实验大鼠梗阻性黄疸形成中TNF-α和IL-6对肝脏的影响
作者：李端阳 吴金生 马庆久 褚延魁 李金茂
单位：第四军医大学唐都医院普通外科,西安710038
关键词：梗阻性黄疸；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-6
细胞与分子免疫学杂志990215摘要：目的:探讨梗阻性黄疸形成过程中,血清及肝组织TNF-α和IL-6的水平及其与肝损害的关系。方法:以结扎胆总管(ligatingcommonbileduct,LCD)的大鼠为模型,采用放射免疫法,测定LCD后不同时间血清和肝组织中TNF-α和IL-6的含量。结果：LCD组血清TNF-α和IL-6的水平[分别为(1285.00±72.23)μg/L和(301.25±44.86)μg/L]明显高于假手术对照组[分别为(791.00±164)μg/L和(235.00±47)μg/L],(P<0.01和P<0.05),肝组织中TNF-α和IL-6的含量[分别为(2353.75±695.45)μg/100g和(972.75±154.62)μg/100g]也明显高于对照组(均为<300μg/100g,P<0.01);于LCD后1d～3d变化最为明显,第7天～14天维持在一较高水平。二者与谷丙转氨酶(ALT)的变化均呈显著的正相关(相关系数r分别为0.631和0.782)。结论：TNF-α和IL-6均参与了肝脏的损伤。
, 百拇医药
中国图书资料分类号：R392.11
Effects of TNF-α and IL-6 levels on liver during the formation of
experimental rat obstructive jaundice
Li Duanyang,Wu Jingsheng,Ma Qingjiu,Chu Yankui
(Department of General Surgery, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710038)
Keywords：obstructive jaundice tumour necrosis factor alpha interleukin-6
, http://www.100md.com
Abstract：Aim: To investigate serum and hepatic tissue TNF-α-and IL-6 levels and their relationship to liver damage during the formation of experimental obstructive jaundice in rat. Methods:The rat model was estabilished by ligating common bile duct(LCD).TNF-α and IL-6 levels in serum and hepatic tissue at different phases were detected by radioimmunoassay.Results:Serum TNF-α and IL-6 levels 〔 (1285.00± 72.23)μ g/L and (301.25± 44.86)μg/L, respectively〕in the 14 d group rats after LCD were increased significantly as compared with that in the control group 〔 (791± 164)μ g/L and (235.00± 47)μ g/L , P<0.01 and P<0.05, respectively〕. Hepatic tissue TNF-αand IL-6 levels 〔 (2353.75± 154.62)μg/100g and (972.75± 44.86)μg/100g, respectively〕, increased significantly(P<0.01) in the 14 d group rats after LCD, Serum levels of the tow cytokines reached peak values on 1 to 3d after LCD. TNF-αand IL-6 levels were higher on 7 day after LCD. Both the concentration of cytokines and serum ALT were well correlated(r=0.631 and r=0.782). Conclusion: Serum and hepatic tissue TNF-αand IL-6 were increased significantly in LCD rats, and were well correlated to ALT, suggesting that TNF-αand IL-6 play an important role in liver damage due to biliary obstuction.
, 百拇医药
TNF-α和IL-6由单核-巨噬细胞产生,二者均为炎症因子,体内水平过高时可导致严重损伤[1,2]。败血症、创伤和肝硬化等疾病中都有细胞因子的调控异常。梗阻性黄疸患者术后并发症的发生率很高,认为与其体内单核-巨噬细胞的功能改变有关[3],但关于梗阻性黄疸形成过程中细胞因子的水平改变与肝损害的关系报道尚不多。本研究通过结扎大鼠胆总管(LCD)建立的动物模型,采用放射免疫法测定了实验性大鼠梗阻性黄疸形成过程中不同时相血清及肝组织中TNF-α和IL-6的水平，并探讨了二者与肝损伤的关系。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 雄性Sprague-Dawley大鼠88只,体重(220g±20g)，由本校动物中心提供,以标准饲料喂养。将其随机分为正常组(8只)、假结扎组与LCD(各40只),后两组又按手术后的时间(1d,3d,7d,10d和14d)分为5个时相组，每个时相组各8只大鼠。
, http://www.100md.com
1.2 动物模型的建立 参照经典方法,结扎前禁食12h,自由饮水,以1%戊巴比妥钠(25mg/kg)腹腔注射麻醉，消毒后腹部正中切口，暴露胆总管，距其起始部位0.5cm处游离胆总管，以3-0号丝线双重结扎,并切断、关腹。假结扎组大鼠除不结扎胆总管外余均同上;正常组大鼠不做任何处理。
1.3 标本采集 各组均心脏采血，分离血清，分装后置-80℃保存待用。同时取正常组及两个14d时相组大鼠的右叶肝组织,洗涤后即刻置-80℃保存待用。
1.4 检测方法 ①血清TNF-α和IL-6的水平采用放射免疫法测定，试剂盒由北京东亚免疫技术研究所提供,按说明书进行操作；②肝组织中TNF-α和IL-6含量的测定：取冷冻肝组织标本100mg，加入1NHAC 1 ml研磨后，置于100℃水浴10min，匀浆，4℃离心(3500r/min)20min，取上清，测定方法同上；③血清ALT和胆红素采用CL-8000型临床生化分析仪(日本产)测定。④测定结果以
±SD表示，用t检验、方差分析和相关分析进行数据处理。
, 百拇医药
2 结果
2.1 血清胆红素，ALT，TNF-α和IL-6的水平 术后14d，正常组与对照组之间4种指标的测定结果见表1。
表1 术后第14天各组大鼠血清胆红素，ALT，TNF-α和IL-6的水平
Tab1 Levels of serum bilirubin,TNF-α ,IL-6 and ALT in different groups of rats on 14 d post-operation(n=8)
Group
Bilirubin
(μmol/L)
TNF-α
, 百拇医药
(μg/L)
IL-6
(μg/L)
ALT
(IU/L)
Normal
7.25± 1.18
701.25± 133.57
190.00± 50.71
50.00± 12.12
Sham LCD
7.25± 1.19
, http://www.100md.com
700.33± 147.00
225.00± 45.93
50.22± 10.66
LCD
199.85± 37.05▲
1285.00± 72.23▲
301.25± 44.86△
319.75± 111.1▲
△ P <0.05，P <0.01，vs Sham LCD group
, 百拇医药 2.2 血清胆红素，TNF-α，IL-6和ALT水平的动态变化 所获结果见图1。术后LCD组的血清胆红素迅速升高，各个时相测定的结果均明显高于对照组(P<0.01)。手术后第7天血清胆红素水平达峰值[(214.58±29.81)μmol/L],以后维持在一个高水平。术后第14天时，胆红素值为(199.85±37.05)μmol/L。LCD组大鼠血清TNF-α和IL-6的水平，在术后1d～3d升高最明显(P<0.01),而后也维持在一个较高的水平(P<0.01)。血清TNF-α和IL-6的水平在术后第3天升高最明显，分别达(1816.25±250.31)μg/L和(427.50±50.47)μg/L,均高于对照组(P<0.01),而后也维持在一个较高的水平(P<0.05)。血清ALT的水平变化趋势同血清TNF-α和IL-6，峰值[(529.88±131.07)IU/L]也是在术后第3天。术后各个时相血清ALT的水平均明显高于对照组(P<0.01)；正常对照组与假手术组的血清ALT水平在各时相均无差别(P<0.05)。
, 百拇医药
图1 不同时相各组大鼠血清胆红素，ALT，TNF-α和IL-6的动态变化
Fig1 Dynamic changes of serum bilirubin，ALT，TNF-α and IL-6 levels in different groups of rats afteroperation
2.3 肝组织中TNF-α和IL-6的水平 术后第14天的测定结果见表2。
表2 术后第14天各组大鼠肝组织中TNF-α和IL-6的水平
Tab2 Levels of hepatic tissue TNF-α and IL-6 in different
groups of rats on 14d post-operation
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Group
TNF-α
(μg/100g)
IL-6
(μg/100g)
Normal
<300
282.00±135.19
Sham LCD
<300
286.50±134.23
LCD
, 百拇医药
2353.75± 695.45△
972.75± 154.62△
△ P <0.01 vs sham LCD
2.4 TNF-α，IL-6和ALT之间的相关性 通过对LCD各组的相关分析,表明TNF-α与ALT呈正相关(r=0.631，P<0.01)；IL-6与ALT呈正相关(r=0.790,P<0.01)；TNF-α与IL-6呈正相关(r=0.890,P<0.01)。
3 讨论
梗阻性黄疸所致肝损伤及多种并发症原因较多,细胞因子的参与也是其中之一。本研究结果显示,大鼠结扎胆总管后,血清TNF-α和IL-6的水平迅速升高,而后处于一较高水平,并与血清ALT水平的升高呈正相关(r值分别为0.631和0.782),表明二者均参与了肝细胞的损伤。LCD大鼠肝组织中TNFa和IL-6的水平与对照组相比较也明显升高(P<0.01)，进一步证明了上述结论。导致肝细胞损伤的机制可能有以下4个方面：①TNF-α激活中性粒细胞，使之向肝窦内皮粘附并穿过，而导致肝细胞损伤[4]。②TNF-α通过激活凝血系统导致肝内毛细血管中血栓形成，而导致肝细胞的损伤[5]。③TNF-α、IL-6和血小板活化因子(PAF)可协同作用而导致肝细胞损伤[6]。④TNF-α、IL-6通过激活肝内的磷脂酶，分解磷脂为花生四烯酸，而产生对肝细胞有毒性作用的白三烯和超氧自由基，而导致肝细胞损伤。
, 百拇医药
胆总管结扎后引起上述细胞因子升高的主要原因是内毒素血症。因梗阻性黄疸时,体内网状内皮系统的功能受抑制,可导致肠道胆盐缺乏，从而利于革兰氏阴性菌内毒素的吸收,并大量入血而形成内毒素血症。内毒素具有刺激单核细胞产生TNF-α和IL-6的作用[7],故血清TNF-α和IL-6的水平可迅速升高并维持在较高水平。肝脏虽是清除TNF-α和IL-6的主要部位,但因梗阻性黄疸时所致肝损伤,使之对这些细胞因子的清除大大减弱,而在肝内处于较高水平,导致对肝细胞的损伤。此外,TNF-α还可诱导IL-6基因的表达,增加IL-6的产生,而加重肝的损伤。
本实验表明，血清TNF-α，IL-6，ALT和胆红素的峰值都在结扎后的7d内,提示对梗阻性黄疸患者早期给予手术处理的重要性。对此种患者的及时处理不仅有利于减轻其痛苦,而且可防止或减少肝损伤及其它并发症的发生。
作者简介：李端阳，男，37岁，主治医师，97级基金班学员
, 百拇医药
联系单位：武警江苏省总队南京医院，Tel.(025)3723209
参考文献
[1]Sheron S, Bird G, Goka J, et al. Elevated plasma interleukin-6 and increased severity and mortality in alcoholic hepatitis. Clin Exp Immunol, 1991; 84: 449～453
[2]Mozes T, Ben-Efraim S, Tak CT, et al. Serum levels of tumor necrosis factor deftermine the fatal or non-fatal course of endotoxic shock Immunol Lett, 1991; 27: 157～ 162
, 百拇医药
[3]Dixon JM, Armstrong CP, Duffy SW, et al. Upper gastrointestinal bleeding. A significant Complication after surgery for relief of obstructive jaundice. Ann Surg,1984; 199: 271～ 275
[4]Doi F, Qoya T,Toricu M.Potential role of hepatic macrophages in neutrophil- mediated liver injury in rat with sepsis.Hepatol, 1993;17:1086
[5]Van der Poll T, Buller HR,Gate HT, et al. Activation of coagulation after adminisration of tumour necrosis factor to normal subjects. New Engl J Med, 1990;322:1622～1624
[6]Nolan JP. Intestinal endotoxins as mediators of hepatic injury-an idea whose time has come again. Hepatol, 1989;10:887
[7]Lynn WA, Golenbock DT. Lipopolysaccharide antagonists.Immunol Today,1992;13:271～ 276
收稿：1998-08-31
修回：1998-12-25, 百拇医药
单位：第四军医大学唐都医院普通外科,西安710038
关键词：梗阻性黄疸；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-6
细胞与分子免疫学杂志990215摘要：目的:探讨梗阻性黄疸形成过程中,血清及肝组织TNF-α和IL-6的水平及其与肝损害的关系。方法:以结扎胆总管(ligatingcommonbileduct,LCD)的大鼠为模型,采用放射免疫法,测定LCD后不同时间血清和肝组织中TNF-α和IL-6的含量。结果：LCD组血清TNF-α和IL-6的水平[分别为(1285.00±72.23)μg/L和(301.25±44.86)μg/L]明显高于假手术对照组[分别为(791.00±164)μg/L和(235.00±47)μg/L],(P<0.01和P<0.05),肝组织中TNF-α和IL-6的含量[分别为(2353.75±695.45)μg/100g和(972.75±154.62)μg/100g]也明显高于对照组(均为<300μg/100g,P<0.01);于LCD后1d～3d变化最为明显,第7天～14天维持在一较高水平。二者与谷丙转氨酶(ALT)的变化均呈显著的正相关(相关系数r分别为0.631和0.782)。结论：TNF-α和IL-6均参与了肝脏的损伤。
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中国图书资料分类号：R392.11
Effects of TNF-α and IL-6 levels on liver during the formation of
experimental rat obstructive jaundice
Li Duanyang,Wu Jingsheng,Ma Qingjiu,Chu Yankui
(Department of General Surgery, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710038)
Keywords：obstructive jaundice tumour necrosis factor alpha interleukin-6
, http://www.100md.com
Abstract：Aim: To investigate serum and hepatic tissue TNF-α-and IL-6 levels and their relationship to liver damage during the formation of experimental obstructive jaundice in rat. Methods:The rat model was estabilished by ligating common bile duct(LCD).TNF-α and IL-6 levels in serum and hepatic tissue at different phases were detected by radioimmunoassay.Results:Serum TNF-α and IL-6 levels 〔 (1285.00± 72.23)μ g/L and (301.25± 44.86)μg/L, respectively〕in the 14 d group rats after LCD were increased significantly as compared with that in the control group 〔 (791± 164)μ g/L and (235.00± 47)μ g/L , P<0.01 and P<0.05, respectively〕. Hepatic tissue TNF-αand IL-6 levels 〔 (2353.75± 154.62)μg/100g and (972.75± 44.86)μg/100g, respectively〕, increased significantly(P<0.01) in the 14 d group rats after LCD, Serum levels of the tow cytokines reached peak values on 1 to 3d after LCD. TNF-αand IL-6 levels were higher on 7 day after LCD. Both the concentration of cytokines and serum ALT were well correlated(r=0.631 and r=0.782). Conclusion: Serum and hepatic tissue TNF-αand IL-6 were increased significantly in LCD rats, and were well correlated to ALT, suggesting that TNF-αand IL-6 play an important role in liver damage due to biliary obstuction.
, 百拇医药
TNF-α和IL-6由单核-巨噬细胞产生,二者均为炎症因子,体内水平过高时可导致严重损伤[1,2]。败血症、创伤和肝硬化等疾病中都有细胞因子的调控异常。梗阻性黄疸患者术后并发症的发生率很高,认为与其体内单核-巨噬细胞的功能改变有关[3],但关于梗阻性黄疸形成过程中细胞因子的水平改变与肝损害的关系报道尚不多。本研究通过结扎大鼠胆总管(LCD)建立的动物模型,采用放射免疫法测定了实验性大鼠梗阻性黄疸形成过程中不同时相血清及肝组织中TNF-α和IL-6的水平，并探讨了二者与肝损伤的关系。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 雄性Sprague-Dawley大鼠88只,体重(220g±20g)，由本校动物中心提供,以标准饲料喂养。将其随机分为正常组(8只)、假结扎组与LCD(各40只),后两组又按手术后的时间(1d,3d,7d,10d和14d)分为5个时相组，每个时相组各8只大鼠。
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1.2 动物模型的建立 参照经典方法,结扎前禁食12h,自由饮水,以1%戊巴比妥钠(25mg/kg)腹腔注射麻醉，消毒后腹部正中切口，暴露胆总管，距其起始部位0.5cm处游离胆总管，以3-0号丝线双重结扎,并切断、关腹。假结扎组大鼠除不结扎胆总管外余均同上;正常组大鼠不做任何处理。
1.3 标本采集 各组均心脏采血，分离血清，分装后置-80℃保存待用。同时取正常组及两个14d时相组大鼠的右叶肝组织,洗涤后即刻置-80℃保存待用。
1.4 检测方法 ①血清TNF-α和IL-6的水平采用放射免疫法测定，试剂盒由北京东亚免疫技术研究所提供,按说明书进行操作；②肝组织中TNF-α和IL-6含量的测定：取冷冻肝组织标本100mg，加入1NHAC 1 ml研磨后，置于100℃水浴10min，匀浆，4℃离心(3500r/min)20min，取上清，测定方法同上；③血清ALT和胆红素采用CL-8000型临床生化分析仪(日本产)测定。④测定结果以
±SD表示，用t检验、方差分析和相关分析进行数据处理。, 百拇医药
2 结果
2.1 血清胆红素，ALT，TNF-α和IL-6的水平 术后14d，正常组与对照组之间4种指标的测定结果见表1。
表1 术后第14天各组大鼠血清胆红素，ALT，TNF-α和IL-6的水平
Tab1 Levels of serum bilirubin,TNF-α ,IL-6 and ALT in different groups of rats on 14 d post-operation(n=8)
Group
Bilirubin
(μmol/L)
TNF-α
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(μg/L)
IL-6
(μg/L)
ALT
(IU/L)
Normal
7.25± 1.18
701.25± 133.57
190.00± 50.71
50.00± 12.12
Sham LCD
7.25± 1.19
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700.33± 147.00
225.00± 45.93
50.22± 10.66
LCD
199.85± 37.05▲
1285.00± 72.23▲
301.25± 44.86△
319.75± 111.1▲
△ P <0.05，P <0.01，vs Sham LCD group
, 百拇医药 2.2 血清胆红素，TNF-α，IL-6和ALT水平的动态变化 所获结果见图1。术后LCD组的血清胆红素迅速升高，各个时相测定的结果均明显高于对照组(P<0.01)。手术后第7天血清胆红素水平达峰值[(214.58±29.81)μmol/L],以后维持在一个高水平。术后第14天时，胆红素值为(199.85±37.05)μmol/L。LCD组大鼠血清TNF-α和IL-6的水平，在术后1d～3d升高最明显(P<0.01),而后也维持在一个较高的水平(P<0.01)。血清TNF-α和IL-6的水平在术后第3天升高最明显，分别达(1816.25±250.31)μg/L和(427.50±50.47)μg/L,均高于对照组(P<0.01),而后也维持在一个较高的水平(P<0.05)。血清ALT的水平变化趋势同血清TNF-α和IL-6，峰值[(529.88±131.07)IU/L]也是在术后第3天。术后各个时相血清ALT的水平均明显高于对照组(P<0.01)；正常对照组与假手术组的血清ALT水平在各时相均无差别(P<0.05)。
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图1 不同时相各组大鼠血清胆红素，ALT，TNF-α和IL-6的动态变化
Fig1 Dynamic changes of serum bilirubin，ALT，TNF-α and IL-6 levels in different groups of rats afteroperation
2.3 肝组织中TNF-α和IL-6的水平 术后第14天的测定结果见表2。
表2 术后第14天各组大鼠肝组织中TNF-α和IL-6的水平
Tab2 Levels of hepatic tissue TNF-α and IL-6 in different
groups of rats on 14d post-operation
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Group
TNF-α
(μg/100g)
IL-6
(μg/100g)
Normal
<300
282.00±135.19
Sham LCD
<300
286.50±134.23
LCD
, 百拇医药
2353.75± 695.45△
972.75± 154.62△
△ P <0.01 vs sham LCD
2.4 TNF-α，IL-6和ALT之间的相关性 通过对LCD各组的相关分析,表明TNF-α与ALT呈正相关(r=0.631，P<0.01)；IL-6与ALT呈正相关(r=0.790,P<0.01)；TNF-α与IL-6呈正相关(r=0.890,P<0.01)。
3 讨论
梗阻性黄疸所致肝损伤及多种并发症原因较多,细胞因子的参与也是其中之一。本研究结果显示,大鼠结扎胆总管后,血清TNF-α和IL-6的水平迅速升高,而后处于一较高水平,并与血清ALT水平的升高呈正相关(r值分别为0.631和0.782),表明二者均参与了肝细胞的损伤。LCD大鼠肝组织中TNFa和IL-6的水平与对照组相比较也明显升高(P<0.01)，进一步证明了上述结论。导致肝细胞损伤的机制可能有以下4个方面：①TNF-α激活中性粒细胞，使之向肝窦内皮粘附并穿过，而导致肝细胞损伤[4]。②TNF-α通过激活凝血系统导致肝内毛细血管中血栓形成，而导致肝细胞的损伤[5]。③TNF-α、IL-6和血小板活化因子(PAF)可协同作用而导致肝细胞损伤[6]。④TNF-α、IL-6通过激活肝内的磷脂酶，分解磷脂为花生四烯酸，而产生对肝细胞有毒性作用的白三烯和超氧自由基，而导致肝细胞损伤。
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胆总管结扎后引起上述细胞因子升高的主要原因是内毒素血症。因梗阻性黄疸时,体内网状内皮系统的功能受抑制,可导致肠道胆盐缺乏，从而利于革兰氏阴性菌内毒素的吸收,并大量入血而形成内毒素血症。内毒素具有刺激单核细胞产生TNF-α和IL-6的作用[7],故血清TNF-α和IL-6的水平可迅速升高并维持在较高水平。肝脏虽是清除TNF-α和IL-6的主要部位,但因梗阻性黄疸时所致肝损伤,使之对这些细胞因子的清除大大减弱,而在肝内处于较高水平,导致对肝细胞的损伤。此外,TNF-α还可诱导IL-6基因的表达,增加IL-6的产生,而加重肝的损伤。
本实验表明，血清TNF-α，IL-6，ALT和胆红素的峰值都在结扎后的7d内,提示对梗阻性黄疸患者早期给予手术处理的重要性。对此种患者的及时处理不仅有利于减轻其痛苦,而且可防止或减少肝损伤及其它并发症的发生。
作者简介：李端阳，男，37岁，主治医师，97级基金班学员
, 百拇医药
联系单位：武警江苏省总队南京医院，Tel.(025)3723209
参考文献
[1]Sheron S, Bird G, Goka J, et al. Elevated plasma interleukin-6 and increased severity and mortality in alcoholic hepatitis. Clin Exp Immunol, 1991; 84: 449～453
[2]Mozes T, Ben-Efraim S, Tak CT, et al. Serum levels of tumor necrosis factor deftermine the fatal or non-fatal course of endotoxic shock Immunol Lett, 1991; 27: 157～ 162
, 百拇医药
[3]Dixon JM, Armstrong CP, Duffy SW, et al. Upper gastrointestinal bleeding. A significant Complication after surgery for relief of obstructive jaundice. Ann Surg,1984; 199: 271～ 275
[4]Doi F, Qoya T,Toricu M.Potential role of hepatic macrophages in neutrophil- mediated liver injury in rat with sepsis.Hepatol, 1993;17:1086
[5]Van der Poll T, Buller HR,Gate HT, et al. Activation of coagulation after adminisration of tumour necrosis factor to normal subjects. New Engl J Med, 1990;322:1622～1624
[6]Nolan JP. Intestinal endotoxins as mediators of hepatic injury-an idea whose time has come again. Hepatol, 1989;10:887
[7]Lynn WA, Golenbock DT. Lipopolysaccharide antagonists.Immunol Today,1992;13:271～ 276
收稿：1998-08-31
修回：1998-12-25, 百拇医药