抗人肝癌单克隆抗体HCD78的制备及免疫组化定位
作者：王小平 陈葳 李旭 付伟 阎春芳 杨玉琮 程小丽
单位：西安医科大学第一临床医学院分子生物学中心,西安，710061
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990222
原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，具有发病隐袭、病死率高的特点，早期诊断对预后的意义重大。单克隆抗体(mAb)技术问世后，人们试图通过应用抗肝癌mAb提高肝癌的早期诊断率。然而目前获得的抗肝癌mAb识别的抗原都不是肝癌特异性抗原，而且由于肿瘤异质性的存在，又使其临床应用受到一定影响。本研究应用自建的人肝癌细胞株HC108免疫小鼠，制备了1株能稳定分泌抗人肝癌mAb的杂交瘤细胞。免疫组化证实，该mAb具有较好的特异性，其识别的肿瘤抗原主要定位于细胞膜。现将建株过程和初步鉴定的结果报道如下：
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株和组织标本 人肝癌细胞株HC108、小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0及各种肿瘤细胞系，均由本校第一附属医院分子生物学中心保存。肝癌组织标本由陕西省肿瘤医院提供；正常成人组织及胚胎组织，由本校第一附属医院病理科提供。各种组织标本均经10%福尔马林固定、石蜡包埋、切片后，镜检。
1.1.2 动物 雌性Balb/c小鼠，6周～8周龄，体重18g～22g，购自第四军医大学实验动物中心。
1.1.3 主要试剂 50%PEG(Gibico公司)；HAT和HT培养基(Sigam公司)；Ig亚类分析试剂盒(德国Boehringher Mannheirn公司)。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 杂交瘤细胞的建立 利用背部两点和腹腔注射法免疫动物3只。免疫原为人肝癌细胞HC108悬液(每只动物注射约8×106细胞)，共免疫3次。细胞融合、筛选及克隆化均按常规方法进行〔1〕。
1.2.2 mAb的特性鉴定 ①mAbIg类及亚类的鉴定，采用双夹心ELISA法。②mAb与CEA，AFP，铁蛋白及CA19-9的反应性，采用免疫双扩散试验及mAb吸收试验进行鉴定〔2〕。③肿瘤抗原分布特异性的鉴定：正常人细胞、各种肿瘤细胞与mAb的反应性，应用细胞抗原酶标记抗体法鉴定；正常人组织、胚胎组织、肿瘤组织与mAb的反应性，采用间接酶标抗体法鉴定〔3〕。④肿瘤抗原的细胞内定位：采用免疫电镜染色法。⑤肿瘤抗原的相对分子质量(Mr)的测定，采用Westernblot〔4〕。
2 结果
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2.1 杂交瘤细胞株的建立 细胞经融合、筛选，获得8株阳性克隆。选择1株反应阳性率较高的克隆进行亚克隆至100%阳性。将其液氮冻存半年复苏后，仍能持续稳定分泌mAb，命名为HCD78。
2.2 mAb的特性鉴定 ①用ELISA分析此株mAb为IgM，轻链为κ型。②琼脂糖免疫双扩散试验和mAb吸收试验显示，mAb HCD78与CEA，AFP，铁蛋白及CA19-9均不发生反应；③特异性鉴定显示，mAb HCD78与2例胚胎肝脏、胚胎结肠呈弱阳性反应；除与少数宫颈癌、膀胱癌有较弱的反应外，与3例肝癌细胞株和5例肝癌组织，均呈明显的阳性反应；而与其它肿瘤细胞、胚胎组织及正常成人组织则均呈阴性(表1)。免疫酶电镜染色显示，mAb HCD78识别的抗原主要定位于肝癌细胞膜上(图1)；经Western blot分析证实，mAb HCD78识别的肝癌细胞膜上的抗原其Mr为38000(图2)。
表1 mAbHCD78与各种癌细胞株和肝癌组织的反应性
, 百拇医药
组织来源
阳性数/总例数
组织来源
阳性数/总例数
肝癌细胞
3/3
宫颈癌细胞
3/6
胃癌细胞
0/2
卵巢癌细胞
0/2
肺癌细胞
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0/2
肝癌组织
5/5
肾癌细胞
0/2
癌旁细胞
0/5
膀胱癌细胞
8/8
结节性肝硬化
0/2
图1 mAbHCD78对HC108细胞的免疫酶电镜染色(×10000)
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HC108细胞的胞膜着色呈线状
图2 对mAb HCD78识别抗原的Western Blot分析
A：标准分子量参照蛋白；B：宫颈癌细胞对照；C：HC108细胞
3 讨论
我们以体外培养并连续传代的肝癌细胞株作为免疫原，制备了1株抗人肝癌的mAb HCD78。该种方法具有取材方便、成分单一，便于筛选阳性克隆等优点。虽然癌细胞在体外长期培养有可能发生肿瘤抗原的变异或丢失，但就目前已获得的抗肝癌mAb来看，尚未发现影响其特异性和亲和力的报道。我们应用人肝癌细胞株HC108免疫小鼠制备的抗人肝癌mAb HCD78，所获结果也说明以癌细胞作为免疫原制备mAb是可行的。另外，实验证明，细胞抗原酶标记抗体法，同样具有ELISA法的简便、快速、敏感性高，特异性强，操作可靠等优点，主要区别在于经酶标记的羊抗鼠抗体孵育后，加入不溶性底物，显色后，即可在镜下较清晰地观察肿瘤细胞抗原的定位(也可测定A值)，并可长期保存，便于摄像。另外，应用上述两法联合筛选，只要二者中之一呈阳性，就可初筛为杂交瘤细胞的侯选株。而在对阳性克隆进行亚克隆后，利用上述两种方法检测，若二者均呈阳性时，再进一步克隆、扩大培养，从而便可避免非特异性着色的干扰，增加特异阳性克隆细胞筛选的机率。
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免疫双扩散和mAb吸收试验表明，该株mAb所识别的肿瘤胚胎抗原与AFP，CEA，CA19-9和铁蛋白均无免疫相关性，考虑为非同种抗原。免疫组化结果显示，mAb HCD78与胚胎肝脏、胚胎结肠呈较弱的阳性反应，提示mAb HCD78针对的抗原可能为肝癌胚胎抗原。并表明mAb HCD78可与少数宫颈癌细胞、膀胱癌细胞呈较弱的反应，这可能是诱生mAb HCD78的肝癌细胞与中胚层上皮起源的泌尿生殖系肿瘤细胞由于去分化存在相同或类似的肿瘤抗原所致，以往学者也有类似的报道〔5，6〕。尽管如此，由于mAb HCD78与肝癌细胞和肝癌组织呈现较强的反应，故我们认为所获得的此株mAb是针对肝癌相关抗原的特异性较好的mAb。
应用免疫酶电镜技术和肝癌mAb，进行肝癌肿瘤抗原的亚细胞定位国内尚未见报道，本实验采用包埋前染色，经HRP标记的羊抗鼠抗体孵育后，加入DAB底物显色，然后用四氧化锇染色，环氧树脂包埋，电镜观察可见mAb HCD78所识别的肝癌肿瘤抗原主要定位于肝癌细胞膜上，与光镜免疫组化定位的结果相吻合。
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此株抗人肝癌mAb的建立，对进一步进行肝癌的基础和临床研究具有一定的意义。如利用此株mAb进行荷人肝癌裸鼠的定位显像和导向治疗；对肝癌患者进行血清学检测，判定其在人肝癌诊断中的价值等。
作者简介：王小平，男，26岁，医师，博士生。西安市健康路1号，Tel.(029)5252981-2328
参考文献
[1]司徒镇强，吴军正编.细胞培养.世界图书出版社，西安：1996：238～241
[2]崔运昌，汪美先，曾毅.一种筛选上皮样表面抗原单克隆抗体的ELIA.中华微生物学和免疫学杂志，1985；5(2):110～113
[3]Carlson RJ, Ben PE, Shoural D, et al. Antigenic characterization of human hepatoceunlar carcinoma development of in vitro and in viro immunoassays that use monoclonal antibodies. J Clin Invest, 1985;76(1):40～51
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[4]金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.科学出版社，北京:第2版.1992：888～892
[5]Wiedmann KH, Trejdosiewicz LK, Southgate J, et al. Human hepatocellular carcinoma: cross -reactive and idiotypic antigens associated with malignant transformation of epithelial cells. Hepatol, 1987; 7(3): 543～ 550
[6]任峰，刘彦仿，随延仿，等.抗人原发性肝细胞癌单克隆抗体的研制及相应抗原的免疫组化定位.中华肿瘤杂志，1991；13(3)：196～198
收稿：1998-06-26
修回：1998-07-27, http://www.100md.com
单位：西安医科大学第一临床医学院分子生物学中心,西安，710061
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990222
原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，具有发病隐袭、病死率高的特点，早期诊断对预后的意义重大。单克隆抗体(mAb)技术问世后，人们试图通过应用抗肝癌mAb提高肝癌的早期诊断率。然而目前获得的抗肝癌mAb识别的抗原都不是肝癌特异性抗原，而且由于肿瘤异质性的存在，又使其临床应用受到一定影响。本研究应用自建的人肝癌细胞株HC108免疫小鼠，制备了1株能稳定分泌抗人肝癌mAb的杂交瘤细胞。免疫组化证实，该mAb具有较好的特异性，其识别的肿瘤抗原主要定位于细胞膜。现将建株过程和初步鉴定的结果报道如下：
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株和组织标本 人肝癌细胞株HC108、小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0及各种肿瘤细胞系，均由本校第一附属医院分子生物学中心保存。肝癌组织标本由陕西省肿瘤医院提供；正常成人组织及胚胎组织，由本校第一附属医院病理科提供。各种组织标本均经10%福尔马林固定、石蜡包埋、切片后，镜检。
1.1.2 动物 雌性Balb/c小鼠，6周～8周龄，体重18g～22g，购自第四军医大学实验动物中心。
1.1.3 主要试剂 50%PEG(Gibico公司)；HAT和HT培养基(Sigam公司)；Ig亚类分析试剂盒(德国Boehringher Mannheirn公司)。
1.2 方法
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1.2.1 杂交瘤细胞的建立 利用背部两点和腹腔注射法免疫动物3只。免疫原为人肝癌细胞HC108悬液(每只动物注射约8×106细胞)，共免疫3次。细胞融合、筛选及克隆化均按常规方法进行〔1〕。
1.2.2 mAb的特性鉴定 ①mAbIg类及亚类的鉴定，采用双夹心ELISA法。②mAb与CEA，AFP，铁蛋白及CA19-9的反应性，采用免疫双扩散试验及mAb吸收试验进行鉴定〔2〕。③肿瘤抗原分布特异性的鉴定：正常人细胞、各种肿瘤细胞与mAb的反应性，应用细胞抗原酶标记抗体法鉴定；正常人组织、胚胎组织、肿瘤组织与mAb的反应性，采用间接酶标抗体法鉴定〔3〕。④肿瘤抗原的细胞内定位：采用免疫电镜染色法。⑤肿瘤抗原的相对分子质量(Mr)的测定，采用Westernblot〔4〕。
2 结果
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2.1 杂交瘤细胞株的建立 细胞经融合、筛选，获得8株阳性克隆。选择1株反应阳性率较高的克隆进行亚克隆至100%阳性。将其液氮冻存半年复苏后，仍能持续稳定分泌mAb，命名为HCD78。
2.2 mAb的特性鉴定 ①用ELISA分析此株mAb为IgM，轻链为κ型。②琼脂糖免疫双扩散试验和mAb吸收试验显示，mAb HCD78与CEA，AFP，铁蛋白及CA19-9均不发生反应；③特异性鉴定显示，mAb HCD78与2例胚胎肝脏、胚胎结肠呈弱阳性反应；除与少数宫颈癌、膀胱癌有较弱的反应外，与3例肝癌细胞株和5例肝癌组织，均呈明显的阳性反应；而与其它肿瘤细胞、胚胎组织及正常成人组织则均呈阴性(表1)。免疫酶电镜染色显示，mAb HCD78识别的抗原主要定位于肝癌细胞膜上(图1)；经Western blot分析证实，mAb HCD78识别的肝癌细胞膜上的抗原其Mr为38000(图2)。
表1 mAbHCD78与各种癌细胞株和肝癌组织的反应性
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组织来源
阳性数/总例数
组织来源
阳性数/总例数
肝癌细胞
3/3
宫颈癌细胞
3/6
胃癌细胞
0/2
卵巢癌细胞
0/2
肺癌细胞
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0/2
肝癌组织
5/5
肾癌细胞
0/2
癌旁细胞
0/5
膀胱癌细胞
8/8
结节性肝硬化
0/2
图1 mAbHCD78对HC108细胞的免疫酶电镜染色(×10000)
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HC108细胞的胞膜着色呈线状
图2 对mAb HCD78识别抗原的Western Blot分析
A：标准分子量参照蛋白；B：宫颈癌细胞对照；C：HC108细胞
3 讨论
我们以体外培养并连续传代的肝癌细胞株作为免疫原，制备了1株抗人肝癌的mAb HCD78。该种方法具有取材方便、成分单一，便于筛选阳性克隆等优点。虽然癌细胞在体外长期培养有可能发生肿瘤抗原的变异或丢失，但就目前已获得的抗肝癌mAb来看，尚未发现影响其特异性和亲和力的报道。我们应用人肝癌细胞株HC108免疫小鼠制备的抗人肝癌mAb HCD78，所获结果也说明以癌细胞作为免疫原制备mAb是可行的。另外，实验证明，细胞抗原酶标记抗体法，同样具有ELISA法的简便、快速、敏感性高，特异性强，操作可靠等优点，主要区别在于经酶标记的羊抗鼠抗体孵育后，加入不溶性底物，显色后，即可在镜下较清晰地观察肿瘤细胞抗原的定位(也可测定A值)，并可长期保存，便于摄像。另外，应用上述两法联合筛选，只要二者中之一呈阳性，就可初筛为杂交瘤细胞的侯选株。而在对阳性克隆进行亚克隆后，利用上述两种方法检测，若二者均呈阳性时，再进一步克隆、扩大培养，从而便可避免非特异性着色的干扰，增加特异阳性克隆细胞筛选的机率。
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免疫双扩散和mAb吸收试验表明，该株mAb所识别的肿瘤胚胎抗原与AFP，CEA，CA19-9和铁蛋白均无免疫相关性，考虑为非同种抗原。免疫组化结果显示，mAb HCD78与胚胎肝脏、胚胎结肠呈较弱的阳性反应，提示mAb HCD78针对的抗原可能为肝癌胚胎抗原。并表明mAb HCD78可与少数宫颈癌细胞、膀胱癌细胞呈较弱的反应，这可能是诱生mAb HCD78的肝癌细胞与中胚层上皮起源的泌尿生殖系肿瘤细胞由于去分化存在相同或类似的肿瘤抗原所致，以往学者也有类似的报道〔5，6〕。尽管如此，由于mAb HCD78与肝癌细胞和肝癌组织呈现较强的反应，故我们认为所获得的此株mAb是针对肝癌相关抗原的特异性较好的mAb。
应用免疫酶电镜技术和肝癌mAb，进行肝癌肿瘤抗原的亚细胞定位国内尚未见报道，本实验采用包埋前染色，经HRP标记的羊抗鼠抗体孵育后，加入DAB底物显色，然后用四氧化锇染色，环氧树脂包埋，电镜观察可见mAb HCD78所识别的肝癌肿瘤抗原主要定位于肝癌细胞膜上，与光镜免疫组化定位的结果相吻合。
, 百拇医药
此株抗人肝癌mAb的建立，对进一步进行肝癌的基础和临床研究具有一定的意义。如利用此株mAb进行荷人肝癌裸鼠的定位显像和导向治疗；对肝癌患者进行血清学检测，判定其在人肝癌诊断中的价值等。
作者简介：王小平，男，26岁，医师，博士生。西安市健康路1号，Tel.(029)5252981-2328
参考文献
[1]司徒镇强，吴军正编.细胞培养.世界图书出版社，西安：1996：238～241
[2]崔运昌，汪美先，曾毅.一种筛选上皮样表面抗原单克隆抗体的ELIA.中华微生物学和免疫学杂志，1985；5(2):110～113
[3]Carlson RJ, Ben PE, Shoural D, et al. Antigenic characterization of human hepatoceunlar carcinoma development of in vitro and in viro immunoassays that use monoclonal antibodies. J Clin Invest, 1985;76(1):40～51
, http://www.100md.com
[4]金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.科学出版社，北京:第2版.1992：888～892
[5]Wiedmann KH, Trejdosiewicz LK, Southgate J, et al. Human hepatocellular carcinoma: cross -reactive and idiotypic antigens associated with malignant transformation of epithelial cells. Hepatol, 1987; 7(3): 543～ 550
[6]任峰，刘彦仿，随延仿，等.抗人原发性肝细胞癌单克隆抗体的研制及相应抗原的免疫组化定位.中华肿瘤杂志，1991；13(3)：196～198
收稿：1998-06-26
修回：1998-07-27, http://www.100md.com