心肌肌凝蛋白轻链的分离提纯与初步鉴定
作者：林国城 尚玉琨 马玉波 刘长滨 候英萍 陈敏 乔宏庆
单位：第四军医大学西京医院核医学科，西安，710032
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990228
心肌肌凝蛋白(CM)是心肌特有的收缩蛋白。当急性心肌梗塞(AMI)造成心肌细胞缺血坏死时，CM可分解成轻链(LC)和重链(HC)两部分。HC存留于心肌内，LC释放入血，使血清CM-LC水平升高，故可用于AMI的临床诊断。为此，作者采用改良后的Sch
ler方法，对CM-LC进行了分离提纯与鉴定，以为其临床应用创造条件。
1 材料和方法
, http://www.100md.com 1.1 CM-LC的制备 采用改良的Schler法〔1〕，于0℃～4℃条件下进行。具体步骤如下：取即时处死的正常狗心室肌，除去脂肪、血管和瓣膜，用冷生理盐水洗净后，切成小块，称取70g用组织粉碎机磨碎。加入0.001mol/L，pH7.6的Tris-HCl缓冲液洗涤并搅拌数分钟后，以3000×g离心10min。如此反复5～7次至血水接近透明为止。弃去上清液，将心肌组织以2.5倍体积含Mg2+,K+及巯基乙醇的磷酸缓冲液抽提10min，离心(3500×g)10min。取上清液，缓慢滴加9倍于上清液的冷蒸馏水，搅拌过液。次日，再以3500×g离心10min，弃上清，所得沉淀物即为粗制的CM。将CM用含0.5mol/LKCl及，0.001mol/LTris缓冲液(pH7.0)溶解后，加入含尿素、甘氨酸、EDTA、巯基乙醇及苯*****化物(phenylmethyl sulfonylfluoride,PMSF)的轻、重链裂解液，强力搅拌6h。加入10倍体积的冷蒸馏水,用1mol/LNaH2PO4调pH至6.6，以14000×g离心15min，弃去沉淀(重链)。上清液用大量冷蒸馏水充分透析，以除去尿素。
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透析后的上清液用80%饱和硫酸铵沉淀。将沉淀溶于含0.5mol/LKCl，0.05mol/LTris缓冲液中，用0.1mol/L柠檬酸调pH至5.3，轻轻搅拌1.5h，再以26000×g离心30min，并重复数次。取沉淀物(主要含LC2)用0.02mol/LNa2HPO4缓冲液，0.05mol/LNaCl,0.001mol/L巯基乙醇及0.1mmol/LPMSF(pH7.5)溶解，于-20℃保存备用。
1.2 CM-LC的纯度及相对分子质量(Mr)鉴定
取10μl(含100μg)CM(含HC和LC)、10μl(含12μg)的CD-LC及10μl(含10μg)的标准蛋白，用不连续缓冲系统的SDSPAGE，鉴定CM-LC的纯度和Mr。
1.3 兔抗CM-LC血清的制备 取提纯的CM-LC1ml(1g/L)，按常规方法免疫动物制备抗CM-LC血清，并采用琼脂双扩法测定血清特异性抗体的效价。
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2 结果和讨论
CM由HC和LC组成。Mr为20万的HC有头、颈、尾3部分。颈部有ATP酶和肌动蛋白的结合部位，尾部形成丝状。LC由两个亚单位LC1(Mr为27000)和LC2(Mr为20000)组成，均与HC的头部以非共价键结合，可影响HC与肌动蛋白分子的作用，而直接参与CM的功能。由于CM的这种特殊结构，使轻链分离比较困难。作者采用改良后的Schler方法，首先提取粗制的CM，再以轻、重链裂解液使轻链和重链分离，经SDS-PAGE鉴定表明，为电泳纯的CM-LC1和CM-LC2(图1)。应用CM-LC免疫成年家兔制备的抗血清，特异性抗体的效价
1∶2。CM-LC的分离、提取及其抗血清的制备，为进一步临床应用奠定了基础。但制备的特异性抗血清效价不高，对临床进一步应用带来不便。为此，作者拟通过改进免疫方案及增加免疫动物的数量，可望能提高抗血清效价；或通过杂交瘤技术制备抗CM-LC的mAb，为临床应用提供合格的试剂。
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图1CM-LC提纯前、后的SDS-PAGE鉴定
M：标准蛋白；A：提纯后的CM-LC；B：未提纯的CM(含CM-LC和HC)
作者简介：林国城，男，34岁，主管技师。西安市长乐西路15号，Tel.(029)3375453
参考文献
[1]Schler W. A simple and fast method for the preparation of the human myosin light chains. Acta Biol Med Germ, 1982; 41:33～36
[2]Roe CR, Cobb FR, Starmer CF. The relationship between enzymatic and histologic estimates of the extent of myocardial infarction in conscious dogs with permanent coronary occlusion. Circulation, 1977; 55: 438～ 440
[3]矢崎义雄，永井良三.心筋梗塞の生化学的诊断法.呼吸上循环，1980；28(12):1348～1357
[4]林国城，尚玉琨，陈敏，等.心肌肌凝蛋白轻链放射免疫分析及临床初步应用.中华核医学杂志，1996；16(4)：224～226
收稿：1998-04-08
修回：1998-04-30, 百拇医药
单位：第四军医大学西京医院核医学科，西安，710032
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990228
心肌肌凝蛋白(CM)是心肌特有的收缩蛋白。当急性心肌梗塞(AMI)造成心肌细胞缺血坏死时，CM可分解成轻链(LC)和重链(HC)两部分。HC存留于心肌内，LC释放入血，使血清CM-LC水平升高，故可用于AMI的临床诊断。为此，作者采用改良后的Sch
ler方法，对CM-LC进行了分离提纯与鉴定，以为其临床应用创造条件。1 材料和方法
, http://www.100md.com 1.1 CM-LC的制备 采用改良的Sch
ler法〔1〕，于0℃～4℃条件下进行。具体步骤如下：取即时处死的正常狗心室肌，除去脂肪、血管和瓣膜，用冷生理盐水洗净后，切成小块，称取70g用组织粉碎机磨碎。加入0.001mol/L，pH7.6的Tris-HCl缓冲液洗涤并搅拌数分钟后，以3000×g离心10min。如此反复5～7次至血水接近透明为止。弃去上清液，将心肌组织以2.5倍体积含Mg2+,K+及巯基乙醇的磷酸缓冲液抽提10min，离心(3500×g)10min。取上清液，缓慢滴加9倍于上清液的冷蒸馏水，搅拌过液。次日，再以3500×g离心10min，弃上清，所得沉淀物即为粗制的CM。将CM用含0.5mol/LKCl及，0.001mol/LTris缓冲液(pH7.0)溶解后，加入含尿素、甘氨酸、EDTA、巯基乙醇及苯*****化物(phenylmethyl sulfonylfluoride,PMSF)的轻、重链裂解液，强力搅拌6h。加入10倍体积的冷蒸馏水,用1mol/LNaH2PO4调pH至6.6，以14000×g离心15min，弃去沉淀(重链)。上清液用大量冷蒸馏水充分透析，以除去尿素。, http://www.100md.com
透析后的上清液用80%饱和硫酸铵沉淀。将沉淀溶于含0.5mol/LKCl，0.05mol/LTris缓冲液中，用0.1mol/L柠檬酸调pH至5.3，轻轻搅拌1.5h，再以26000×g离心30min，并重复数次。取沉淀物(主要含LC2)用0.02mol/LNa2HPO4缓冲液，0.05mol/LNaCl,0.001mol/L巯基乙醇及0.1mmol/LPMSF(pH7.5)溶解，于-20℃保存备用。
1.2 CM-LC的纯度及相对分子质量(Mr)鉴定
取10μl(含100μg)CM(含HC和LC)、10μl(含12μg)的CD-LC及10μl(含10μg)的标准蛋白，用不连续缓冲系统的SDSPAGE，鉴定CM-LC的纯度和Mr。
1.3 兔抗CM-LC血清的制备 取提纯的CM-LC1ml(1g/L)，按常规方法免疫动物制备抗CM-LC血清，并采用琼脂双扩法测定血清特异性抗体的效价。
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2 结果和讨论
CM由HC和LC组成。Mr为20万的HC有头、颈、尾3部分。颈部有ATP酶和肌动蛋白的结合部位，尾部形成丝状。LC由两个亚单位LC1(Mr为27000)和LC2(Mr为20000)组成，均与HC的头部以非共价键结合，可影响HC与肌动蛋白分子的作用，而直接参与CM的功能。由于CM的这种特殊结构，使轻链分离比较困难。作者采用改良后的Sch
ler方法，首先提取粗制的CM，再以轻、重链裂解液使轻链和重链分离，经SDS-PAGE鉴定表明，为电泳纯的CM-LC1和CM-LC2(图1)。应用CM-LC免疫成年家兔制备的抗血清，特异性抗体的效价1∶2。CM-LC的分离、提取及其抗血清的制备，为进一步临床应用奠定了基础。但制备的特异性抗血清效价不高，对临床进一步应用带来不便。为此，作者拟通过改进免疫方案及增加免疫动物的数量，可望能提高抗血清效价；或通过杂交瘤技术制备抗CM-LC的mAb，为临床应用提供合格的试剂。, http://www.100md.com
图1CM-LC提纯前、后的SDS-PAGE鉴定
M：标准蛋白；A：提纯后的CM-LC；B：未提纯的CM(含CM-LC和HC)
作者简介：林国城，男，34岁，主管技师。西安市长乐西路15号，Tel.(029)3375453
参考文献
[1]Sch
ler W. A simple and fast method for the preparation of the human myosin light chains. Acta Biol Med Germ, 1982; 41:33～36[2]Roe CR, Cobb FR, Starmer CF. The relationship between enzymatic and histologic estimates of the extent of myocardial infarction in conscious dogs with permanent coronary occlusion. Circulation, 1977; 55: 438～ 440
[3]矢崎义雄，永井良三.心筋梗塞の生化学的诊断法.呼吸上循环，1980；28(12):1348～1357
[4]林国城，尚玉琨，陈敏，等.心肌肌凝蛋白轻链放射免疫分析及临床初步应用.中华核医学杂志，1996；16(4)：224～226
收稿：1998-04-08
修回：1998-04-30, 百拇医药