抗肾综合征出血热病毒人杂交瘤细胞株的无血清培养*
作者：赵洪礼 聂晶 范永星 李忠义 张健 韦星呈 张秀梅
单位：赵洪礼 聂晶 范永星 李忠义(沈阳军区后勤部军事医学研究所，沈阳110034)；张健 韦星呈 张秀梅(辽宁省基础医学研究所)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990125
用于治疗的人单克隆抗体(mAb)不仅要有一定的数量，而且要有较高的纯度。体外大规模地培养杂交瘤细胞也许能够保证其数量，但因在培养基中要补充胎牛血清和其它蛋白成分〔1〕，可使后续mAb的纯化相当困难。所以，人们一直在研究人杂交瘤细胞的无血清培养技术，试图建立一种在无血清条件下，能大量培养人杂交瘤细胞的方法。本文中我们将1株抗肾综合征出血热病毒(HFRSV)人杂交瘤细胞2D5，用无血清培养，取得了一定的结果，现报道如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 人杂交瘤细胞 2D5细胞株为本室建立，可分泌抗HFRSV人mAbIgG〔2〕。
1.2 血清和培养基 胎牛血清(FBS)为Sigma公司产品。SFM无血清培养基为Gibco公司产品，内含胰岛素(10mg/L),转移因子(10mg/L)及乙醇胺(20mg/L)。RPMI-1640为Sigma公司产品。
1.3 主要试剂 羊抗人IgG及HRP标记的羊抗人IgG为Sigma公司产品，效价为1∶2000；标准人IgG为军事医学科学院产品，浓度为64g/L。
1.4 mAb分泌量的测定 采用双抗体夹心ELISA法，测定培养上清中人mAb的含量〔3,5〕。
1.5 培养方法 将1×108/L个细胞，分别在含10%，5%，2%，1%FBS和不含FBS的SFM及RPMI1640中培养1，2，3，4和5d,测定人杂交瘤细胞培养上清中的mAb含量。
, 百拇医药
2 结果
2.1 2D5细胞株在含FBS的SFM中培养 将浓度为1×108/L2D5细胞悬液，分别置于含10%，5%，2%和1%FBS的SFM培养基中。于培养后的第1，2，3，4和5d,分别计数细胞的浓度及测定培养上清中mAb的浓度，并与RPMI-1640培养基进行对照。结果表明，当血清浓度高于5%时，杂交瘤细胞在SFM和RPMI-1640培养基中的生长速度较快，分泌mAb的量也较高；当血清浓度为1%时，杂交瘤细胞在SFM培养基中能缓慢生长，mAb的分泌量也较高，但在RPMI-1640培养基中则不生长，也不分泌mAb(图1，2)。
图1 2D5细胞在含不同浓度FBS的RPMI-1640中的生长(A)及抗体分泌量(B)
, 百拇医药
图 2D5细胞在含不同浓度FBS的SFM中的生长(A)及抗体分泌量(B)
2.2 2D5细胞在不含FBS的SFM中的培养 将1×108个细胞/L的2D5细胞悬液，置于不含FBS的SFM培养基中培养。经过1周的驯化培养，已完全适应了SFM培养基，细胞的生长速度及mAb的分泌量，均达到用含血清培养基培养的水平；但用无血清RPMI-1640培基培养时，2D5细胞停止生长，也不分泌mAb。
3 讨论
分泌人mAb的杂交瘤细胞的无血清培养，对于大量制备、纯化人mAb具有重要的意义。但由于人杂交瘤细胞的来源及性质不同，目前尚没有一种能适用于各种人杂交瘤细胞的无血清培养基，所以每种人杂交瘤细胞株都必须寻找一种适合于其生长的无血清培养条件〔4〕。我们在建立了分泌抗HF-RSV人mAb杂交瘤细胞的基础上，进一步研究了2D5细胞株在无血清培养基SFM中生长和分泌mAb的情况。经与RPMI-1640培养基对比，证明2D5细胞株能够在无血清培养基SFM中生长，并能分泌mAb，细胞的生长速度及mAb的分泌量均能达到在有血清条件下的水平。对鼠抗HFRSVmAb的研究表明，该mAb能够有效地保护小鼠抵抗致死量HFRSV的攻击，提示该mAb可能成为一种治疗HFRS的特异性免疫制剂。本项研究为大量制备抗HFRSV人mAb供实际应用奠定了基础。
, 百拇医药
*辽宁省博士科研起动基金资助项目，No.961112
作者简介：赵洪礼，男，37岁，副研究员，博士
沈阳市孔雀河西街2号，Tel.(024)36303019
参考文献
[1]张元兴，魏明旺，董志峰.杂交瘤细胞的无血清蛋白培养.细胞与分子免疫学杂志，1997;13(S2)：71～73
[2]赵洪礼，张健，李忠义,等.抗肾综合征出血热病毒人单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步鉴定.中华实验和临床病毒学杂志，1997;11(1)：66～68
[3]徐志凯主编.实用单克隆抗体技术.西安:陕西科学技术出版社,1992:84～90
[4]Borrebaeck CAK, Danlieson L, Moller O, et al. Human monoclonal antibodies produced by primary in vitro immunization of peripheral blood lymphoctyes. Proc Natal Acad Sci USA, 1988; 85: 485～490
[5]赵洪礼，汪美先，温青莉,等.ELISA间接法检测肾综合征出血热病人血清中特异性抗体.沈阳部队医药，1993;6(5)：453～454
(收稿 1998-03-19 修回 1998-08-14), 百拇医药
单位：赵洪礼 聂晶 范永星 李忠义(沈阳军区后勤部军事医学研究所，沈阳110034)；张健 韦星呈 张秀梅(辽宁省基础医学研究所)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990125
用于治疗的人单克隆抗体(mAb)不仅要有一定的数量，而且要有较高的纯度。体外大规模地培养杂交瘤细胞也许能够保证其数量，但因在培养基中要补充胎牛血清和其它蛋白成分〔1〕，可使后续mAb的纯化相当困难。所以，人们一直在研究人杂交瘤细胞的无血清培养技术，试图建立一种在无血清条件下，能大量培养人杂交瘤细胞的方法。本文中我们将1株抗肾综合征出血热病毒(HFRSV)人杂交瘤细胞2D5，用无血清培养，取得了一定的结果，现报道如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 人杂交瘤细胞 2D5细胞株为本室建立，可分泌抗HFRSV人mAbIgG〔2〕。
1.2 血清和培养基 胎牛血清(FBS)为Sigma公司产品。SFM无血清培养基为Gibco公司产品，内含胰岛素(10mg/L),转移因子(10mg/L)及乙醇胺(20mg/L)。RPMI-1640为Sigma公司产品。
1.3 主要试剂 羊抗人IgG及HRP标记的羊抗人IgG为Sigma公司产品，效价为1∶2000；标准人IgG为军事医学科学院产品，浓度为64g/L。
1.4 mAb分泌量的测定 采用双抗体夹心ELISA法，测定培养上清中人mAb的含量〔3,5〕。
1.5 培养方法 将1×108/L个细胞，分别在含10%，5%，2%，1%FBS和不含FBS的SFM及RPMI1640中培养1，2，3，4和5d,测定人杂交瘤细胞培养上清中的mAb含量。
, 百拇医药
2 结果
2.1 2D5细胞株在含FBS的SFM中培养 将浓度为1×108/L2D5细胞悬液，分别置于含10%，5%，2%和1%FBS的SFM培养基中。于培养后的第1，2，3，4和5d,分别计数细胞的浓度及测定培养上清中mAb的浓度，并与RPMI-1640培养基进行对照。结果表明，当血清浓度高于5%时，杂交瘤细胞在SFM和RPMI-1640培养基中的生长速度较快，分泌mAb的量也较高；当血清浓度为1%时，杂交瘤细胞在SFM培养基中能缓慢生长，mAb的分泌量也较高，但在RPMI-1640培养基中则不生长，也不分泌mAb(图1，2)。
图1 2D5细胞在含不同浓度FBS的RPMI-1640中的生长(A)及抗体分泌量(B)
, 百拇医药
图 2D5细胞在含不同浓度FBS的SFM中的生长(A)及抗体分泌量(B)
2.2 2D5细胞在不含FBS的SFM中的培养 将1×108个细胞/L的2D5细胞悬液，置于不含FBS的SFM培养基中培养。经过1周的驯化培养，已完全适应了SFM培养基，细胞的生长速度及mAb的分泌量，均达到用含血清培养基培养的水平；但用无血清RPMI-1640培基培养时，2D5细胞停止生长，也不分泌mAb。
3 讨论
分泌人mAb的杂交瘤细胞的无血清培养，对于大量制备、纯化人mAb具有重要的意义。但由于人杂交瘤细胞的来源及性质不同，目前尚没有一种能适用于各种人杂交瘤细胞的无血清培养基，所以每种人杂交瘤细胞株都必须寻找一种适合于其生长的无血清培养条件〔4〕。我们在建立了分泌抗HF-RSV人mAb杂交瘤细胞的基础上，进一步研究了2D5细胞株在无血清培养基SFM中生长和分泌mAb的情况。经与RPMI-1640培养基对比，证明2D5细胞株能够在无血清培养基SFM中生长，并能分泌mAb，细胞的生长速度及mAb的分泌量均能达到在有血清条件下的水平。对鼠抗HFRSVmAb的研究表明，该mAb能够有效地保护小鼠抵抗致死量HFRSV的攻击，提示该mAb可能成为一种治疗HFRS的特异性免疫制剂。本项研究为大量制备抗HFRSV人mAb供实际应用奠定了基础。
, 百拇医药
*辽宁省博士科研起动基金资助项目，No.961112
作者简介：赵洪礼，男，37岁，副研究员，博士
沈阳市孔雀河西街2号，Tel.(024)36303019
参考文献
[1]张元兴，魏明旺，董志峰.杂交瘤细胞的无血清蛋白培养.细胞与分子免疫学杂志，1997;13(S2)：71～73
[2]赵洪礼，张健，李忠义,等.抗肾综合征出血热病毒人单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步鉴定.中华实验和临床病毒学杂志，1997;11(1)：66～68
[3]徐志凯主编.实用单克隆抗体技术.西安:陕西科学技术出版社,1992:84～90
[4]Borrebaeck CAK, Danlieson L, Moller O, et al. Human monoclonal antibodies produced by primary in vitro immunization of peripheral blood lymphoctyes. Proc Natal Acad Sci USA, 1988; 85: 485～490
[5]赵洪礼，汪美先，温青莉,等.ELISA间接法检测肾综合征出血热病人血清中特异性抗体.沈阳部队医药，1993;6(5)：453～454
(收稿 1998-03-19 修回 1998-08-14), 百拇医药