蓖麻毒素及其修饰物对U937细胞IL-1β和TNF-α的诱导作用*
作者：董巨莹 李琦 王文学 药立波 苏成芝
单位：董巨莹，王文学，药立波，苏成芝：第四军医大学，生物化学与分子生物学教研室；李琦：免疫学教研室，西安710032
关键词：蓖麻毒素；修饰；细胞因子
细胞与分子免疫学杂志990214摘 要：蓖麻毒素(ricin)的抗癌作用是，借助于其抑制细胞的蛋白质合成而导致细胞死亡的毒性作用，但其缺点是其分子中的B链含有半乳糖结合位点,可非特异性的与真核细胞结合。本研究通过采用双功能剂SPDP修饰ricin后,可达到部分或完全破坏ricin分子结构中的半乳糖结合位点。另外,用MTT法比较了修饰后的ricin与未修饰ricin的细胞毒性,同时检测并比较了两者对细胞因子TNF-α和IL-1β的诱生作用。结果表明，修饰后的ricin与未修饰的ricin相比较,两者对U937细胞的毒性在时间效应和剂量效应上没有显著性差异。修饰后的ricin诱生TNF-α的量比未修饰的ricin多,且时间早;而对于诱生IL-1β来说,在24h前两者差别不大,在48h时,修饰的ricin则明显高于未修饰的ricin。提示ricin经SPDP修饰后,毒性改变不大,但其诱生细胞因子TNF-α和IL-1β的量则高于未修饰的ricin。
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中国图书资料分类号：R392.31
Indulction of IL-1βand TNF-αfrom U937 cells by ricin and its modifying agent
Dong Juying, Li Qi， Wang Wenxue， Yao Libo， Su Chengzhi
(Department of Biochemistry and Molecular Biology,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
Keywords：ricin modification TNF-α IL-1β
Abstract：The use of ricin, which inhibit protein synthesis and result in cell death,has elicited great interest as a potential anti-cancer reagent.But they are not specific owing to their ability to bind non-target eukaryotic cells through the B chain of ricin. According to ricin structure, we have prepared a modified ricin by reacting ricin with heterobifunctional cross linking reagent N-succinimidyl 3-(2- pyridyldithio)-propionate(SPDP) which blocks the galactose binding site by its linkage to ricin B chain. In this study, a comparison on toxicity and cytokine of induction of ricin with that of ricin-PDP has been investigated.The results showed that there was no distinct difference in dose-response and time-response of the toxicity for U937 cells between ricin and ricin-PDP. Amount of TNF-α which has been induced by ricin-PDP was more than by ricin, and the time is more earlier;For IL- 1β , there has been no difference before 24h,but at 48h amount of induction by ricin-PDP was obviousrly increased. This indicate that toxicity has not distinctly changed, nevertheless, amount of cytokine inducted by ricin-PDP was more than those by ricin.
, 百拇医药
蓖麻毒素(ricin)是存在于蓖麻籽中的一种糖蛋白。以往认为，它能使真核细胞内的核糖体60S亚基灭活，而使细胞内蛋白质合成抑制而死亡〔1〕。近期研究表明，ricin的毒性作用除可抑制核糖体外，还能诱导人外周血单核细胞产生TNF-α和IL-1β〔2〕。这些细胞因子的产生对正常组织也具有强烈的毒性作用。因ricin结构上存在半乳糖结合位点，能够非特异地结合于含半乳糖残基受体的细胞膜表面，故将ricin作为免疫毒素进行抗癌研究，仍克服不了ricin与真核细胞的非特异性结合作用。我们采用异型双功能交联剂二硫吡啶硫酮琥珀酰亚胺酯(SPDP)修饰ricin后,SPDP分子上的琥珀酰基团被ricin替换,而得到ricinPDP,发现修饰后的ricin对于肝癌组织的亲和活性增高〔3〕。本研究比较了修饰后的ricin与未修饰的ricin对U937细胞的毒性，以及二者对诱生U937细胞产生TNF-α和IL-1β的变化。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 试剂 ricin按Lappi方法〔4〕提取，经SDS-PAGE鉴定为单1条带，其相对分子质量(Mr)为65000。SPDP按文献〔5〕改进合成。噻唑蓝(MTT)为Fluke公司产品。二硫苏糖醇(DTT)。为华美公司产品。二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品。细胞培养液RPMI-1640购于Gibco公司。TNF-α和IL-1β测定试剂盒购于美国Genzyme公司，深圳晶美公司分装。U937细胞购于上海细胞生物所。
1.2 方法
1.2.1 Ricin的化学修饰 取ricin(浓度为1.18mol/L)10ml放入透析袋中，在pH8.0,0.1mol/L的PBS中透析24h。称取0.5mgSPDP,用N,N-二甲基甲酰胺溶解,在磁力搅拌下,将ricin逐滴加入到溶液中,继续搅拌30min,取出，对PBS(pH7.5,10mol/L)彻底透析。
1.2.2 Ricin和ricinPDP对U937细胞的毒性比较 用含10%胎牛血清的RPMI-1640在CO2孵箱中培养至对数生长期时,收集计数后,在96孔培养板中每孔加入1×105个细胞。实验分为两组,一组加入不同浓度的ricin和ricin-PDP,作用24h;另一组加入0.05pmol/L的ricin及其ricin-PDP,作用不同的时间。同时设阴性及阳性对照,阴性对照不加细胞,其他同实验组；阳性对照加细胞，不加ricin和ricin-PDP，其他同实验组。每3孔为1组,浓度相同,每孔体积为200μl。培养一定时间后,移去上清液,用培养液洗涤两次,加入新鲜配制的MTT(以5mg/ml的浓度每孔加入20μl)。作用4h后,出现蓝黑色结晶,每孔加入二甲基亚砜150μl,振荡15min,使结晶充分溶解,选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸收值,记录结果。
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1.2.3 Ricin与ricin-PDP对细胞因子的诱生 ①细胞培养上清的收集：以含10%的小牛血清、20mmol/LHEPES的RPMI-1640培养液，于37℃CO2孵箱中培养U937细胞。将细胞分装于96孔培养板中，每孔细胞数为1×105个，每3孔为1组，分别加入0.05pmol/L的ricin及其修饰物，于6h,12h,24h和48h收集培养上清。不同浓度(0pmol/L,0.05pmol/L,0.1pmol/L及0.2pmol/L)的ricin及其修饰物作用于U937细胞，24h后收集细胞培养上清，于-80℃冻存备用。②细胞因子的检测：按照kit的要求进行操作。③数据整理和结果判断：以标准品的浓度为横座标，A值为纵座标，绘制标准曲线。根据标本的A值可从标准曲线上查出其浓度。每个标准品和标本的A值应减去空白对照的A值。
2 结果
2.1 PDP结合量的测定 取透析后的ricinPDP1ml，加入5mgDTT在磁力搅拌下反应30min，加入0.1mol/L,pH4.5的醋酸缓冲液至3ml，在紫外分光度计上比色(以DTT为空白对照)，并测定波长250nm～400nm的吸收曲线。根据波长343nm的吸收值(A343=0.133)，计算出每个ricin分子中PDP的结合量，平均为4.9个SPDP分子。
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图1 DTT还原后的ricin-PDP与ricin在不同波长(λ)测定的吸收曲线
Fig1 Absorbance curves for ricin and ricin-PDP reduced by DTT at different wavelength
2.2 Ricin和ricin-PDP对U937细胞的毒性 用ELISA于波长490nm检测同一时间不同浓度的ricin及ricin-PDP与U937细胞作用的A值，以及同一浓度、不同作用时间ricin及ricin-PDP与U937细胞作用的A值。取每组5个数据的均数,进行统计学处理两两比较,观察各组间相差是否显著。
图2 不同浓度的ricin及ricin-PDP与U937细胞作用24h的A值
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Fig2 A value of interaction of ricin and ricin- PDP at different concentration with U937 for 24h
图3 0.05pmol/L的ricin及ricin-PDP与U937细胞作用不同时间的A值
Fig3 A value of interaction of ricin and ricin-PDP in 0.05 pmol/L with U937 at different time points
2.3 Ricin和ricinPDP对U937细胞的诱生作用
2.3.1 Ricin及ricin-PDP作用不同时间对诱生TNF-α和IL-1β的影响以0.05pmol/L的ricin及ricinPDP作用于U937细胞后,在不同时间点测定TNF-α和IL-1β的分泌量。由表1可看出，ricin-PDP作用U937细胞后，分泌TNF-α的量随作用时间的延长而逐渐降低；而ricin诱生TNF-α的量则随时间的延长而逐渐增高;ricin-PDP诱生IL-1β的量较ricin略高,于48h时明显高于未修饰的ricin。
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表1 Ricin和ricin-PDP作用不同时间对诱生细胞因子的影响
Tab1 The effects of ricin and ricin-PDP on inducing cytokines at different time points
Induced
time(h)
TNF-α(pmol/L)
IL-1β(pmol/L)
Ricin
Ricin-PDP*
Ricin
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Ricin-PDP*
6
0
24
31.3± 5.0
50.0± 6.0
12
6± 1.2
23.0± 5.2
31.2± 5.
0 60.0± 9.0
24
, 百拇医药
11.0± 3.0
21.0± 6.8
50.0± 9.0
52.5± 12.0
48
14.0± 1.0
20.1± 9.0
60.0± 3.0
190.0± 13.0
*The concentrations of ricin and ricin-PDP are 0.05pmol/L；The results of control group are zero at different time points
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2.3.2 不同剂量的ricin及ricin-PDP对诱生TNF-α和IL-1β的影响 将不同浓度的ricin及ricin-PDP作用于U937细胞24h,检测U937细胞分泌TNF-α和IL-1β的量。表2表明,低浓度的ricin-PDP诱生TNF-α的量较ricin低;而在高浓度时,两者的差别不大。两者对于诱生IL-1β的分泌量未见明显差别。
表2 不同浓度的ricin和ricin-PDP诱生细胞因子的作用
Tab2 The effects of ricin and ricin-PDP of differeret concontration on inducing cytokine at different time points
Concentration
(pmol/L)
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TNF-α(pmol/L)
IL-1β(pmol/L)
Ricin
Ricin-PDP△
Ricin
Ricin-PDP△
0.05
11.0± 3.0
21.0± 6.8
50.0± 9.0
52.5± 12.0
, 百拇医药
0.1
9.1± 1.8
7.8± 2.0
30.0± 5.0
50.0± 6.0
0.2
5.6 ± 1.0
6.0± 2.0
48.0± 7.0
52.5± 4.0
△The interaction of ricin and ricin- PDP with U937 cells at 24h
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3 讨论
Ricin是由A,B两条肽链构成的糖蛋白。Ricin分子中有半乳糖结合位点可非特异的与真核细胞膜表面的β-1，4-甙键半乳糖残基结合，而后A链穿过细胞膜，与核糖体60S亚基结合而抑制蛋白质合成，导致细胞中毒死亡〔5〕。目前的研究主要是将ricin与不同的抗ricin mAb或基因工程抗体相连接，制成免疫毒素而进行导向抗癌治疗,但仍然克服不了ricin与真核细胞的非特异性结合。也有人将ricin的A链与mAb相连,但其抗癌效果大大降低〔6〕。ricin的抗癌作用,A,B链均发挥着不同的作用,将二者分开后ricin的抗癌效果将大大降低。根据这一特性,本研究中采用了异型双功能交联剂SPDP修饰ricin〔7〕,其目的是去除或削弱B链的非特异性结合作用。由于SPDP分子中有N琥珀酰亚胺基酯键能与ricin分子中的-NH2结合,而ricinB链上的半乳糖结合位点主要由酪氨酸及含ε-NH2的赖氨酸等残基构成，故SPDP与这些氨基酸的氨基结合可导致半乳糖结合位点的空间构型改变或部分改变而使完整ricin部分或完全失去与半乳糖的结合能力。通过测试修饰后的ricin与半乳糖结合的试验,计算出每个ricin可平均交联4.9个SPDP分子，该交联率便能够部分地破坏半乳糖结合位点的空间结构。
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为比较ricin和ricin-PDP对细胞的毒性,以MTT法检测了两者对U937细胞的剂量效应和时间效应。由曲线图可看出，随着剂量的增加，ricin-PDP的A值较ricin高,表明活细胞数多，即在同一浓度时，ricin-PDP的毒性较ricin略小，但两者差别不显著。在时间效应曲线图上,两者的作用在10h之内，细胞的死亡率不高；而随着时间的延长，细胞的死亡率也大大增加。因此，将二者诱生细胞因子的浓度定为0.05pmol/L,比较在不同的作用时间两者诱生TNF-α和IL-1β量的变化。结果表明，在同一剂量时，ricin诱导TNF-α的时间较ricinPDP要晚，且诱生细胞因子的量比ricin-PDP少。从诱导IL-1β的量来看,ricin-PDP比ricin略高,于48h时增加更明显。Ricin和ricin-PDP对细胞作用24h时,随着浓度的增大，两者诱生TNF-α的量明显减少;但诱导细胞产生IL-1β的量没有明显的变化。高剂量的ricin对细胞具有强烈的毒性作用，可杀伤细胞而不诱导其活化，因此无细胞因子的释放或释放的细胞因子明显减少〔8〕。Ricin通过释放TNF-α和IL-1β等因子而使细胞容易溶解。这些结果同光镜看到的不同时间和不同剂量ricin作用细胞后所观察到的结果一致。Ricin通过对蛋白合成的抑制也能增强TNF-α的毒作用。Ricin及ricin-PDP都能诱导单核细胞产生TNF-α和IL-1β等因子，但ricin-PDP诱生这些细胞因子的量明显高于未修饰的ricin,从而为其在抗癌研究中的作用提供了重要的理论基础。
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*国家自然科学基金资助项目，39500122
作者简介：董巨莹，女，34岁，博士。西安市长乐西路17号，Tel：(029)3374516(0)/2514508(H)
参考文献
[1]Sjur OS. Mechanism of action of the toxic lectins abrin and ricin.Nature， 1974;249:627～ 628
[2]Federico L, Mana CM. Ricin induces the production of tumour necrosis factor α and interleukin-1β by human peripheral-blood mononuclear cells. Biochem J， 1993; 294:517～ 523
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[3]董巨莹，王文学，曹云新.蓖麻毒素被修饰前后在小鼠主要脏器的定位比较研究.第四军医大学学报，1995；16(1)：17～20
[4]Lappi DA. Dissulfide bond connecting chains of ricin. Proc Natl Acad Sci USA , 1978;75:1096～ 1099
[5]Robert BW, John FH , Mark AP. Ricin : mechanism of action,detection,and intoxication. J Toxiol, 1995; 14(4): 483～ 488
[6]裴武红,沈倍奋.蓖麻毒素内化的研究进展.免疫学杂志,1997;13(4):275～279
[7]王文学.异型双功能交联剂SPDP的合成改进.第四军医大学学报，1987；8(1)：66～69
[8]Bakouche O, Brown DC, Lacnman LB. Subcellular localization of human monocyte interleukin 1: evidence for an inactive precursor molecule and a possible mechanism for IL-1 release. J Immunol, 1987; 138: 4249～4254
收稿：1998-07-10
修回：1998-10-26, 百拇医药
单位：董巨莹，王文学，药立波，苏成芝：第四军医大学，生物化学与分子生物学教研室；李琦：免疫学教研室，西安710032
关键词：蓖麻毒素；修饰；细胞因子
细胞与分子免疫学杂志990214摘 要：蓖麻毒素(ricin)的抗癌作用是，借助于其抑制细胞的蛋白质合成而导致细胞死亡的毒性作用，但其缺点是其分子中的B链含有半乳糖结合位点,可非特异性的与真核细胞结合。本研究通过采用双功能剂SPDP修饰ricin后,可达到部分或完全破坏ricin分子结构中的半乳糖结合位点。另外,用MTT法比较了修饰后的ricin与未修饰ricin的细胞毒性,同时检测并比较了两者对细胞因子TNF-α和IL-1β的诱生作用。结果表明，修饰后的ricin与未修饰的ricin相比较,两者对U937细胞的毒性在时间效应和剂量效应上没有显著性差异。修饰后的ricin诱生TNF-α的量比未修饰的ricin多,且时间早;而对于诱生IL-1β来说,在24h前两者差别不大,在48h时,修饰的ricin则明显高于未修饰的ricin。提示ricin经SPDP修饰后,毒性改变不大,但其诱生细胞因子TNF-α和IL-1β的量则高于未修饰的ricin。
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Indulction of IL-1βand TNF-αfrom U937 cells by ricin and its modifying agent
Dong Juying, Li Qi， Wang Wenxue， Yao Libo， Su Chengzhi
(Department of Biochemistry and Molecular Biology,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
Keywords：ricin modification TNF-α IL-1β
Abstract：The use of ricin, which inhibit protein synthesis and result in cell death,has elicited great interest as a potential anti-cancer reagent.But they are not specific owing to their ability to bind non-target eukaryotic cells through the B chain of ricin. According to ricin structure, we have prepared a modified ricin by reacting ricin with heterobifunctional cross linking reagent N-succinimidyl 3-(2- pyridyldithio)-propionate(SPDP) which blocks the galactose binding site by its linkage to ricin B chain. In this study, a comparison on toxicity and cytokine of induction of ricin with that of ricin-PDP has been investigated.The results showed that there was no distinct difference in dose-response and time-response of the toxicity for U937 cells between ricin and ricin-PDP. Amount of TNF-α which has been induced by ricin-PDP was more than by ricin, and the time is more earlier;For IL- 1β , there has been no difference before 24h,but at 48h amount of induction by ricin-PDP was obviousrly increased. This indicate that toxicity has not distinctly changed, nevertheless, amount of cytokine inducted by ricin-PDP was more than those by ricin.
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蓖麻毒素(ricin)是存在于蓖麻籽中的一种糖蛋白。以往认为，它能使真核细胞内的核糖体60S亚基灭活，而使细胞内蛋白质合成抑制而死亡〔1〕。近期研究表明，ricin的毒性作用除可抑制核糖体外，还能诱导人外周血单核细胞产生TNF-α和IL-1β〔2〕。这些细胞因子的产生对正常组织也具有强烈的毒性作用。因ricin结构上存在半乳糖结合位点，能够非特异地结合于含半乳糖残基受体的细胞膜表面，故将ricin作为免疫毒素进行抗癌研究，仍克服不了ricin与真核细胞的非特异性结合作用。我们采用异型双功能交联剂二硫吡啶硫酮琥珀酰亚胺酯(SPDP)修饰ricin后,SPDP分子上的琥珀酰基团被ricin替换,而得到ricinPDP,发现修饰后的ricin对于肝癌组织的亲和活性增高〔3〕。本研究比较了修饰后的ricin与未修饰的ricin对U937细胞的毒性，以及二者对诱生U937细胞产生TNF-α和IL-1β的变化。
1 材料和方法
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1.1 试剂 ricin按Lappi方法〔4〕提取，经SDS-PAGE鉴定为单1条带，其相对分子质量(Mr)为65000。SPDP按文献〔5〕改进合成。噻唑蓝(MTT)为Fluke公司产品。二硫苏糖醇(DTT)。为华美公司产品。二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品。细胞培养液RPMI-1640购于Gibco公司。TNF-α和IL-1β测定试剂盒购于美国Genzyme公司，深圳晶美公司分装。U937细胞购于上海细胞生物所。
1.2 方法
1.2.1 Ricin的化学修饰 取ricin(浓度为1.18mol/L)10ml放入透析袋中，在pH8.0,0.1mol/L的PBS中透析24h。称取0.5mgSPDP,用N,N-二甲基甲酰胺溶解,在磁力搅拌下,将ricin逐滴加入到溶液中,继续搅拌30min,取出，对PBS(pH7.5,10mol/L)彻底透析。
1.2.2 Ricin和ricinPDP对U937细胞的毒性比较 用含10%胎牛血清的RPMI-1640在CO2孵箱中培养至对数生长期时,收集计数后,在96孔培养板中每孔加入1×105个细胞。实验分为两组,一组加入不同浓度的ricin和ricin-PDP,作用24h;另一组加入0.05pmol/L的ricin及其ricin-PDP,作用不同的时间。同时设阴性及阳性对照,阴性对照不加细胞,其他同实验组；阳性对照加细胞，不加ricin和ricin-PDP，其他同实验组。每3孔为1组,浓度相同,每孔体积为200μl。培养一定时间后,移去上清液,用培养液洗涤两次,加入新鲜配制的MTT(以5mg/ml的浓度每孔加入20μl)。作用4h后,出现蓝黑色结晶,每孔加入二甲基亚砜150μl,振荡15min,使结晶充分溶解,选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸收值,记录结果。
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1.2.3 Ricin与ricin-PDP对细胞因子的诱生 ①细胞培养上清的收集：以含10%的小牛血清、20mmol/LHEPES的RPMI-1640培养液，于37℃CO2孵箱中培养U937细胞。将细胞分装于96孔培养板中，每孔细胞数为1×105个，每3孔为1组，分别加入0.05pmol/L的ricin及其修饰物，于6h,12h,24h和48h收集培养上清。不同浓度(0pmol/L,0.05pmol/L,0.1pmol/L及0.2pmol/L)的ricin及其修饰物作用于U937细胞，24h后收集细胞培养上清，于-80℃冻存备用。②细胞因子的检测：按照kit的要求进行操作。③数据整理和结果判断：以标准品的浓度为横座标，A值为纵座标，绘制标准曲线。根据标本的A值可从标准曲线上查出其浓度。每个标准品和标本的A值应减去空白对照的A值。
2 结果
2.1 PDP结合量的测定 取透析后的ricinPDP1ml，加入5mgDTT在磁力搅拌下反应30min，加入0.1mol/L,pH4.5的醋酸缓冲液至3ml，在紫外分光度计上比色(以DTT为空白对照)，并测定波长250nm～400nm的吸收曲线。根据波长343nm的吸收值(A343=0.133)，计算出每个ricin分子中PDP的结合量，平均为4.9个SPDP分子。
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图1 DTT还原后的ricin-PDP与ricin在不同波长(λ)测定的吸收曲线
Fig1 Absorbance curves for ricin and ricin-PDP reduced by DTT at different wavelength
2.2 Ricin和ricin-PDP对U937细胞的毒性 用ELISA于波长490nm检测同一时间不同浓度的ricin及ricin-PDP与U937细胞作用的A值，以及同一浓度、不同作用时间ricin及ricin-PDP与U937细胞作用的A值。取每组5个数据的均数,进行统计学处理两两比较,观察各组间相差是否显著。
图2 不同浓度的ricin及ricin-PDP与U937细胞作用24h的A值
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Fig2 A value of interaction of ricin and ricin- PDP at different concentration with U937 for 24h
图3 0.05pmol/L的ricin及ricin-PDP与U937细胞作用不同时间的A值
Fig3 A value of interaction of ricin and ricin-PDP in 0.05 pmol/L with U937 at different time points
2.3 Ricin和ricinPDP对U937细胞的诱生作用
2.3.1 Ricin及ricin-PDP作用不同时间对诱生TNF-α和IL-1β的影响以0.05pmol/L的ricin及ricinPDP作用于U937细胞后,在不同时间点测定TNF-α和IL-1β的分泌量。由表1可看出，ricin-PDP作用U937细胞后，分泌TNF-α的量随作用时间的延长而逐渐降低；而ricin诱生TNF-α的量则随时间的延长而逐渐增高;ricin-PDP诱生IL-1β的量较ricin略高,于48h时明显高于未修饰的ricin。
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表1 Ricin和ricin-PDP作用不同时间对诱生细胞因子的影响
Tab1 The effects of ricin and ricin-PDP on inducing cytokines at different time points
Induced
time(h)
TNF-α(pmol/L)
IL-1β(pmol/L)
Ricin
Ricin-PDP*
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Ricin-PDP*
6
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31.3± 5.0
50.0± 6.0
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23.0± 5.2
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50.0± 9.0
52.5± 12.0
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14.0± 1.0
20.1± 9.0
60.0± 3.0
190.0± 13.0
*The concentrations of ricin and ricin-PDP are 0.05pmol/L；The results of control group are zero at different time points
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2.3.2 不同剂量的ricin及ricin-PDP对诱生TNF-α和IL-1β的影响 将不同浓度的ricin及ricin-PDP作用于U937细胞24h,检测U937细胞分泌TNF-α和IL-1β的量。表2表明,低浓度的ricin-PDP诱生TNF-α的量较ricin低;而在高浓度时,两者的差别不大。两者对于诱生IL-1β的分泌量未见明显差别。
表2 不同浓度的ricin和ricin-PDP诱生细胞因子的作用
Tab2 The effects of ricin and ricin-PDP of differeret concontration on inducing cytokine at different time points
Concentration
(pmol/L)
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TNF-α(pmol/L)
IL-1β(pmol/L)
Ricin
Ricin-PDP△
Ricin
Ricin-PDP△
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11.0± 3.0
21.0± 6.8
50.0± 9.0
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9.1± 1.8
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30.0± 5.0
50.0± 6.0
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5.6 ± 1.0
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△The interaction of ricin and ricin- PDP with U937 cells at 24h
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3 讨论
Ricin是由A,B两条肽链构成的糖蛋白。Ricin分子中有半乳糖结合位点可非特异的与真核细胞膜表面的β-1，4-甙键半乳糖残基结合，而后A链穿过细胞膜，与核糖体60S亚基结合而抑制蛋白质合成，导致细胞中毒死亡〔5〕。目前的研究主要是将ricin与不同的抗ricin mAb或基因工程抗体相连接，制成免疫毒素而进行导向抗癌治疗,但仍然克服不了ricin与真核细胞的非特异性结合。也有人将ricin的A链与mAb相连,但其抗癌效果大大降低〔6〕。ricin的抗癌作用,A,B链均发挥着不同的作用,将二者分开后ricin的抗癌效果将大大降低。根据这一特性,本研究中采用了异型双功能交联剂SPDP修饰ricin〔7〕,其目的是去除或削弱B链的非特异性结合作用。由于SPDP分子中有N琥珀酰亚胺基酯键能与ricin分子中的-NH2结合,而ricinB链上的半乳糖结合位点主要由酪氨酸及含ε-NH2的赖氨酸等残基构成，故SPDP与这些氨基酸的氨基结合可导致半乳糖结合位点的空间构型改变或部分改变而使完整ricin部分或完全失去与半乳糖的结合能力。通过测试修饰后的ricin与半乳糖结合的试验,计算出每个ricin可平均交联4.9个SPDP分子，该交联率便能够部分地破坏半乳糖结合位点的空间结构。
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为比较ricin和ricin-PDP对细胞的毒性,以MTT法检测了两者对U937细胞的剂量效应和时间效应。由曲线图可看出，随着剂量的增加，ricin-PDP的A值较ricin高,表明活细胞数多，即在同一浓度时，ricin-PDP的毒性较ricin略小，但两者差别不显著。在时间效应曲线图上,两者的作用在10h之内，细胞的死亡率不高；而随着时间的延长，细胞的死亡率也大大增加。因此，将二者诱生细胞因子的浓度定为0.05pmol/L,比较在不同的作用时间两者诱生TNF-α和IL-1β量的变化。结果表明，在同一剂量时，ricin诱导TNF-α的时间较ricinPDP要晚，且诱生细胞因子的量比ricin-PDP少。从诱导IL-1β的量来看,ricin-PDP比ricin略高,于48h时增加更明显。Ricin和ricin-PDP对细胞作用24h时,随着浓度的增大，两者诱生TNF-α的量明显减少;但诱导细胞产生IL-1β的量没有明显的变化。高剂量的ricin对细胞具有强烈的毒性作用，可杀伤细胞而不诱导其活化，因此无细胞因子的释放或释放的细胞因子明显减少〔8〕。Ricin通过释放TNF-α和IL-1β等因子而使细胞容易溶解。这些结果同光镜看到的不同时间和不同剂量ricin作用细胞后所观察到的结果一致。Ricin通过对蛋白合成的抑制也能增强TNF-α的毒作用。Ricin及ricin-PDP都能诱导单核细胞产生TNF-α和IL-1β等因子，但ricin-PDP诱生这些细胞因子的量明显高于未修饰的ricin,从而为其在抗癌研究中的作用提供了重要的理论基础。
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*国家自然科学基金资助项目，39500122
作者简介：董巨莹，女，34岁，博士。西安市长乐西路17号，Tel：(029)3374516(0)/2514508(H)
参考文献
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收稿：1998-07-10
修回：1998-10-26, 百拇医药