汉坦病毒S基因－多肽噬菌体表面呈现文库的构建
作者：白雪帆 FackF 杭长寿 BautzEKF
单位：白雪帆 杭长寿(第四军医大学唐都医院感染科，西安710038,)；FackF BautzEKF(德国海德堡大学分子遗传学研究所2中国预防医学科学院病毒学研究所出血热研究室)
关键词：噬菌体肽库；汉坦病毒；核衣壳蛋白
细胞与分子免疫学杂志990101
摘要 目的：构建汉坦病毒S基因-多肽片断噬菌体表面呈现文库，以期筛检出抗汉坦病毒mAb识别的病毒核衣壳蛋白抗原表位。方法：用DNaseI随机降解汉坦病毒76-118株S基因，回收50bp300bp小的DNA片断，与克隆接头连接后插入经SfiI线性化的噬菌体载体fuse5，电穿孔导入MC1061菌建库。转化菌培养扩增后提取重组噬菌体，感染K91细胞测定库容，并随机挑选若干克隆测序。结果：构建的S基因噬菌体文库库容(以转导单位TU表示)为3.375×1010。抽检的8个克隆中有5个含有4种大小和组成不同的正确插入的S基因片断，另外3个克隆均为野生型载体的回复突变。结论：所建文库有足够大的库容和较好的多样性，预计可以满足筛检汉坦病毒核衣壳蛋白抗原表位的需要。
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中国图书资料分类号 Q78
Construction of phage peptide library for hantaan virus nucleocapsid protein
Bai Xuefan, Fack F1 , Hang Changshou 2, Bautz EKF 1 (Tangdu Hospital,Fourth Military Medical University, Xi＇an 710038 1 Institute of Molecular Genetics, Heidelberg, D-69120 Germany; 2Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine)
Keywouds phage peptide library hantavirus nucleocapsid protein
, 百拇医药
Abstract Aim:To map the epitopes on Hantaan virus nucleocapsid protein by monoclonal antibodies and phage peptide library.Methods:Hantaan virus S gene was digested with DNase I and the fragments between 50 bp 300 bp were recovered. After ligation with linkers, the DNA fragments were ligated with the vector, phage fuse 5 which has been cut with Sfi I. Then the recombinants were transfected into E.coli MC1061 by electroporation and the phages were extracted from MC1061 culture. The library size was measured after infecting K91 cells and 8 clones were selected randomly for DNA sequencing. Results: The library size was about 3.37× 1010 transducing units, and out of the 8 clones, 5 harbored S gene fragments and 3 were revertants. Conclusion: The library size and diversity may meet the need for mapping and screening of nucleocapsid protein epitopes.
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汉坦病毒(Hantavirus,HV)归属于布尼亚病毒科，是一类基因组呈3节段的负链RNA病
毒〔1〕，为肾综合征出血热(HFRS)或汉坦病毒肺综合征(HPS)的病原。HV(汉坦病毒)的3种结构蛋白—核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)、囊膜糖蛋白(Glycoprotein,GP或G)G1和G2，分别由基因组中的S片段和M片段编码〔2〕，其中NP的相对分子质量(Mr)约为45000，具有较强的抗原性及免疫原性。动物实验表明，用NP免疫后可部分防护HV的致死性感染，并可增强G1或/和G2的免疫防护效果〔3〕。
早在80年代中后期，国内外学者就已报告用mAb，对HV的上述结构蛋白进行了抗原性和功能性表位(epitope)的分析〔4-7〕，表明HVNP上既有组特异性抗原表位，又有型特异性抗原表位：且NP上的大多数抗原表位结构较稳定，经加热变性后进行Western blot检测，仍很容易检出，因此可能为连续抗原表位(即线性抗原表位，Linear epitope)。近年用合成多肽及分段表达的重组NP或多肽进行研究表明，主要的抗原表位位于NP氨基端的第1～119位氨基酸(aa1～119)或aa7～94范围内〔8，9〕。尽管HV核蛋白抗原表位的研究已经取得上述重要进展，但是总的来说，目前所鉴定的抗原表位多为功能单位，其精确的基因定位尚不清楚。为此，我们应用近年发展起来的噬菌体肽库技术，进行了HV属中部分血清型病毒NP的线性抗原表位的基因定位研究，本文首先报道HV属中汉坦病毒(Hantaan virus,HTNV)S基因-多肽片段噬菌体表面呈现文库的构建。
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1 材料和方法
1.1 噬菌体载体的制备 噬菌体表达载体fuse5,fuse2及大肠杆菌MC1061和K91/kan,由美国密苏里大学Smith,GP教授惠赠。
1.1.1噬菌体fuse5复制型(RF)的制取接种少量冻存的fuse5转化的MC1061菌于2000mlLBtet(四环素，20mg/L)培养基中，37℃振摇过夜。次日4℃5000r/min离心，用Jetstar质粒提取纯化系统(Genomed公司产品，NC，USA)提取噬菌体DNA，与1.57g/ml密度的EB-CsCl液混合后装入离心管，以BeckmanVTi50固定转角转头20℃40kr/min离心65h，用注射器小心回收共价闭环超螺旋的噬菌体DNA，常规去除EB和CsCl，加入70%体积的异丙醇和1/10体积3mol/LNaAc沉淀。再用70%乙醇洗盐后，以无离子水溶解，紫外定量。通常每2000ml培养可制备约50μg-100μg的fuse5RF。
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1.1.2载体的线性化最适量fuse5复制型DNA，加入10×缓冲液，终浓度为1g/L的BSA及SfiI
(20u/μl，Biolabs,MA,USA)0.5～2.0μl/μgDNA，于50℃消化2.5h，酚氯仿抽提，异丙醇醋酸钠沉淀，在1.2%琼脂糖上电泳观察酶切结果，并进行自身连接试验以进一步了解酶切质量。
1.2 HTNVS基因的随机消化 含HTNV76/118株全S基因的重组质粒pUC18-HTNV-S为美国陆军传染病研究所Schmaljohn,CS博士惠赠。取冻存的转化菌NM522重新活化接种平皿，挑取单菌落扩大培养，常规大提质粒，测定质粒浓度和纯度。以HindⅢ和PstI对提取的pUC18HTNVS进行酶切鉴定，高压液相回收PstI消化的S基因。将以1×DNase I缓冲液稀释的DNase I(7.5u/μl，GIBCO BRL，MD，USA)，加入下列反应体系中：2×DNase I缓冲液67.5μl，S基因DNA10μg/5μl，25mmol MnSO410 μl，超纯水52.5 μl，不同稀释度的DNaseI 15μl。其中DNaseI的终稀释度分别为2.5×10-6,5×10-6，1×10-5，2.5×10-5和5×10-5。16℃反应10min后，加入10μl0.1mol/LEDTA终止反应。将消化产物加载在12%TBE聚丙烯酰胺凝胶上电泳，切取50bp～300bp大小的降解DNA片段，电洗脱回收，用T4多核苷酸激酶磷酸化，K1enow补平，取小量样品进行自身连接试验。
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1.3 克隆接头的设计及其与S基因片段的连接 克隆接头参照文献〔10〕合成，具体如下图。用前两两退火以成互补双链。上述克隆接头与降解的S基因片段按4∶1(W/W)比例，以T4DNA连接酶(GibcoRBL)4℃过夜连接，连接产物再次加载在12%TBE聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电洗脱回收50bp～300bp大小的DNA片段。
FUSE P5
5'-CTGGCGGTG
FUSE P3
CACCGCCAGCTG
TGCGACCGCCAC
GTGGCGGTC-5'
FUSE C5
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5'-CTGGCTGCG
FUSE C3
TGCGGTCCAGCTG
TGCGACCGACGC
ACGCCAGGTC-5'
1.4 基因片段与载体的连接及连接产物的转化 取上述加接克隆接头的DNA片段和线性化的fuse5，按下列比例进行连接：DNA片段1μg,线性化的载体DNA4μg，10×连接缓冲液2μl，T4DNA连接酶1.5μl(Gibco RBL,1u/μl)，超纯水至总体积为20μl。于4℃过夜连接后，以酚-氯仿纯化回收连接的产物。分批电穿孔转入MC1061菌(使用Biorad gene pulser system II,每管约2.5μgDNA)后，立即加入1ml含0.2mg/L四环素的SOC培基；37℃培养1h后，将全部培养物涂布于LB/tet平板，37℃继续培养过液。次日将全部生长菌落刮下，收集于离心管中，加入少量LB/tet洗涤后也一并收集于离心管中，经5000r/min离心10min，弃沉淀，再以8000r/min离心15min，取上清加入PEG8000，终浓度为2.2%和NaCl(终浓度为430mmol/L)，充分混匀后，4℃过夜沉淀。次日于4℃，11kr/min离心40min，沉淀的噬菌体以少量TBS溶解(总量约为1.5ml)，即为初始文库。
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1.5 初始文库库容的计算 取上述重组噬菌体悬液，以TBS稀释为10-3和10-5，各取10μl与20μl预先饥饿培养的K91/Kan细胞混合，置室温20min后，加入970μlLB/tet(0.2mg/L)/Kan(100mg/L),37℃40min后补加tet至20mg/L，各取200μl涂LB/tet平板，于37℃过夜培养，次日计数菌落数。同时以空白LB/tet200μl和适当浓度fuse2涂布LB/tet平板分别作为阴阳性对照。
1.6 初始文库克隆的随机测定 从上述K91/Kan平板中，随机挑取8个克隆(菌落)，经过夜扩大培养后，常规提取单链DNA模板，以Pharmacia的T7Sequencing Kit测定其核苷酸序列。
2 结果
2.1 fuse 5的结构及其复制型的线性化 所获结果见图1和图2。从图1可见，在fuse5的2259和2273碱基各有一个单向SfiI的酶切位点，其间的14个bp的寡核苷酸即填充片段如果去除，线性载体将不可能发生自身环化。
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图1 噬菌体载体fuse5单一酶切位点示意图
Fig 1 Single cutting restriction of vector fuse 5
图2 载体fuse5经SfiI消化后的电泳结果(1.2%的琼脂糖)
Fig 2 Electrophoresis on 1.2% agarose after digestion of fuse 5 with Sfi I
1: DNA marker, λ /Hind III; 2～ 5: fuse 5 cut with Sfi I; 6: fuse 5 uncut
2.2 pUC18-HTNV-S的酶切鉴定及DNaseI消化结果见图3，4。
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图3 质粒pUC-18-HTNV-S用Hind III和Pst I消化后的电泳结果
Fig 3 Digestion of pUC18-HTNV-S with Hind III and Pst I
1: DNA marker, λ /Hind III; 2: pUC18-HTNV-S; 3:pUC18-HTNV-S cut
with Hind III; 4: pUC18-HTNV-S cut with Pst I
图4 用DNaseI随机降解HTNVS基因的PAGE结果
Fig 4 PAGE analysis after digestion of Hantaan virus S gene with DNase I
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1,7: 50 bp DNA marker; 8: 123 bp DNA marker; 2～6: digested products
of S gene with different dilution of DNase I (final dilution is 5× 10-5
2.5× 10-5，1× 10-5, 5× 10-6 and 2.5× 10-6, respectively)
2.3 初始文库的库容计算 由于重组噬菌体形成的菌斑通常很少，因此初始文库的测算通常是通过转化K91细胞培养后计算菌落数(也称为转导单位，transducing units,TU)来完成的。如前所述，取TBS稀释为10-3和10-5的少量重组噬菌体转化K91/Kan细胞并诱导培养后，各取200μl涂平板，并设LB培养基和少量fuse2噬菌体作为阴阳性对照，次日计数菌落数，结果10-3组平板菌落数太多，难以计数；10-5组约有450个菌落；LB空白对照组菌落数为0；阳性对照组为120个菌数。根据以上结果可以算出，该文库的库容为450×105×150×5≈3.375×1010TU。
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2.4 初始文库质量的初步鉴定 从S基因初始噬菌体文库中随机检测8个克隆以了解基因的连接情况，结果如表1。
表1 HTNV基因噬菌体文库克隆的随机测序结果
Tab 1 Sequencing of clones selected randomly from S gene-peptide phage library Types of clones
Numbers of clones tested
Types of inserts
Number with linkers without linkers
Normal ligation
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5/8
4
5
0
Revertants
3/8
1
0
.
由上表可知，自初始文库中随机检测的8个克隆，有5个在基因III的N端插入了DNaseI随机降解的S基因片段，且插入基因片段的大小均可使载体突变基因III的读框恢复；另有3个克隆为既无插入的靶基因、克隆接头和去除的填弃片段，同时缺失2个碱基而使载体的基因III读框恢复的回复突变体(revertant);由于这种回复突变体也恢复了野生型fuse噬菌体的感染功能，因此能够得到大量的扩增〔11〕。
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3 讨论
Fuse系列融合噬菌体为美国密苏里大学Smith,GP教授等在多年潜心研究噬菌体生物学和分子生物学的基础上，精心构建的fd-tet类丝状噬菌体表达载体，其特点为：①外源性基因的插入不会明显影响噬菌体载体基因III的生物学功能；②该类载体不仅含有四环素抗性基因，便于在相应的抗性培养中形成四环素抗性克隆，而且其伴随宿主菌大量增殖时对后者无严重影响；③Fuse5等载体的基因III功能(即感染宿主菌的功能)虽然基本丧失，但仍可通过其它转化方式导入受体菌并在其中大量扩增；而一旦插入的外源性基因使基因III的读框恢复，该类噬菌体便具有了感染功能，利用这一特性可以测定噬菌体文库的库容。反之，只有恢复了感染功能的重组噬菌体才是文库的基本构成单元；④该类载体具有丝状噬菌体的共有优点，如可以方便的大量扩增，易于制取单链DNA模板用于序列测定，及进行寡核苷酸引导的定点突变等。正因为该类载体具有上述的生物学特性，所以在当前迅速发展的噬菌体表面表达技术中得到广泛的应用。
, 百拇医药 对噬菌体表位文库(phage epitope libraries)或多肽文库(peptide libraries)的质量评价主要有两项标准：一是库容的大小(library size)，即其所含重组噬菌体的数目；二是文库中克隆的多样性(diversity)，即插入子的种类，二者越多，从文库中筛检到靶基因-多肽片段的可能性越大，文库的质量也就越高。本文构建的多肽文库属于靶基因文库，通常在已知研究对象的基因序列时构建该类文库，用于筛检已有配基(如抗体)所对应的靶肽(如抗原表位等)。此类文库的建立相对简单，成本较低，近年已有许多成功应用的报道。为了保证HTNVS基因噬菌体肽库的质量，作者在文库构建中注意了以下几个技术环节：①S基因DNaseI降解的随机性。先后进行了多次预试验，以确保对靶基因适度的酶促降解，收获最大量的含有任意大小的随机降解DNA片断。考虑到大多数连续性抗原表位的大小多为15肽，且插入的基因片断过大对载体表达效率的影响，本研究截取了50bp300bp大小的DNA片断作为插入对象。②S基因和载体酶切后，均取少量做自身连接试验，以进一步了解酶切质量。特别是载体酶切完全且去除了填充片断后自身连接应无效，否则将引起下一步实验中载体的自身环化。③每一步酶促操作后，应尽可能对产物进行纯化。本项实验大部分产物均经高压液相层析纯化〔12〕，因此保证了实验质量。④为了提高对受体菌的转化效率，连接产物应分批电击转入。⑤为了避免回复突变的野生型载体和某些克隆的优势生长，转化产物应全部适当稀释后进行半固体(平板)培养。
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文库质量的测评一般采用对抽检的克隆进行PCR检测，其优点是简便易行，但提供的信息有限。本文用DNA序列测定对初始文库中的克隆进行随机抽检，虽然所测样本较小，但可从一个侧面反映本文库的情况。测定结果表明，本文库中回复突变为3/8(37.5%)，比一些文献报道的略高；据此实际计算出的库容约相当于3.375×1010×5/8≈2.11×1010TU,比许多已报道的成功检出抗原表位的文库略大或相当。此外，正确插入的5个重组子中有4种不同的类型，表明本文库有较好的多样性。以上对文库的粗测表明该文库基本可以满足下一步抗体筛检实验的要求。
*欧共体科委资助项目，NO.CI1-CT94-0024
作者简介：白雪帆，男，47岁，教授，博士
西安市灞桥区新寺路1号，Tel.(029)3510595-77452
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参考文献
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(收稿 1998-07-22 修回 1998-09-15), 百拇医药
单位：白雪帆 杭长寿(第四军医大学唐都医院感染科，西安710038,)；FackF BautzEKF(德国海德堡大学分子遗传学研究所2中国预防医学科学院病毒学研究所出血热研究室)
关键词：噬菌体肽库；汉坦病毒；核衣壳蛋白
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摘要 目的：构建汉坦病毒S基因-多肽片断噬菌体表面呈现文库，以期筛检出抗汉坦病毒mAb识别的病毒核衣壳蛋白抗原表位。方法：用DNaseI随机降解汉坦病毒76-118株S基因，回收50bp300bp小的DNA片断，与克隆接头连接后插入经SfiI线性化的噬菌体载体fuse5，电穿孔导入MC1061菌建库。转化菌培养扩增后提取重组噬菌体，感染K91细胞测定库容，并随机挑选若干克隆测序。结果：构建的S基因噬菌体文库库容(以转导单位TU表示)为3.375×1010。抽检的8个克隆中有5个含有4种大小和组成不同的正确插入的S基因片断，另外3个克隆均为野生型载体的回复突变。结论：所建文库有足够大的库容和较好的多样性，预计可以满足筛检汉坦病毒核衣壳蛋白抗原表位的需要。
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Construction of phage peptide library for hantaan virus nucleocapsid protein
Bai Xuefan, Fack F1 , Hang Changshou 2, Bautz EKF 1 (Tangdu Hospital,Fourth Military Medical University, Xi＇an 710038 1 Institute of Molecular Genetics, Heidelberg, D-69120 Germany; 2Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine)
Keywouds phage peptide library hantavirus nucleocapsid protein
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Abstract Aim:To map the epitopes on Hantaan virus nucleocapsid protein by monoclonal antibodies and phage peptide library.Methods:Hantaan virus S gene was digested with DNase I and the fragments between 50 bp 300 bp were recovered. After ligation with linkers, the DNA fragments were ligated with the vector, phage fuse 5 which has been cut with Sfi I. Then the recombinants were transfected into E.coli MC1061 by electroporation and the phages were extracted from MC1061 culture. The library size was measured after infecting K91 cells and 8 clones were selected randomly for DNA sequencing. Results: The library size was about 3.37× 1010 transducing units, and out of the 8 clones, 5 harbored S gene fragments and 3 were revertants. Conclusion: The library size and diversity may meet the need for mapping and screening of nucleocapsid protein epitopes.
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汉坦病毒(Hantavirus,HV)归属于布尼亚病毒科，是一类基因组呈3节段的负链RNA病
毒〔1〕，为肾综合征出血热(HFRS)或汉坦病毒肺综合征(HPS)的病原。HV(汉坦病毒)的3种结构蛋白—核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)、囊膜糖蛋白(Glycoprotein,GP或G)G1和G2，分别由基因组中的S片段和M片段编码〔2〕，其中NP的相对分子质量(Mr)约为45000，具有较强的抗原性及免疫原性。动物实验表明，用NP免疫后可部分防护HV的致死性感染，并可增强G1或/和G2的免疫防护效果〔3〕。
早在80年代中后期，国内外学者就已报告用mAb，对HV的上述结构蛋白进行了抗原性和功能性表位(epitope)的分析〔4-7〕，表明HVNP上既有组特异性抗原表位，又有型特异性抗原表位：且NP上的大多数抗原表位结构较稳定，经加热变性后进行Western blot检测，仍很容易检出，因此可能为连续抗原表位(即线性抗原表位，Linear epitope)。近年用合成多肽及分段表达的重组NP或多肽进行研究表明，主要的抗原表位位于NP氨基端的第1～119位氨基酸(aa1～119)或aa7～94范围内〔8，9〕。尽管HV核蛋白抗原表位的研究已经取得上述重要进展，但是总的来说，目前所鉴定的抗原表位多为功能单位，其精确的基因定位尚不清楚。为此，我们应用近年发展起来的噬菌体肽库技术，进行了HV属中部分血清型病毒NP的线性抗原表位的基因定位研究，本文首先报道HV属中汉坦病毒(Hantaan virus,HTNV)S基因-多肽片段噬菌体表面呈现文库的构建。
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1.1 噬菌体载体的制备 噬菌体表达载体fuse5,fuse2及大肠杆菌MC1061和K91/kan,由美国密苏里大学Smith,GP教授惠赠。
1.1.1噬菌体fuse5复制型(RF)的制取接种少量冻存的fuse5转化的MC1061菌于2000mlLBtet(四环素，20mg/L)培养基中，37℃振摇过夜。次日4℃5000r/min离心，用Jetstar质粒提取纯化系统(Genomed公司产品，NC，USA)提取噬菌体DNA，与1.57g/ml密度的EB-CsCl液混合后装入离心管，以BeckmanVTi50固定转角转头20℃40kr/min离心65h，用注射器小心回收共价闭环超螺旋的噬菌体DNA，常规去除EB和CsCl，加入70%体积的异丙醇和1/10体积3mol/LNaAc沉淀。再用70%乙醇洗盐后，以无离子水溶解，紫外定量。通常每2000ml培养可制备约50μg-100μg的fuse5RF。
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1.1.2载体的线性化最适量fuse5复制型DNA，加入10×缓冲液，终浓度为1g/L的BSA及SfiI
(20u/μl，Biolabs,MA,USA)0.5～2.0μl/μgDNA，于50℃消化2.5h，酚氯仿抽提，异丙醇醋酸钠沉淀，在1.2%琼脂糖上电泳观察酶切结果，并进行自身连接试验以进一步了解酶切质量。
1.2 HTNVS基因的随机消化 含HTNV76/118株全S基因的重组质粒pUC18-HTNV-S为美国陆军传染病研究所Schmaljohn,CS博士惠赠。取冻存的转化菌NM522重新活化接种平皿，挑取单菌落扩大培养，常规大提质粒，测定质粒浓度和纯度。以HindⅢ和PstI对提取的pUC18HTNVS进行酶切鉴定，高压液相回收PstI消化的S基因。将以1×DNase I缓冲液稀释的DNase I(7.5u/μl，GIBCO BRL，MD，USA)，加入下列反应体系中：2×DNase I缓冲液67.5μl，S基因DNA10μg/5μl，25mmol MnSO410 μl，超纯水52.5 μl，不同稀释度的DNaseI 15μl。其中DNaseI的终稀释度分别为2.5×10-6,5×10-6，1×10-5，2.5×10-5和5×10-5。16℃反应10min后，加入10μl0.1mol/LEDTA终止反应。将消化产物加载在12%TBE聚丙烯酰胺凝胶上电泳，切取50bp～300bp大小的降解DNA片段，电洗脱回收，用T4多核苷酸激酶磷酸化，K1enow补平，取小量样品进行自身连接试验。
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1.3 克隆接头的设计及其与S基因片段的连接 克隆接头参照文献〔10〕合成，具体如下图。用前两两退火以成互补双链。上述克隆接头与降解的S基因片段按4∶1(W/W)比例，以T4DNA连接酶(GibcoRBL)4℃过夜连接，连接产物再次加载在12%TBE聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电洗脱回收50bp～300bp大小的DNA片段。
FUSE P5
5'-CTGGCGGTG
FUSE P3
CACCGCCAGCTG
TGCGACCGCCAC
GTGGCGGTC-5'
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FUSE C3
TGCGGTCCAGCTG
TGCGACCGACGC
ACGCCAGGTC-5'
1.4 基因片段与载体的连接及连接产物的转化 取上述加接克隆接头的DNA片段和线性化的fuse5，按下列比例进行连接：DNA片段1μg,线性化的载体DNA4μg，10×连接缓冲液2μl，T4DNA连接酶1.5μl(Gibco RBL,1u/μl)，超纯水至总体积为20μl。于4℃过夜连接后，以酚-氯仿纯化回收连接的产物。分批电穿孔转入MC1061菌(使用Biorad gene pulser system II,每管约2.5μgDNA)后，立即加入1ml含0.2mg/L四环素的SOC培基；37℃培养1h后，将全部培养物涂布于LB/tet平板，37℃继续培养过液。次日将全部生长菌落刮下，收集于离心管中，加入少量LB/tet洗涤后也一并收集于离心管中，经5000r/min离心10min，弃沉淀，再以8000r/min离心15min，取上清加入PEG8000，终浓度为2.2%和NaCl(终浓度为430mmol/L)，充分混匀后，4℃过夜沉淀。次日于4℃，11kr/min离心40min，沉淀的噬菌体以少量TBS溶解(总量约为1.5ml)，即为初始文库。
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1.5 初始文库库容的计算 取上述重组噬菌体悬液，以TBS稀释为10-3和10-5，各取10μl与20μl预先饥饿培养的K91/Kan细胞混合，置室温20min后，加入970μlLB/tet(0.2mg/L)/Kan(100mg/L),37℃40min后补加tet至20mg/L，各取200μl涂LB/tet平板，于37℃过夜培养，次日计数菌落数。同时以空白LB/tet200μl和适当浓度fuse2涂布LB/tet平板分别作为阴阳性对照。
1.6 初始文库克隆的随机测定 从上述K91/Kan平板中，随机挑取8个克隆(菌落)，经过夜扩大培养后，常规提取单链DNA模板，以Pharmacia的T7Sequencing Kit测定其核苷酸序列。
2 结果
2.1 fuse 5的结构及其复制型的线性化 所获结果见图1和图2。从图1可见，在fuse5的2259和2273碱基各有一个单向SfiI的酶切位点，其间的14个bp的寡核苷酸即填充片段如果去除，线性载体将不可能发生自身环化。
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图1 噬菌体载体fuse5单一酶切位点示意图
Fig 1 Single cutting restriction of vector fuse 5
图2 载体fuse5经SfiI消化后的电泳结果(1.2%的琼脂糖)
Fig 2 Electrophoresis on 1.2% agarose after digestion of fuse 5 with Sfi I
1: DNA marker, λ /Hind III; 2～ 5: fuse 5 cut with Sfi I; 6: fuse 5 uncut
2.2 pUC18-HTNV-S的酶切鉴定及DNaseI消化结果见图3，4。
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图3 质粒pUC-18-HTNV-S用Hind III和Pst I消化后的电泳结果
Fig 3 Digestion of pUC18-HTNV-S with Hind III and Pst I
1: DNA marker, λ /Hind III; 2: pUC18-HTNV-S; 3:pUC18-HTNV-S cut
with Hind III; 4: pUC18-HTNV-S cut with Pst I
图4 用DNaseI随机降解HTNVS基因的PAGE结果
Fig 4 PAGE analysis after digestion of Hantaan virus S gene with DNase I
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1,7: 50 bp DNA marker; 8: 123 bp DNA marker; 2～6: digested products
of S gene with different dilution of DNase I (final dilution is 5× 10-5
2.5× 10-5，1× 10-5, 5× 10-6 and 2.5× 10-6, respectively)
2.3 初始文库的库容计算 由于重组噬菌体形成的菌斑通常很少，因此初始文库的测算通常是通过转化K91细胞培养后计算菌落数(也称为转导单位，transducing units,TU)来完成的。如前所述，取TBS稀释为10-3和10-5的少量重组噬菌体转化K91/Kan细胞并诱导培养后，各取200μl涂平板，并设LB培养基和少量fuse2噬菌体作为阴阳性对照，次日计数菌落数，结果10-3组平板菌落数太多，难以计数；10-5组约有450个菌落；LB空白对照组菌落数为0；阳性对照组为120个菌数。根据以上结果可以算出，该文库的库容为450×105×150×5≈3.375×1010TU。
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2.4 初始文库质量的初步鉴定 从S基因初始噬菌体文库中随机检测8个克隆以了解基因的连接情况，结果如表1。
表1 HTNV基因噬菌体文库克隆的随机测序结果
Tab 1 Sequencing of clones selected randomly from S gene-peptide phage library Types of clones
Numbers of clones tested
Types of inserts
Number with linkers without linkers
Normal ligation
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5/8
4
5
0
Revertants
3/8
1
0
.
由上表可知，自初始文库中随机检测的8个克隆，有5个在基因III的N端插入了DNaseI随机降解的S基因片段，且插入基因片段的大小均可使载体突变基因III的读框恢复；另有3个克隆为既无插入的靶基因、克隆接头和去除的填弃片段，同时缺失2个碱基而使载体的基因III读框恢复的回复突变体(revertant);由于这种回复突变体也恢复了野生型fuse噬菌体的感染功能，因此能够得到大量的扩增〔11〕。
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3 讨论
Fuse系列融合噬菌体为美国密苏里大学Smith,GP教授等在多年潜心研究噬菌体生物学和分子生物学的基础上，精心构建的fd-tet类丝状噬菌体表达载体，其特点为：①外源性基因的插入不会明显影响噬菌体载体基因III的生物学功能；②该类载体不仅含有四环素抗性基因，便于在相应的抗性培养中形成四环素抗性克隆，而且其伴随宿主菌大量增殖时对后者无严重影响；③Fuse5等载体的基因III功能(即感染宿主菌的功能)虽然基本丧失，但仍可通过其它转化方式导入受体菌并在其中大量扩增；而一旦插入的外源性基因使基因III的读框恢复，该类噬菌体便具有了感染功能，利用这一特性可以测定噬菌体文库的库容。反之，只有恢复了感染功能的重组噬菌体才是文库的基本构成单元；④该类载体具有丝状噬菌体的共有优点，如可以方便的大量扩增，易于制取单链DNA模板用于序列测定，及进行寡核苷酸引导的定点突变等。正因为该类载体具有上述的生物学特性，所以在当前迅速发展的噬菌体表面表达技术中得到广泛的应用。
, 百拇医药 对噬菌体表位文库(phage epitope libraries)或多肽文库(peptide libraries)的质量评价主要有两项标准：一是库容的大小(library size)，即其所含重组噬菌体的数目；二是文库中克隆的多样性(diversity)，即插入子的种类，二者越多，从文库中筛检到靶基因-多肽片段的可能性越大，文库的质量也就越高。本文构建的多肽文库属于靶基因文库，通常在已知研究对象的基因序列时构建该类文库，用于筛检已有配基(如抗体)所对应的靶肽(如抗原表位等)。此类文库的建立相对简单，成本较低，近年已有许多成功应用的报道。为了保证HTNVS基因噬菌体肽库的质量，作者在文库构建中注意了以下几个技术环节：①S基因DNaseI降解的随机性。先后进行了多次预试验，以确保对靶基因适度的酶促降解，收获最大量的含有任意大小的随机降解DNA片断。考虑到大多数连续性抗原表位的大小多为15肽，且插入的基因片断过大对载体表达效率的影响，本研究截取了50bp300bp大小的DNA片断作为插入对象。②S基因和载体酶切后，均取少量做自身连接试验，以进一步了解酶切质量。特别是载体酶切完全且去除了填充片断后自身连接应无效，否则将引起下一步实验中载体的自身环化。③每一步酶促操作后，应尽可能对产物进行纯化。本项实验大部分产物均经高压液相层析纯化〔12〕，因此保证了实验质量。④为了提高对受体菌的转化效率，连接产物应分批电击转入。⑤为了避免回复突变的野生型载体和某些克隆的优势生长，转化产物应全部适当稀释后进行半固体(平板)培养。
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文库质量的测评一般采用对抽检的克隆进行PCR检测，其优点是简便易行，但提供的信息有限。本文用DNA序列测定对初始文库中的克隆进行随机抽检，虽然所测样本较小，但可从一个侧面反映本文库的情况。测定结果表明，本文库中回复突变为3/8(37.5%)，比一些文献报道的略高；据此实际计算出的库容约相当于3.375×1010×5/8≈2.11×1010TU,比许多已报道的成功检出抗原表位的文库略大或相当。此外，正确插入的5个重组子中有4种不同的类型，表明本文库有较好的多样性。以上对文库的粗测表明该文库基本可以满足下一步抗体筛检实验的要求。
*欧共体科委资助项目，NO.CI1-CT94-0024
作者简介：白雪帆，男，47岁，教授，博士
西安市灞桥区新寺路1号，Tel.(029)3510595-77452
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(收稿 1998-07-22 修回 1998-09-15), 百拇医药