抗人Fas单克隆抗体的制备及鉴定*
作者：宋建勋 朱锡华 陈克敏 郑萍
单位：第三军医大学全军免疫学研究所，重庆，400038
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990221
Fas/Apo-1/CD95抗原的发现,始于对两株单克隆抗体(mAb)的功能观察，即抗Apo-1mAb和抗FasmAb〔1，2〕。由于二者都能识别细胞膜上CD95蛋白抗原，且能诱导敏感细胞凋亡，才导致今天对Fas抗原的生物医学研究。制备抗Fas mAb对于Fas抗原的深入研究，尤其是对Fas抗原信号传导机制的阐明，以及生物医学应用都有重要的意义。本文利用Fas+的细胞作为免疫原，制备了1株鼠抗人Fas mAb 2A1。
1 材料和方法
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1.1 材料
1.1.1 细胞系 Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞、Jurkat人T淋巴细胞性白血病细胞、Raji人Burkitt(非州)淋巴瘤细胞及U937人组织细胞性淋巴瘤细胞，均为本室保存。THP-1人单核白血病细胞，引自中国科学院上海细胞生物所。各细胞系均在含10%NCS的RPMI-1640完全培养液中培养传代。
1.1.2 动物Balb/c雌性纯系小鼠，6～8周龄，由本校实验动物中心收提供。
1.1.3 主要试剂单特异性兔抗人Fas多克隆抗体(PcAb)N-18，购自SantaCruz公司。鼠抗人FasmAbCH-11(Kamiya公司产品)，为我室访美学者郑力新赠送。HRP-羊抗兔IgG及HRP-羊抗鼠IgG，购自华美公司。鼠Ig类与亚类及型检测试剂盒：IsoStripTMkit,购自BM公司。硝酸纤维膜(NC膜)，为Gibco公司产品。可溶性重组人Fas胞外区蛋白(SrFas△TM)，购自PharMingen公司。
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1.2 方法
1.2.1 抗人Fas mAb的制备 ①动物免疫：以Jurkat细胞为免疫原，基础免疫为Ba1b/c小鼠腹腔注射0.2ml(含2×107个细胞/鼠)，免疫2次，间隔2wk～4wk。加强免疫为每脾注射0.1ml(含1×106个细胞/脾)，3d后融合。②细胞融合、筛选及克隆化：小鼠脾细胞先用2.5mol/LLeu-OMe处理，再与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞按10：1的比例，以50%PEG进行融合〔3〕。融合后10d～15d，取上清进行筛选。将杂交瘤上清对Jurkat细胞的生长有毒性作用的孔，初步定为阳性孔。克隆及亚克隆化，采用有限稀释法。③腹水制备及mAb的纯化：常规制备腹水，采用盐析和DEAE纤维素层析相结合纯化mAb。
1.2.2 mAb的鉴定 ①Dot-ELISA:将SrFas抗原标准品点样于NC膜上，1%BSA封闭后，相继滴加杂交瘤腹水和HRP-羊抗鼠IgG，用DAB显色。实验中以抗人FasmAbCH-11作为阳性对照。②Westernblot:Fas+敏感细胞用PBS洗涤后，用三去污剂裂解液(含50mol/LTrisC1，pH8.0，150mmol/LNaCl,0.02%NaN3,0.1%SDS,100mg/LPMSF,1μg/mlAprotinin,1%NP-40及0.5%脱氧胆酸钠)抽提膜蛋白〔4〕。经12%SDS-PAGE分离，转移至NC膜后，相继与杂交瘤腹水和HRP羊抗鼠IgG起作用，DAB显色。③Ig类与亚类及型鉴定：按Boehringer Mannheim公司生产的IsoStripTM试剂盒说明进行。
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2 结果
2.1 杂交瘤细胞系的建立 用Jurkat细胞作为免疫原，分批免疫Balb/c小鼠，经8次融合，筛选出对Jurkat细胞生长有抑制/毒性作用的孔3个，经克隆及反复亚克隆化后，分别命名为2A1，3B6和3D1。制备上清和小鼠腹水。
2.2 mAb的鉴定 ①经复孔试验，对杂交瘤细胞系2A1，3B6和3D1腹水测试发现，仅2A1能与SrFas蛋白起反应，斑点阳性对照(抗FasmAbCH-11)亦能与SrFas结合并显色，Sp2/0细胞诱生的腹水则呈阴性(图1见第Ⅵ页)。②免疫印迹：Jurkat细胞、Raji细胞及THP-1细胞膜蛋白提取样品经SDS-PAGE后，用考马斯亮兰R-250染色液染色及脱色后，显示蛋白条带相似，与U937细胞膜蛋白条带差异明显(图2第Ⅵ页)。经电转印及免疫染色后发现，mAb2A1腹水能与Jurkat细胞、Raji细胞和THP-1细胞膜蛋白中相对分子质量(Mr)为50000左右的蛋白带起反应，与特异性兔抗人FasPcAbN-18所识别的位置一致(图3见第Ⅵ页)，但在U937细胞膜蛋白带上未能检出阳性结果。③Ig类、亚类及型的鉴定：从BM公司试剂盒检测条带上显示mAb2A1为IgG1(κ)。
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图1 斑点酶联免疫吸附试验
1：mAb2A1；2：mAb3B6；3：mAb3D1；4：抗Fas mAbCH-11;5:Sp2/0细胞诱生的腹水
图2 Jurkat,Raji及THP-1细胞膜蛋白的SDS-PAGE
(A)1：U937细胞；2：Jarkat细胞；3:Marker(Mr);4:Raji细胞；
5：THP-1细胞；(B)1,3:Jurkat细胞;2:Marker(Mr)
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图3 免疫印迹
1：Marker(Mr);2:抗Fas PcAb N-18;3:mAb 2A1;4：抗SrFas的mAb 2A1；
5：Sp2/0细胞的培养上清
3 讨论
对Fas抗原分子的研究，开始于抗FasmAb的制备，而正是由于制备了抗Fas mAb才有了今天对Fas抗原较深入地认识。抗Fas mAb能诱导Fas+敏感细胞凋亡，有关Fas抗原死亡信号传导等的研究也离不开抗Fas mAb的作用。
Fas抗原作为细胞膜表面受体，其抗原来源有限，这是抗Fas mAb制备过程中的一大障碍。在制备抗Fas mAb时，曾有3种方案用来解决抗原量不足的问题：①用生物化学方法，从Fas+细胞膜上纯化Fas蛋白抗原；②用化学方法，合成Fas抗原胞外区肽段；③用Fas+细胞直接作为免疫原。开始我们曾提取Fas+细胞的膜蛋白，试图从中纯化出部分Fas蛋白抗原，但由于纯化量太低且方法繁琐，以及考虑到纯化的Fas抗原蛋白的变性，制备出的抗FasmAb是否具有生物学活性等原因，而放弃了第1种方法。用合成肽作为抗原，制备抗Fas mAb是最为简便而有效的方法，但由于合成过程中刚好遇上国际上某些合成用的化学试剂禁运，使这种方法亦被迫停止。因此，我们制备抗Fas mAb采用的是第3种方法，即用Fas+细胞作为免疫原，采用功能检测的方法筛选有生物学活性的抗Fas mAb。
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Fas+细胞采用Jurkat T淋巴细胞性白血病细胞，是因为83%的Jurkat细胞膜表面Fas抗原表达阳性，比例较高〔1〕；且Jurkat细胞繁殖较快，传代容易，易于大量收集用于制备免疫原。另外，我们的实验还证实，Jurkat细胞用PHA或ConA均不能提高其细胞膜表面Fas抗原的表达量，这与国外某些实验室的结果一致(郑立新，美国NIH)。用Jurkat细胞作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备mAb，细胞融合率不超过75%。为了提高融合率，我们曾将Sp2/0骨髓瘤细胞用20μg/ml的8-氮杂鸟嘌呤处理，并用小鼠活体内生长的骨髓瘤细胞进行融合，但效果不理想〔5〕。而用LeuOMe处理免疫脾细胞后再与Sp2/0细胞融合，则能明显提高融合率(达90%)以上，但其机理不详〔3〕。
用功能检测来筛选阳性杂交瘤，在制备抗FasmAb过程中虽费时、费力，但在没有足够纯化Fas抗原的情况下亦还有效。研制出有生物学活性的抗Fas mAb，即能诱导Fas+敏感细胞凋亡，换言之，即对细胞的生长有抑制作用或毒性。为此，我们对几千个融合的阳性杂交瘤上清进行了检测，最终筛选到3个对Fas+敏感细胞有毒性作用的孔，经筛选和克隆化获得1株抗人FasmAb。
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* 全军“九五”医药卫生科研重点基金资助项目，No.96Z038
作者简介：宋建勋，男，31岁，讲师，博士。重庆市高滩岩正街30号，Tel.(023)68752274
参考文献
[1]Trauth BC, Klas C, Peters AM, et al. Monoclonal antibody mediated tumor regression by induction of apoptosis. Science, 1989; 245(4915): 301～304
[2]Yonehara S, Ishii A, Yonehara M. A cell-killing monoclonal antibody(anti-Fas) to a cell surface antigen co-downregulated with the receptor of tumor necrosis factor. J Exp Med, 1989; 169(5):1747～1756
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[3]Seo N, Egawa K. Utilization of leucine methyl ester for the generation of hybridomas producing monoclonal antibodies specific to rumor-associated antigens. Cancer Immunol Immunother, 1994; 38(5):277～280
[4]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.分子克隆实验指南.第2版(金冬雁等译)。科学出版社，北京：1992：870～877
[5]徐志凯主编，实用单克隆抗体技术，陕西科学技术出版社，西安：1992：10～15
收稿：1998-06-18
修回：1998-07-13, http://www.100md.com
单位：第三军医大学全军免疫学研究所，重庆，400038
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990221
Fas/Apo-1/CD95抗原的发现,始于对两株单克隆抗体(mAb)的功能观察，即抗Apo-1mAb和抗FasmAb〔1，2〕。由于二者都能识别细胞膜上CD95蛋白抗原，且能诱导敏感细胞凋亡，才导致今天对Fas抗原的生物医学研究。制备抗Fas mAb对于Fas抗原的深入研究，尤其是对Fas抗原信号传导机制的阐明，以及生物医学应用都有重要的意义。本文利用Fas+的细胞作为免疫原，制备了1株鼠抗人Fas mAb 2A1。
1 材料和方法
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1.1 材料
1.1.1 细胞系 Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞、Jurkat人T淋巴细胞性白血病细胞、Raji人Burkitt(非州)淋巴瘤细胞及U937人组织细胞性淋巴瘤细胞，均为本室保存。THP-1人单核白血病细胞，引自中国科学院上海细胞生物所。各细胞系均在含10%NCS的RPMI-1640完全培养液中培养传代。
1.1.2 动物Balb/c雌性纯系小鼠，6～8周龄，由本校实验动物中心收提供。
1.1.3 主要试剂单特异性兔抗人Fas多克隆抗体(PcAb)N-18，购自SantaCruz公司。鼠抗人FasmAbCH-11(Kamiya公司产品)，为我室访美学者郑力新赠送。HRP-羊抗兔IgG及HRP-羊抗鼠IgG，购自华美公司。鼠Ig类与亚类及型检测试剂盒：IsoStripTMkit,购自BM公司。硝酸纤维膜(NC膜)，为Gibco公司产品。可溶性重组人Fas胞外区蛋白(SrFas△TM)，购自PharMingen公司。
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1.2 方法
1.2.1 抗人Fas mAb的制备 ①动物免疫：以Jurkat细胞为免疫原，基础免疫为Ba1b/c小鼠腹腔注射0.2ml(含2×107个细胞/鼠)，免疫2次，间隔2wk～4wk。加强免疫为每脾注射0.1ml(含1×106个细胞/脾)，3d后融合。②细胞融合、筛选及克隆化：小鼠脾细胞先用2.5mol/LLeu-OMe处理，再与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞按10：1的比例，以50%PEG进行融合〔3〕。融合后10d～15d，取上清进行筛选。将杂交瘤上清对Jurkat细胞的生长有毒性作用的孔，初步定为阳性孔。克隆及亚克隆化，采用有限稀释法。③腹水制备及mAb的纯化：常规制备腹水，采用盐析和DEAE纤维素层析相结合纯化mAb。
1.2.2 mAb的鉴定 ①Dot-ELISA:将SrFas抗原标准品点样于NC膜上，1%BSA封闭后，相继滴加杂交瘤腹水和HRP-羊抗鼠IgG，用DAB显色。实验中以抗人FasmAbCH-11作为阳性对照。②Westernblot:Fas+敏感细胞用PBS洗涤后，用三去污剂裂解液(含50mol/LTrisC1，pH8.0，150mmol/LNaCl,0.02%NaN3,0.1%SDS,100mg/LPMSF,1μg/mlAprotinin,1%NP-40及0.5%脱氧胆酸钠)抽提膜蛋白〔4〕。经12%SDS-PAGE分离，转移至NC膜后，相继与杂交瘤腹水和HRP羊抗鼠IgG起作用，DAB显色。③Ig类与亚类及型鉴定：按Boehringer Mannheim公司生产的IsoStripTM试剂盒说明进行。
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2 结果
2.1 杂交瘤细胞系的建立 用Jurkat细胞作为免疫原，分批免疫Balb/c小鼠，经8次融合，筛选出对Jurkat细胞生长有抑制/毒性作用的孔3个，经克隆及反复亚克隆化后，分别命名为2A1，3B6和3D1。制备上清和小鼠腹水。
2.2 mAb的鉴定 ①经复孔试验，对杂交瘤细胞系2A1，3B6和3D1腹水测试发现，仅2A1能与SrFas蛋白起反应，斑点阳性对照(抗FasmAbCH-11)亦能与SrFas结合并显色，Sp2/0细胞诱生的腹水则呈阴性(图1见第Ⅵ页)。②免疫印迹：Jurkat细胞、Raji细胞及THP-1细胞膜蛋白提取样品经SDS-PAGE后，用考马斯亮兰R-250染色液染色及脱色后，显示蛋白条带相似，与U937细胞膜蛋白条带差异明显(图2第Ⅵ页)。经电转印及免疫染色后发现，mAb2A1腹水能与Jurkat细胞、Raji细胞和THP-1细胞膜蛋白中相对分子质量(Mr)为50000左右的蛋白带起反应，与特异性兔抗人FasPcAbN-18所识别的位置一致(图3见第Ⅵ页)，但在U937细胞膜蛋白带上未能检出阳性结果。③Ig类、亚类及型的鉴定：从BM公司试剂盒检测条带上显示mAb2A1为IgG1(κ)。
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图1 斑点酶联免疫吸附试验
1：mAb2A1；2：mAb3B6；3：mAb3D1；4：抗Fas mAbCH-11;5:Sp2/0细胞诱生的腹水
图2 Jurkat,Raji及THP-1细胞膜蛋白的SDS-PAGE
(A)1：U937细胞；2：Jarkat细胞；3:Marker(Mr);4:Raji细胞；
5：THP-1细胞；(B)1,3:Jurkat细胞;2:Marker(Mr)
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图3 免疫印迹
1：Marker(Mr);2:抗Fas PcAb N-18;3:mAb 2A1;4：抗SrFas的mAb 2A1；
5：Sp2/0细胞的培养上清
3 讨论
对Fas抗原分子的研究，开始于抗FasmAb的制备，而正是由于制备了抗Fas mAb才有了今天对Fas抗原较深入地认识。抗Fas mAb能诱导Fas+敏感细胞凋亡，有关Fas抗原死亡信号传导等的研究也离不开抗Fas mAb的作用。
Fas抗原作为细胞膜表面受体，其抗原来源有限，这是抗Fas mAb制备过程中的一大障碍。在制备抗Fas mAb时，曾有3种方案用来解决抗原量不足的问题：①用生物化学方法，从Fas+细胞膜上纯化Fas蛋白抗原；②用化学方法，合成Fas抗原胞外区肽段；③用Fas+细胞直接作为免疫原。开始我们曾提取Fas+细胞的膜蛋白，试图从中纯化出部分Fas蛋白抗原，但由于纯化量太低且方法繁琐，以及考虑到纯化的Fas抗原蛋白的变性，制备出的抗FasmAb是否具有生物学活性等原因，而放弃了第1种方法。用合成肽作为抗原，制备抗Fas mAb是最为简便而有效的方法，但由于合成过程中刚好遇上国际上某些合成用的化学试剂禁运，使这种方法亦被迫停止。因此，我们制备抗Fas mAb采用的是第3种方法，即用Fas+细胞作为免疫原，采用功能检测的方法筛选有生物学活性的抗Fas mAb。
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Fas+细胞采用Jurkat T淋巴细胞性白血病细胞，是因为83%的Jurkat细胞膜表面Fas抗原表达阳性，比例较高〔1〕；且Jurkat细胞繁殖较快，传代容易，易于大量收集用于制备免疫原。另外，我们的实验还证实，Jurkat细胞用PHA或ConA均不能提高其细胞膜表面Fas抗原的表达量，这与国外某些实验室的结果一致(郑立新，美国NIH)。用Jurkat细胞作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备mAb，细胞融合率不超过75%。为了提高融合率，我们曾将Sp2/0骨髓瘤细胞用20μg/ml的8-氮杂鸟嘌呤处理，并用小鼠活体内生长的骨髓瘤细胞进行融合，但效果不理想〔5〕。而用LeuOMe处理免疫脾细胞后再与Sp2/0细胞融合，则能明显提高融合率(达90%)以上，但其机理不详〔3〕。
用功能检测来筛选阳性杂交瘤，在制备抗FasmAb过程中虽费时、费力，但在没有足够纯化Fas抗原的情况下亦还有效。研制出有生物学活性的抗Fas mAb，即能诱导Fas+敏感细胞凋亡，换言之，即对细胞的生长有抑制作用或毒性。为此，我们对几千个融合的阳性杂交瘤上清进行了检测，最终筛选到3个对Fas+敏感细胞有毒性作用的孔，经筛选和克隆化获得1株抗人FasmAb。
, http://www.100md.com
* 全军“九五”医药卫生科研重点基金资助项目，No.96Z038
作者简介：宋建勋，男，31岁，讲师，博士。重庆市高滩岩正街30号，Tel.(023)68752274
参考文献
[1]Trauth BC, Klas C, Peters AM, et al. Monoclonal antibody mediated tumor regression by induction of apoptosis. Science, 1989; 245(4915): 301～304
[2]Yonehara S, Ishii A, Yonehara M. A cell-killing monoclonal antibody(anti-Fas) to a cell surface antigen co-downregulated with the receptor of tumor necrosis factor. J Exp Med, 1989; 169(5):1747～1756
, http://www.100md.com
[3]Seo N, Egawa K. Utilization of leucine methyl ester for the generation of hybridomas producing monoclonal antibodies specific to rumor-associated antigens. Cancer Immunol Immunother, 1994; 38(5):277～280
[4]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.分子克隆实验指南.第2版(金冬雁等译)。科学出版社，北京：1992：870～877
[5]徐志凯主编，实用单克隆抗体技术，陕西科学技术出版社，西安：1992：10～15
收稿：1998-06-18
修回：1998-07-13, http://www.100md.com