介导的细胞免疫应答可能在抗HCV感染中起重要作用。许多学者已先后在HCV患者的PBMC及肝浸润淋巴细胞中，发现存在HCV特异性CTL，并鉴定出了许多CTL识别表位〔2，3〕。因HLAA2在大多数人群中呈高基因频率出现，为此，Cerny等〔3〕首先把研究重点放在HLA-A2限制性CTL识别表位，并在HCV各蛋白区确定出一些CTL识别表位。但由于研究方法的限制，工作量较大，成本也较高，使一般实验室难以进行。本研究的策略是通过自行设计的计算机程序，找出含有HLA-A2结合基序的HCV抗原肽,并通过51Cr4h释放分析检验预测的结果。
3.1 HLA-A2限制性CTL识别表位的预测 文献报道〔2，3〕的寻找CTL识别表位的方法分两个步骤：首先用重叠多肽法合成若干条多肽，然后再进行实验鉴别。到目前为止，用这种方法在HCVC区共鉴别出3个表位，即YLLPRRGPRL(core35～44),DLMGYIPLV(core132～140)和LLALLSCLTV(core178～187)。这种实验方法的优点是直接、可靠；缺点是工作量大、花费高，一般实验室难以进行。
, 百拇医药
本文用计算机程序对HCVC蛋白进行了分析。结果发现，仅有7条肽段的得分大于或等于144分，其中包括文献报道的两个HLA-A2限制性CTL识别表位，即YLLPRRGPRL(core35～44)和DLMGYIPLV(core132～140)。另1条肽段，即FLLALLSCL(core177～185)与文献报道的另1表位LLALLSCL-TV(core178～187)基本一致。有针对性的对这7条肽段进行研究将能简化实验步骤、节约费用。选择其中的4条，即①、②、④和⑤号肽进行人工合成，然后用于细胞杀伤实验。
3.2 合成肽对供血员外周血CTL的活化 本研究利用细胞杀伤试验的方法，对预测所得的4条HCVC区抗原肽进行了检验。发现4名HLA-A2呈阳性。HCVRNA阳性供血员中,有两名供血员的PBMC显示对⑤号肽标记的自体靶细胞有杀伤作用,杀伤率分别为37.5%和15.8%，其余3条肽未见有明显的CTL诱导作用。CTL应答在两名健康且HLA-A2阳性供血员及两名HCVRNA+、HLA-A2-供血员中反应不明显。
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根据文献报道〔7〕,当杀伤率≥15%时，可被认为是特异性杀伤。在效靶比为50∶1时，唐某的PBMC对⑤肽标记的自体靶细胞的杀伤率高达37.5%；供血员张某的PBMC杀伤率在效靶比为100∶1时为15.8%;抗CD4mAb阻断未见明显变化，抗CD8mAb孔使杀伤率降至7.20%。表明杀伤可能是由CD8+T细胞而非CD4+T细胞所致，并提示⑤号肽可能为HLA-A2限制性CTL识别表位。值得指出的是，由于本研究中自发释放率较高，接近于文献要求的自发释放不能超过最高释放的30%的临界水平〔8〕，故对这一结果尚有待进一步研究证实。
其余3条多肽,包括文献报道的两个CTL识别表位，即YLLPRRGPRL(core35～44)和DLMGYIPLV(core132～140),在本研究中虽未发现明显的CTL诱导活性,但也不能就此认为不是HLA-A2限制性CTL识别表位。原因可能是文献报道的两个表位为HLA-A2.1限制CTL识别表位，而本研究未进行HLA-A2亚型测定，不同亚型的HLA-A2限制性CTL识别表位可能不同；也可能是HCV患者体内HCV蛋白序列与合成多肽的序列不完全一致所致，这一结果也有待进一步实验证实。
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*国家自然科学基金资助项目,No.39570634
作者简介：周红超，男，27岁，博士
西安市长乐西路17号，Tel.(029)3221616-75293
参考文献
[1]Alter MJ, Margolis HS, krawczynski K, et al. The natural history of community-hepatitis C in the united states. N Engl J Med, 1992;327(27):1899 ～1905
[2]Shirai M, Okada H, Nishioka M, et al. An epitope in hepatitis C virus core region recognized by cytotoxic T cells in mice and humans. J Virol, 1994; 68(5):3334～3342
, http://www.100md.com
[3]Cerny A, Mchutchison JG, Pasquinelli C, et al. Cytotoxic T lymphocyte response to hepatitis C virus derived peptides containing the HLA-A2.1 binding motif. J Clin Invest, 1995; 95(2): 521～530
[4]Parker KC, Bednarek MA, Hull LK, et al. Sequence motifs important for peptide binding to the human MHC class Ⅰ molecule, HLA-A2. J Immunol ,1992; 149 (11) :3580～3587
[5]Nijman HW, Houbiers JGA, Vierboom MPW, et al. Identification of peptide sequences that potentially trigger HLA A2.1 restricted cytotoxic T lymphocytes. Eur J Immunol，1993; 23(6):1215～1219
, http://www.100md.com
[6]周红超,董明清,徐德忠,等.用计算机程序预测可与HLA-A2分子结合的HCV抗原肽.细胞与分子免疫学杂志,1996;12(4):41～46
[7]Botarelli P, Brunetto MR, Minutello MA, et al. T Lymphocyte response to hepatitis C virus in different clinical courses of infection. Gastroenterol, 1993; 104 (2):580～587
[8]Bttegay M, Fikes J, Bisceglie AMD，et al. Patients with chronic heptitis C have circulating cytotoxic T cells which recognize hepatitis C virus-enclosed peptides binding to HLA-A2.1 molecules. J Virol, 1995; 69(4):2462～2470
(收稿1 998-07-16 修回 1998-09-07), http://www.100md.com
单位：周红超 徐德忠 张鹏 闫永平 张景霞 赵小宁(第四军医大学 流行病学教研室，西安710032)；朱勇 金伯泉(第四军医大学 免疫学教研室，西安710032)
关键词：丙型肝炎病毒；细胞毒性T细胞；HLA-A2；表位
细胞与分子免疫学杂志990103
摘要 本文先用计算机预测、后用51Cr4h释放分析证实的方法，对丙型肝炎病毒(HCV)核心区蛋白(C蛋白)上，HLAA2限制性CTL识别表位进行了鉴别。结果发现，2名感染HCV的HLA-A2阳性供血员的外周血单个核细胞(PBMC)对ALAHGVRAL(core150～158)肽段标记的自体靶细胞有溶解作用，杀伤率分别为37.5%和15.8%;用抗CD4mAb阻断后杀伤率无明显变化，而用抗CD8mAb阻断后明显减少,提示该条肽段可能为HLAA2限制性CTL识别表位。
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中国图书资料分类号 R392.11
Identification of the epitopes on HCV core protein recognized by HLA-A2 restricted cytotoxic T lymphocytes
ZHOU Hong Chao, XU De Zhong, ZHANG Peng, YAN Yong Ping, ZHANG Jing Xia, ZHAO Xiao Ning, ZHU Yong1, JIN Bo Quan1 ( Department of Epidemiology, 1Department of Immunology, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Keywords hepatitis C virus cytotoxic T lymphocyte HLA-A2 epitope
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Abstract In this paper,we attempted to identify epitopes recognized by the HLA-A2 restricted cytotoxic T lymphocyte (CTL) on hepatitis C virus (HCV) core protein utilizing the method of computer prediction before conforming by 4 h 51Cr-release assay.The results showed that Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) obtained from two HLA-A2 positive donors who infected with HCV could lyse autologous target cells labled with peptide “ ALAHGVRAL(core 150～158)” . The specific lysis of the cells from the two donors were 37.5% and 15.8% , respectively. Blocking of the response with anti-CD4 showed that the specific lysis had no signifcant decrease. But blocking of CTL response with anti-CD8 could abolish lysis. It indicated that the peptide was the candidate epitope recognized by the HLA-A2 restricted CTL.
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急性HCV感染患者约有50%～60%慢性化，其中20%最终发展为肝癌〔1〕，有关机制目前尚不清楚。最近有的学者发现，在HCV结构和非结构蛋白上存在一些CTL识别表位，推测CTL介导的细胞免疫应答可能在抗HCV感染免疫中起重要作用〔2，3〕。
CD8+CTL对感染细胞的杀伤是通过其T细胞受体与感染细胞表面含有内源性合成肽(9～11肽)的HLA-Ⅰ类分子相互作用而完成的。每种HLA分子都有其特异的多肽结合基序。目前许多HLA-Ⅰ类分子的多肽结合基序已见报道，其中以HLA-A2分子结合肽基序研究最为清楚〔4〕。国外学者〔5〕曾针对HLA-A2分子的特点，对丙型肝炎患者中HLA-A2分子限制性CTL识别表位进行了研究，我们〔6〕也曾用自行设计的计算机评分系统，对文献报道的HLA-A2分子结合的HCV9肽进行了评分，结果发现，所有肽的得分均大于或等于144分。但有关根据HLA-A2分子肽结合基序先进行计算机预测，后对HCV蛋白上CTL识别表位进行鉴别的方法尚少见报道。本文在以往研究的基础上，对HCVC蛋白上预测的HLA-A2限制性CTL识别表位进行了实验鉴。
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1 材料和方法
1.1 研究对象 为在某医院输血科收集的抗-HCV阳性供血员及健康供血员各15例，参照HLA及HCV血清学检测结果，选择其中的8例作为研究对锡，其中包括HCV感染供血员6例，健康供血员2例。研究对象的特征和治疗史见表1。随访期内所有抗-HCV阳性供血员均未接受任何治疗，且HBV及HIV血清学标志均呈阴性。
1.2 HLA的型别检测 从HCV感染的供血员及健康供血员中分离PBMC，用微量细胞毒方法测定供血员的HLA型别。HLA配型板购自OneLambda公司。分型结果见表1。
表1 用于研究CTL对HCV表位应答的患者的临床资料、HLA-A型别及血清学检测特征
Tab 1 Clinical data,HLA-A types, and serological features of patients studied for CTL response to HCV epitopes Patients or controls
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HLA A type
Determination of anti- HCV
PCR detection
Experiment group
Li A2 A31
Zhang A2 A11
Tang A2 A33
Zhang A2 A11
+
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Patient control group
Li A11
Zhu A3 A33
+
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+
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Healthy control group
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Zheng A2 A11
Wang A2 A24
-
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Note:All subjects was not treated and had been followed-up for one year
1.3 HLA-A2限制性CTL识别表位的预测 根据我们以往报道〔6〕的计算机预测方法，对1型HCV株C蛋白上HLA-A2限制性CTL识别表位进行了预测。方法简述如下：运用C语言编制计算机程序，首先完成HCVcDNA到HCV氨基酸序列的变换，然后从HCV氨基酸序列中，顺序查找含有HLA-A2分子多肽结合基序特征的肽段，即第2位为亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)或异亮氨酸(I)，最后1位为L或缬氨酸(V)的9～11肽。最后参照Nijman的评分标准〔5〕，对选出的HCV抗原肽进行评分。即锚定氨基酸计6分，强结合信号氨基酸(辅锚定氨基酸)计4分，弱结合信号氨基酸计2分，将各氨基酸得分相乘，乘积即为该肽的分数。得分大于或等于144分的肽段，即为预测所得的CTL识别表位。
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1.4 多肽合成及配制 从预测结果中选出4条多肽，即YLLPRRGPRL(core35～44),NLGKVIDTL(core118～126),DLMGYIPLV(core132～140),ALAHGVRAL(core150～158)，然后在美国ResearchGenetics公司392型多肽合成仪上进行合成。4条多肽的纯度分别为83.0%，>90.0%，>90.0%和62.7%。使用时将冻干肽放置至室温，然后溶解于不完全RPMI1640培养基中，稀释至1g/L。
1.5 PBMC的分离及CTL增殖 用淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技公司生产)从供血员的肝素抗凝血中分离出PBMC，然后用RPMI-1640液洗3次，再悬浮于含10%FCS的RPMI-1640完全培养基(添加有谷氨酰胺10mg/L，青霉素5×104U/L，链霉素50mg/L和Hepes5mmol/L)中。以4×106细胞/孔的浓度接种PBMC于24孔板中。试验当天用ConA(20μg/孔)对PBMC进行刺激。第3d，每孔添加含rIL-2的完全RPMI-1640培养基1ml，使rIL-2终浓度为2×104U/L。第7d，用合成肽(终浓度为15mg/L)、rIL-2(终浓度为4×104U/L)及自体饲养细胞(在3000rad剂量下照射的自体PBMC)再进行刺激。试验第12d，用合成肽及rIL-2又刺激1次。试验第16d，以培养的PBMC作为效应细胞进行4h51Cr释放分析。
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1.6 自体淋巴母细胞细胞系(B-LCL)的制备 分离患者的PBMC，洗涤后悬浮于20%FCSRPMI-1640培养基中，然后以2×106细胞/孔的浓度接种于24孔板中。每孔再加入EBV上清1ml，37℃孵育2h，中间每15min振摇1次。洗涤后，用含CSA(终浓度为1mg/L)的20%FCSRPMI-1640培养基混悬，然后接种于24孔板中，使每孔细胞数为(1～2)×106。3d后换液，补加含CSA的新鲜RPMI-1640培养基。7d后加无CSA的新鲜RPMI1640培养基，10d后即建立永生化的BLCL。
1.7 4h51Cr释放分析 将靶细胞(B-LCL)和多肽(终浓度200mg/L)孵育过夜，然后用3.7×106Bq51Cr(购自美国杜邦公司)标记1h。取10%FCSRPMI1640洗涤3次，重悬细胞浓度为1×108/L，加入96孔U型培养板中，每孔加100μl(1×104细胞)，每份3个复孔。每孔加入100μl不同细胞浓度的自体效应细胞，效靶比分别为100∶1，50∶1，1∶1。最大释放孔加入100μl5%TritonX-100(Fisher科学生产公司生产)；自然释放组加入100μl完全培养基，于CO2孵箱中4h后，离心，每孔取出100μl上清，用γ计数仪(FJ-2008，西安262厂制造)测定cpm值。然后按下列公式计算特异性杀伤率(%)。杀伤率大于15%者判为特异性杀伤〔7〕。
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1.8 mAb的阻断试验 在细胞杀伤实验中，首先分别向96孔板中加入1∶50的抗CD4、抗CD8mAb(DAKO公司生产)，然后再测定CTL的应答。
2 结果
2.1 HLA-A2限制性CTL识别表位的预测 用计算机程序对HCVC蛋白进行分析，共发现有7条肽段的得分大于或等于144分。其中第①、④号肽，即YLLPRRGPRL(core35～44)和DLMGYIPLV(core132～140)肽段为文献报道〔6〕的HLA-A2.1限制性CTL识别表位；第⑦号肽，即FLLALLSCL(core177～185)与文献报道〔6〕的另一表位LLALLSCLTV(core178～187)基本一致。其余肽段尚未见为HLA-A2限制性CTL识别表位的报道。从预测的7条肽中选出其中的4条，即(①、②、④、和⑤号肽)进行人工合成，用于细胞杀伤实验。
表2 HCVC蛋白上HLA-A2分子限制性CTL识别表位的预测结果
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Tab 2 Predicted results of epitopes recognized by HLA-A2 restricted CTL on HCV C protein No.
Peptide sequence
Peptide site
Score
①
YLLPRRGPRLa
35～ 44
144
②
NLGKVIDTL
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118～ 126
576
③
TLTCGFADL
125～ 133
144
④
DLMGYIPLVa
132～ 140
576
⑤
ALAHGVRAL
, 百拇医药
150～ 158
576
⑥
NLPGCSFSIFL
168～ 176
288
⑦
FLLALLSCLb
177～ 185
144
a:Reported epitopes recognized by HLA-A2.1 restricted CTL； b:Almost consistent with the reported epitope LLALLSCLTV(core 178～ 187)
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2.2合成肽对供血员外周血中CTL的活化当PBMC在体外接受两次多肽刺激后，4名HLAA2(+),HCVRNA(+)供血员中，有两名供血员的PBMC显示对⑤号肽标记的自体靶细胞有溶解作用，其中一名的杀伤率达37.5%(表3)。另一名供血员的PBMC对⑤号肽标记的自体靶细胞杀伤率为15.8%。用抗CD4mAb阻断后杀伤率无明显变化；而用抗CD8mAb阻断后杀伤率明显减少(图1)。
表3 C蛋白上预测多肽对CTL的诱导活性△
Tab 3 CTL activity induced by predicted peptides on C protein Patient or controls
HLA type
51Cr-release(% lysis)
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A
B
①
②
④
⑤
Experiment group
Li
2
31
51
16
-2.6
, http://www.100md.com 9.6
0.5
NT
Zhang
2
11
8
27
0.4
NT
2.4
6.9
Tang
2
, 百拇医药
33
44
55
-3.8
5.1
3.3
37.5
Zhang
2
11
62
35
-1.1
, 百拇医药 9.8
8.4
12.2
Healthy controls
Zheng
2
11
62
39
-2.9
8.0
6.8
0.2
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Wang
2
24
61
46
0.2
NT
3.7
10.0
Patient controls
Li
11
62
, 百拇医药
35
-2.6
2.6
2.3
1.8
Zhu
3
33
17
35
-2.5
1.6
0
, http://www.100md.com 2.5
△ CTL activity induced by peptides at E/T ratio of 50∶ 1; NT: No test； ① ,② ,④ and⑤ represent YLLPRRGPRL(core 35～ 44), NLGKVIDTL(core 118～ 126)， DLMGYIPLV(core 132～ 140) and ALAHGVRAL(core 150～ 158), respectively.
图1用mAb阻断来源于张某CTL的活性
Fig 1 Blocking of CTL activity of Mr. Zhang with mAbs
3 讨论
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CTL介导的细胞免疫应答可能在抗HCV感染中起重要作用。许多学者已先后在HCV患者的PBMC及肝浸润淋巴细胞中，发现存在HCV特异性CTL，并鉴定出了许多CTL识别表位〔2，3〕。因HLAA2在大多数人群中呈高基因频率出现，为此，Cerny等〔3〕首先把研究重点放在HLA-A2限制性CTL识别表位，并在HCV各蛋白区确定出一些CTL识别表位。但由于研究方法的限制，工作量较大，成本也较高，使一般实验室难以进行。本研究的策略是通过自行设计的计算机程序，找出含有HLA-A2结合基序的HCV抗原肽,并通过51Cr4h释放分析检验预测的结果。
3.1 HLA-A2限制性CTL识别表位的预测 文献报道〔2，3〕的寻找CTL识别表位的方法分两个步骤：首先用重叠多肽法合成若干条多肽，然后再进行实验鉴别。到目前为止，用这种方法在HCVC区共鉴别出3个表位，即YLLPRRGPRL(core35～44),DLMGYIPLV(core132～140)和LLALLSCLTV(core178～187)。这种实验方法的优点是直接、可靠；缺点是工作量大、花费高，一般实验室难以进行。
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本文用计算机程序对HCVC蛋白进行了分析。结果发现，仅有7条肽段的得分大于或等于144分，其中包括文献报道的两个HLA-A2限制性CTL识别表位，即YLLPRRGPRL(core35～44)和DLMGYIPLV(core132～140)。另1条肽段，即FLLALLSCL(core177～185)与文献报道的另1表位LLALLSCL-TV(core178～187)基本一致。有针对性的对这7条肽段进行研究将能简化实验步骤、节约费用。选择其中的4条，即①、②、④和⑤号肽进行人工合成，然后用于细胞杀伤实验。
3.2 合成肽对供血员外周血CTL的活化 本研究利用细胞杀伤试验的方法，对预测所得的4条HCVC区抗原肽进行了检验。发现4名HLA-A2呈阳性。HCVRNA阳性供血员中,有两名供血员的PBMC显示对⑤号肽标记的自体靶细胞有杀伤作用,杀伤率分别为37.5%和15.8%，其余3条肽未见有明显的CTL诱导作用。CTL应答在两名健康且HLA-A2阳性供血员及两名HCVRNA+、HLA-A2-供血员中反应不明显。
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根据文献报道〔7〕,当杀伤率≥15%时，可被认为是特异性杀伤。在效靶比为50∶1时，唐某的PBMC对⑤肽标记的自体靶细胞的杀伤率高达37.5%；供血员张某的PBMC杀伤率在效靶比为100∶1时为15.8%;抗CD4mAb阻断未见明显变化，抗CD8mAb孔使杀伤率降至7.20%。表明杀伤可能是由CD8+T细胞而非CD4+T细胞所致，并提示⑤号肽可能为HLA-A2限制性CTL识别表位。值得指出的是，由于本研究中自发释放率较高，接近于文献要求的自发释放不能超过最高释放的30%的临界水平〔8〕，故对这一结果尚有待进一步研究证实。
其余3条多肽,包括文献报道的两个CTL识别表位，即YLLPRRGPRL(core35～44)和DLMGYIPLV(core132～140),在本研究中虽未发现明显的CTL诱导活性,但也不能就此认为不是HLA-A2限制性CTL识别表位。原因可能是文献报道的两个表位为HLA-A2.1限制CTL识别表位，而本研究未进行HLA-A2亚型测定，不同亚型的HLA-A2限制性CTL识别表位可能不同；也可能是HCV患者体内HCV蛋白序列与合成多肽的序列不完全一致所致，这一结果也有待进一步实验证实。
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*国家自然科学基金资助项目,No.39570634
作者简介：周红超，男，27岁，博士
西安市长乐西路17号，Tel.(029)3221616-75293
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(收稿1 998-07-16 修回 1998-09-07), http://www.100md.com