一种快速单管小量提取质粒方法
作者：李永奇 张学庸 樊代明
单位：李永奇 张学庸 樊代明(第四军医大学西京医院消化病研究所，西安710032)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990127
质粒提取是分子生物学实验室一项最基本的工作。本文介绍了一种简便、迅速、单管操作的小量提取质粒方法，此法提取的质粒可直接用于酶切鉴定或转化,探针标记等。菌种为转化了重组pUC19质粒的DH5αE.coli。重组pUC19质粒为在HincII位点插入不同的PCR产物连接而成。
挑一个单菌落接种于5mlLB/Amp(含氨苄青霉素100mg/L)培养液中,37℃振荡过夜，将1.5ml菌液倒入1.5ml离心管中，室温下12000r/min离心15s，吸去上清；沉淀中加入100μlSTET(10%蔗糖，50mmol/LTris-ClpH8.0,10mmol/LEDTApH8.0,2.0%TritonX-100)。充分混悬细菌后,加入200μl0.2mol/LNaOH，轻柔混匀，静置1min，加入150μl3mol/L醋酸钠(pH4.8～5.2)，颠倒混匀，再加1μlRNaseA(20g/L)混匀后68℃水浴10min，12000rpm离心3min，用灭菌牙签或一次性枪头将沉淀挑出弃之，加入270μl(0.6V)异丙醇混匀后，室温静置5min，12000r/min离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀1遍，真空抽干，重溶于10μlTE或水中，直接用BamHI与HindIII酶切鉴定(图1)。
图1质粒DNA的酶切鉴定
M：PCRmarker;1,2:酶切后重组pUC19质粒
本方法从收集细菌到提取出质粒DNA，以及随后酶切鉴定等工作都可在同一Eppendorf管中进行，省去了大量转管移液操作，使质粒提取时间小于1h，使克隆鉴定等工作简便快捷；本法提取的质粒产量高，每毫升菌液可提出约5μg的pUC19质粒DNA，且无RNA及基因组DNA污染。另外发现，2V无水乙醇对蛋白质、小片段核酸及盐沉淀的作用较明显,沉淀物为块状；而0.6V异丙醇对蛋白质的沉淀作用不明显,沉淀呈点状。0.6V异丙醇对质粒的选择性沉淀作用接近于1V13%PEG(MW8000)。本法另一优点是，省去了酚与氯仿抽提过程,而是通过68℃水浴及0.6V异丙醇选择性沉淀作用而达到去除大部分蛋白质的目的,不用担心痕量酚对后续酶作用的影响。
作者简介：李永奇，男，32岁，博士生
西安市长乐西路15号，Tel.(029)3373773, http://www.100md.com
单位：李永奇 张学庸 樊代明(第四军医大学西京医院消化病研究所，西安710032)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990127
质粒提取是分子生物学实验室一项最基本的工作。本文介绍了一种简便、迅速、单管操作的小量提取质粒方法，此法提取的质粒可直接用于酶切鉴定或转化,探针标记等。菌种为转化了重组pUC19质粒的DH5αE.coli。重组pUC19质粒为在HincII位点插入不同的PCR产物连接而成。
挑一个单菌落接种于5mlLB/Amp(含氨苄青霉素100mg/L)培养液中,37℃振荡过夜，将1.5ml菌液倒入1.5ml离心管中，室温下12000r/min离心15s，吸去上清；沉淀中加入100μlSTET(10%蔗糖，50mmol/LTris-ClpH8.0,10mmol/LEDTApH8.0,2.0%TritonX-100)。充分混悬细菌后,加入200μl0.2mol/LNaOH，轻柔混匀，静置1min，加入150μl3mol/L醋酸钠(pH4.8～5.2)，颠倒混匀，再加1μlRNaseA(20g/L)混匀后68℃水浴10min，12000rpm离心3min，用灭菌牙签或一次性枪头将沉淀挑出弃之，加入270μl(0.6V)异丙醇混匀后，室温静置5min，12000r/min离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀1遍，真空抽干，重溶于10μlTE或水中，直接用BamHI与HindIII酶切鉴定(图1)。
图1质粒DNA的酶切鉴定
M：PCRmarker;1,2:酶切后重组pUC19质粒
本方法从收集细菌到提取出质粒DNA，以及随后酶切鉴定等工作都可在同一Eppendorf管中进行，省去了大量转管移液操作，使质粒提取时间小于1h，使克隆鉴定等工作简便快捷；本法提取的质粒产量高，每毫升菌液可提出约5μg的pUC19质粒DNA，且无RNA及基因组DNA污染。另外发现，2V无水乙醇对蛋白质、小片段核酸及盐沉淀的作用较明显,沉淀物为块状；而0.6V异丙醇对蛋白质的沉淀作用不明显,沉淀呈点状。0.6V异丙醇对质粒的选择性沉淀作用接近于1V13%PEG(MW8000)。本法另一优点是，省去了酚与氯仿抽提过程,而是通过68℃水浴及0.6V异丙醇选择性沉淀作用而达到去除大部分蛋白质的目的,不用担心痕量酚对后续酶作用的影响。
作者简介：李永奇，男，32岁，博士生
西安市长乐西路15号，Tel.(029)3373773, http://www.100md.com