抗单链尿激酶型纤溶酶原激活剂单克隆抗体的制备*
作者：高丽华 肖承祖
单位：军事医学科学院生物工程研究所，北京，100071
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990219尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)是近年来研究较多的溶血栓药物之一。它存在两种形式：单链尿激酶(scuPA)或称尿激酶原及双链尿激酶(uPA)或称尿激酶〔1〕。由于临床发现uPA大剂量注射易出现大面积出血的倾向，所以，人们对特异性强于uPA的scuPA进行了深入地研究。由于scuPA能选择性地在纤维蛋白表面激活纤溶酶原，进而选择性地溶解血栓，而受到人们的重视。目前，我们虽已构建了高表达水平的工程细胞株，但纯化工艺有待进一步完善。鉴于国内尚未报道过scuPA单克隆抗体(mAb)的制备，我们用常规细胞融合技术，制备了4株能稳定分泌抗scuPA的mAb杂交瘤细胞，为进一步提纯scuPA提供了试剂。
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1 材料和方法
1.1 材料 抗uPA的mAb38-1-7由本室自制〔2〕；纯度99%的scuPA，由本实验室用抗uPA的mAb偶联装柱，纯化CHO工程细胞无血清培养上清，再用苯甲脒分离即得。尿激酶及纤溶酶购自卫生部北京生物制品检定所。
1.2 方法
1.2.1 抗scuPAmAb杂交瘤细胞株的建立〔3〕 用纯度99%的scuPA经腹腔、皮下注射免疫6周～8周龄Balb/c小鼠。取其脾细胞，采用常规方法进行细胞融合、筛选与克隆化，并制备mAb腹水。
1.2.2 mAb的特性鉴定 ①Ig类、亚类的鉴定：采用免疫双扩散法；②尿激酶活性测定：采用改良的纤溶板法〔4〕；③抗scuPAmAb与抗uPAmAb结合单、双链尿激酶的特异性比较：分别以5mg/L的scuPA(99%纯度)及uPA包被酶联板，做间接ELISA，测定波长450nm的A值。
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2 结果和讨论
用ELISA法从800个融合细胞中，克隆出了与scuPA有明显亲和活性，而与uPA亲和活性极弱的杂交瘤细胞4株(G7，E8，D和A9)。其结合uPA的活性是结合scuPA活性的4%～27%。而抗uPAmAb38-1-7结合uPA的活性是结合scuPA活性的88%，表明这4株mAb的特异性良好。采用免疫双扩法，测定4株mAb的Ig亚类均为IgG1，轻链均为κ型。间接ELISA检测培养上清的滴度为1×10-3～4.0×10-4,腹水为1×10-5～1×10-6。
scuPA虽非小分子蛋白，但抗原性不强，免疫时除要应用佐剂外，免疫时间和免疫剂量也应掌握准确。本文中我们采用了2个月5次免疫，且免疫剂量递增，尤其在细胞融合前3d追加免疫至关重要。
scuPA与uPA分子结构的不同可能在三维立体水平上，两者在肽链结构上的差异甚微，只有1个抗原表位的不同〔1〕。如将scuPA的Lys(158)Ile(159)间的肽链断开即成为uPA。我们将mAbG7与scuPA孵育后，再激活纤溶酶，没有显示活性，表明该mAb的结合位点可能在scuPA的活性中心，或是由于其三维立体结构掩盖了其活性中心所致。
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国内已制备出抗uPA的mAb〔2〕，但迄今未见抗scuPA的mAb的报道。由于uPA在临床应用中能引起一些副作用，例如大剂量注射具有大范围出血的倾向〔5〕，故在心、脑血管栓塞的治疗中，需要相当纯的scuPA才能达到最佳的治疗效果。本实验所筛选的4株抗scuPAmAb，为生产提纯scuPA提供了重要的试剂。另外，抗scuPAmAb还可用于对scuPA结构、功能等的基础研究及定量、定性分析〔6〕。某些肿瘤细胞可分泌大量的scuPA，因此，抗scuPAmAb是否在肿瘤的诊断中也有价值？很值得探讨。
*国家863重点科研资助项目，No.9411061
作者简介：高丽华，女，30岁，实验师，北京丰台东大街20号，Tel.(010)66948821
参考文献
, http://www.100md.com [1]史伟，张彩英，黄桂秋，等.单链尿激酶型纤溶酶原激活物的结构和性质.生理科学进展，1990；21(4)：314～317
[2]析，叶建新，张正光，等.抗尿激酶型纤溶酶原激活剂mAb的制备.军事医学科学院院刊,1995；19(4)：248～252
[3]徐志凯主编.实用单克隆抗体技术.西安：陕西科学技术出版社，1992：31～41，95～96
[4]高丽华，于芳，肖承祖.尿激酶测定方法的改进及对CL11G工程细胞表达尿激酶水平稳定性的观察.生物技术通讯，1997；8(2)：94～96
[5]Pannall R, Gurewich V. Pro-urokinase: a study of a mechanism for its selective fibrinolytic effect. Blood, 1986; 67(5):1215～ 1223
[6]Seephens RW, Aumailley M, Timpl R, et al. Urokinase binding to lamininnidogen struture requirements and interactions with heparin. Eur J Biochem, 1992; 207:937～ 942
收稿：1998-05-11
修回：1998-08-03, 百拇医药
单位：军事医学科学院生物工程研究所，北京，100071
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990219尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)是近年来研究较多的溶血栓药物之一。它存在两种形式：单链尿激酶(scuPA)或称尿激酶原及双链尿激酶(uPA)或称尿激酶〔1〕。由于临床发现uPA大剂量注射易出现大面积出血的倾向，所以，人们对特异性强于uPA的scuPA进行了深入地研究。由于scuPA能选择性地在纤维蛋白表面激活纤溶酶原，进而选择性地溶解血栓，而受到人们的重视。目前，我们虽已构建了高表达水平的工程细胞株，但纯化工艺有待进一步完善。鉴于国内尚未报道过scuPA单克隆抗体(mAb)的制备，我们用常规细胞融合技术，制备了4株能稳定分泌抗scuPA的mAb杂交瘤细胞，为进一步提纯scuPA提供了试剂。
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1 材料和方法
1.1 材料 抗uPA的mAb38-1-7由本室自制〔2〕；纯度99%的scuPA，由本实验室用抗uPA的mAb偶联装柱，纯化CHO工程细胞无血清培养上清，再用苯甲脒分离即得。尿激酶及纤溶酶购自卫生部北京生物制品检定所。
1.2 方法
1.2.1 抗scuPAmAb杂交瘤细胞株的建立〔3〕 用纯度99%的scuPA经腹腔、皮下注射免疫6周～8周龄Balb/c小鼠。取其脾细胞，采用常规方法进行细胞融合、筛选与克隆化，并制备mAb腹水。
1.2.2 mAb的特性鉴定 ①Ig类、亚类的鉴定：采用免疫双扩散法；②尿激酶活性测定：采用改良的纤溶板法〔4〕；③抗scuPAmAb与抗uPAmAb结合单、双链尿激酶的特异性比较：分别以5mg/L的scuPA(99%纯度)及uPA包被酶联板，做间接ELISA，测定波长450nm的A值。
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2 结果和讨论
用ELISA法从800个融合细胞中，克隆出了与scuPA有明显亲和活性，而与uPA亲和活性极弱的杂交瘤细胞4株(G7，E8，D和A9)。其结合uPA的活性是结合scuPA活性的4%～27%。而抗uPAmAb38-1-7结合uPA的活性是结合scuPA活性的88%，表明这4株mAb的特异性良好。采用免疫双扩法，测定4株mAb的Ig亚类均为IgG1，轻链均为κ型。间接ELISA检测培养上清的滴度为1×10-3～4.0×10-4,腹水为1×10-5～1×10-6。
scuPA虽非小分子蛋白，但抗原性不强，免疫时除要应用佐剂外，免疫时间和免疫剂量也应掌握准确。本文中我们采用了2个月5次免疫，且免疫剂量递增，尤其在细胞融合前3d追加免疫至关重要。
scuPA与uPA分子结构的不同可能在三维立体水平上，两者在肽链结构上的差异甚微，只有1个抗原表位的不同〔1〕。如将scuPA的Lys(158)Ile(159)间的肽链断开即成为uPA。我们将mAbG7与scuPA孵育后，再激活纤溶酶，没有显示活性，表明该mAb的结合位点可能在scuPA的活性中心，或是由于其三维立体结构掩盖了其活性中心所致。
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国内已制备出抗uPA的mAb〔2〕，但迄今未见抗scuPA的mAb的报道。由于uPA在临床应用中能引起一些副作用，例如大剂量注射具有大范围出血的倾向〔5〕，故在心、脑血管栓塞的治疗中，需要相当纯的scuPA才能达到最佳的治疗效果。本实验所筛选的4株抗scuPAmAb，为生产提纯scuPA提供了重要的试剂。另外，抗scuPAmAb还可用于对scuPA结构、功能等的基础研究及定量、定性分析〔6〕。某些肿瘤细胞可分泌大量的scuPA，因此，抗scuPAmAb是否在肿瘤的诊断中也有价值？很值得探讨。
*国家863重点科研资助项目，No.9411061
作者简介：高丽华，女，30岁，实验师，北京丰台东大街20号，Tel.(010)66948821
参考文献
, http://www.100md.com [1]史伟，张彩英，黄桂秋，等.单链尿激酶型纤溶酶原激活物的结构和性质.生理科学进展，1990；21(4)：314～317
[2]析，叶建新，张正光，等.抗尿激酶型纤溶酶原激活剂mAb的制备.军事医学科学院院刊,1995；19(4)：248～252
[3]徐志凯主编.实用单克隆抗体技术.西安：陕西科学技术出版社，1992：31～41，95～96
[4]高丽华，于芳，肖承祖.尿激酶测定方法的改进及对CL11G工程细胞表达尿激酶水平稳定性的观察.生物技术通讯，1997；8(2)：94～96
[5]Pannall R, Gurewich V. Pro-urokinase: a study of a mechanism for its selective fibrinolytic effect. Blood, 1986; 67(5):1215～ 1223
[6]Seephens RW, Aumailley M, Timpl R, et al. Urokinase binding to lamininnidogen struture requirements and interactions with heparin. Eur J Biochem, 1992; 207:937～ 942
收稿：1998-05-11
修回：1998-08-03, 百拇医药