TLSFJM对同种异体抗原诱导的小鼠杀伤性T细胞分化及效应功能的影响*
作者：韩卫宁 李德敏 苏丽 欧阳为明 贾卫 金伯泉
单位：第四军医大学免疫学教研室，西安，710032
关键词：抑制因子；CTL；分化
细胞与分子免疫学杂志990212摘 要：本文以小鼠混合淋巴细胞反应为模型，研究了JM急性T淋巴细胞白血病细胞分泌的抑制因子(TLSFJM)在体外对同种异体抗原诱导小鼠T细胞增殖和杀伤性T细胞分化的影响。结果表明：(1)TLSFJM可明显抑制同种异体抗原刺激的T细胞增殖，且具有剂量依赖性；(2)TLSFJM能有效地抑制同种异体抗原诱导的小鼠CTL分化；(3)TLSFJM对杀伤相CTL的杀伤活性没有抑制作用。
中国图书资料分类号：R392.11
, http://www.100md.com
The effect of TLSFJM on alloantigen-induced differentiation and
cytotoxicity of mouse CTL
Han Weining, Li Demin, Su li, Ouyang Weiming, Jia wei, Jin Boquan
(Department of Immunology, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Keywords：suppressor factor CTL differentiation
Abstract：The effect of TLSFJM on alloantigen-induced differentiation and cytotoxicity of mouse CTL was investigated in vitro using mouse mixed lymphocyte reaction(MLR). The results showed that TLSFJM markedly suppressed alloantigen-induced proliferation of T cells (82% of inhibition when 1% concentration of TLSFJM was added) and differentiation of CTL in a dose-dependent manner but have no influence on the cyctotoxicity of CTL when TLSFJM was added in cytolytic phage.
, 百拇医药
免疫抑制因子是机体免疫系统的一类重要免疫调节分子。各种不同的免疫抑制因子通过直接或间接作用，对免疫细胞的活化、增殖和分化发挥重要的调节作用。免疫抑制因子对预防和治疗移植排斥反应、自身免疫性疾病具有广阔的前景[1]。TLSFJM是一种由人急性T淋巴细胞白血病细胞分泌的免疫抑制因子(JM acute T leukemia cell line derived suppressor factor,TLSFJM)。本室以往的研究表明，TLSFJM在体外可抑制多克隆刺激剂(如PHA和TPA等)诱导的人T细胞活化、增殖，以及人混合淋巴细胞反应(MLR)中杀伤细胞的分化；在小鼠中，TLSFJM对ConA和IL-2联合诱导的小鼠胸腺细胞MHC非限制性杀伤细胞的分化也可产生明显抑制作用[2]。本文以小鼠MLR为模型，探讨了TLSFJM对同种异体抗原诱导的小鼠T细胞增殖、杀伤细胞的分化及效应功能的影响。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 RPM-I1640，HEPES，2-ME和PHA均购自Sigma公司；Na251CrO4购自英国Amersham公司；3H-TdR为上海原子能研究所产品；重组人IL-2由第二军医大学曹雪涛教授惠赠。
1.1.2 实验动物 Balb/c小鼠由本校动物中心提供，3周～8周龄;C57BL/6小鼠购自西安医科大学，6周～8周龄;均为雌性，体重18g～22g。
1.1.3 细胞株 人急性T淋巴细胞白血病细胞株JM和小鼠肥大细胞瘤细胞系P815，为本室传代培养。
1.2 方法
, 百拇医药 1.2.1 TLSFJM的制备 将10%NCSRPMI-1640培养JM细胞至对数生长期，用完全RPMI-1640培养基调整细胞数为1×109/L，于37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养48h。离心收获上清、分装，置-70℃保存。
1.2.2 TLSFJM活性的测定 无菌取3周～4周龄Balb/c小鼠胸腺，经120目不锈钢纱网研磨后制备细胞悬液，离心洗涤后调整细胞浓度为1×1010/L，加入96孔培养板中100μl/孔。再加入亚适剂量的PHA(3mg/L)，IL-2(5×104U/L)和不同浓度的TLSFJM100μl。培养48h后，掺入3H-TdR(1.85×104 Bq/孔)，继续培养8h～12h，用多头细胞收集仪将各组细胞收集到"49"型玻璃纤维纸上，远红外烤干后进行β液闪计数。以对胸腺细胞生长产生50%抑制率的JM培养上清的浓度确定为1个抑制单位，计算所用TLSFJM的活性。
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1.2.3 TLSFJM对T细胞增殖的影响 ①混合淋巴细胞反应(MLR)：按文献[3]建立小鼠MLR模型。无菌取Balb/c小鼠(H-2d)脾细胞，经60Co(3000Rad)照射后作为刺激细胞，用含10%NCS的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为2×109/L。取C57BL/6小鼠(H-2b)脾细胞作为反应细胞，调整细胞浓度为2×109/L。将两种细胞等体积混合培养。②TLSFJM对T细胞增殖的影响：MLR在96孔板中进行。于反应起始时，加入不同浓度的TLSFJM。37℃培养60h后掺入3H-TdR，继续培养12h收集细胞,液闪计数。
1.2.4 TLSFJM对CTL分化及功能的影响 ①TLSFJM对CTL分化的影响：在MLR起始时，加入不同浓度的TLSFJM，或在MLR进行的不同时间，加入相同浓度的TLSFJM，5天后，收获效应细胞检测其杀伤活性。②TLSFJM对杀伤相CTL杀伤功能的影响：在MLR的第5天收获效应细胞，在进行杀伤试验时加入不同浓度的TLSFJM，检测其对CTL杀伤活性的影响。③51Cr释放试验：依据文献[3]的方法，用4h51 Cr释放试验检测MLR中诱导的CTL杀伤活性。收获处于对数生长期的P815细胞(H-2d)作为靶细胞，调整细胞浓度为2×109/L。取0.5ml细胞悬液，加入3.7×106 Bq Na251CrO4,37℃孵育2h。洗涤后重悬至1×108/L，在U形板中每孔加入100μl标记细胞悬液。按照一定的效靶比例加入效应细胞，37℃孵育4h，收获上清(100 μl)，γ计数仪计数，并按下列公式计算杀伤率(%)。
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2 结果
2.1 TLSFJM对同种异体抗原诱导的T细胞增殖的抑制作用 将含不同浓度的TLSFJM培养上清与PHA/IL-2联合诱导的小鼠胸腺细胞培养48h后，用3H-TdR掺入法测定其抑制活性。本试验所用TLSFJM的抑制活性为8×106U/L。如图1所示,0.1%TLSFJM能明显抑制同种异体抗原诱导的T细胞的增殖反应。在MLR开始时，加入1%终浓度的TLSFJM，其对T细胞增殖的抑制率达82%，且呈剂量依赖关系。
图1 TLSFJM对同种异体抗原诱导的T细胞增殖的抑制作用
Fig1 The inhibitory effect of TLSFJM on alloantigen-induced T cell proliferation
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2.2 TLSFJM对同种异体抗原诱导的CTL分化的抑制作用 如图2a所示，在MLR开始时，加入1%的TLSFJM可明显抑制CTL的杀伤活性。当TLSFJM的终浓度低至0.01%时，仍有明显的抑制活性；在MLR的不同时间点加入相同浓度(5%)的TLSFJM，抑制CTL分化的程度有所不同，加入的时间愈早，抑制分化的效果愈明显(图2b)。
图2 TLSFJM于不同浓度和不同时间对同种异体抗原诱导的CTL分化及杀伤功能的影响
Fig2 The inhibitory effect of TLSFJM on alloantigen-induced differentiation and cytotoxicity of CTL at different con centrations and time points
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2.3 TLSFJM对已分化的CTL杀伤功能的影响 在MLR的第5天收取效应细胞，进行对靶细胞P815的杀伤试验。发现在杀伤相加入不同浓度的TLSFJM时，对CTL的杀伤功能未见有影响(图2c)。
3 讨论
人T细胞白血病细胞培养上清中所含抑制活性的细胞因子，能抑制造血细胞性肿瘤细胞的生长和有丝分裂原刺激的外周血单个核细胞增殖。来自不同细胞的TLSF对细胞的增殖和分化的抑制谱和抑制程度不尽相同。JM细胞系来源于急性淋巴细胞白血病患者，属于来自胸腺的不成熟T淋巴细胞。其培养上清亦含有TLSF，称为TLSFJM。本研究中发现，TLSFJM可抑制同种异体抗原诱导的小鼠CTL分化，与以往其抑制人MLR中CTL分化的研究结果的报道相一致，从而为进一步探讨TLSFJM在机体内的作用机理提供了有益的动物模型。
, 百拇医药
TLSFJM作为一种细胞因子，可能以多种方式直接或间接地调节免疫应答。TLSFJM对T细胞增殖和杀伤性T细胞的分化的强烈抑制作用，有助于阐明急性白血病患者免疫功能紊乱的机制。本室最近研究表明，TLSFJM不仅在小鼠体内可抑制DNFB诱发的变应原特异性炎症反应及小鼠皮片移植排斥反应[4],而且对幼鼠胸腺的发育也有一定程度的抑制，提示在胸腺细胞的个体发育过程中，这种抑制因子可能是不成熟胸腺细胞产生的一种负反馈调节因子。
在本实验中，TLSFJM一方面对同种异体抗原诱导的CD4+T细胞的增殖有明显地抑制作用，同时还可强烈抑制同种异体抗原诱导的CTL的分化。可见，TLSFJM对CD4+和CD8+T细胞均有抑制作用。目前，对CD8+T细胞和CD4+T细胞不同亚群(Th1/Th2,Tc1/Tc2)的平衡与漂移和生理、病理性免疫应答之间关系的研究正日趋深入[5]。TLSFJM是否参与了对Th1/Th2和Tc1/Tc2亚群的调节，以及以何种方式进行调节都值得深入探讨。
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总之，对TLSFJM免疫抑制机理的研究，不但给T细胞的免疫调节增加了新的内容，也为其在临床上的应用(如防治移植排斥反应)提供了实验依据。但目前对TLSFJM的研究还存在许多问题,如尚未阐明其分子的本质及其受体等。纯化该因子并测定其氨基酸序列，寻找其相应受体，探讨其在Th1/Th2和Tc1/Tc2调节中的作用，将是我们下一步工作的方向。
*国家自然科学基金资助项目，No.39270613
作者简介：韩卫宁，女，26岁，博士生。西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374531
参考文献
[1]夏海滨.免疫抑制因子的研究进展.国外医学免疫学分册，1991;14：311～312
[2]金伯泉，刘雪松.一株人急性淋巴细胞白血病所分泌的抑制因子的免疫调节作用.中华血液学杂志，1990;11：247～249
, http://www.100md.com
[3]Brown GR, Meek K, Nishioka Y,et al. CD27-CD27 ligand/CD70 interactions enhance alloantigen-induced proliferation and cytolytic activity in CD8+ T lymphocytes. J Immunol, 1995;154:3686～ 3695
[4]申立中，金伯泉，夏海滨，等.TLSFJM对DNFB诱导的小鼠接触性皮炎和同种异体皮片移植排斥反应的抑制作用.细胞与分子免疫学杂志，1996;12：27～31
[5]Mosmann TR, Li L, Sad S, et al.Functions of CD8 T-cell subsets secreting different cytokine patterns. Immunol,1997; 9:87～92
收稿：1998-10-22
修回：1998-11-09, 百拇医药
单位：第四军医大学免疫学教研室，西安，710032
关键词：抑制因子；CTL；分化
细胞与分子免疫学杂志990212摘 要：本文以小鼠混合淋巴细胞反应为模型，研究了JM急性T淋巴细胞白血病细胞分泌的抑制因子(TLSFJM)在体外对同种异体抗原诱导小鼠T细胞增殖和杀伤性T细胞分化的影响。结果表明：(1)TLSFJM可明显抑制同种异体抗原刺激的T细胞增殖，且具有剂量依赖性；(2)TLSFJM能有效地抑制同种异体抗原诱导的小鼠CTL分化；(3)TLSFJM对杀伤相CTL的杀伤活性没有抑制作用。
中国图书资料分类号：R392.11
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The effect of TLSFJM on alloantigen-induced differentiation and
cytotoxicity of mouse CTL
Han Weining, Li Demin, Su li, Ouyang Weiming, Jia wei, Jin Boquan
(Department of Immunology, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Keywords：suppressor factor CTL differentiation
Abstract：The effect of TLSFJM on alloantigen-induced differentiation and cytotoxicity of mouse CTL was investigated in vitro using mouse mixed lymphocyte reaction(MLR). The results showed that TLSFJM markedly suppressed alloantigen-induced proliferation of T cells (82% of inhibition when 1% concentration of TLSFJM was added) and differentiation of CTL in a dose-dependent manner but have no influence on the cyctotoxicity of CTL when TLSFJM was added in cytolytic phage.
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免疫抑制因子是机体免疫系统的一类重要免疫调节分子。各种不同的免疫抑制因子通过直接或间接作用，对免疫细胞的活化、增殖和分化发挥重要的调节作用。免疫抑制因子对预防和治疗移植排斥反应、自身免疫性疾病具有广阔的前景[1]。TLSFJM是一种由人急性T淋巴细胞白血病细胞分泌的免疫抑制因子(JM acute T leukemia cell line derived suppressor factor,TLSFJM)。本室以往的研究表明，TLSFJM在体外可抑制多克隆刺激剂(如PHA和TPA等)诱导的人T细胞活化、增殖，以及人混合淋巴细胞反应(MLR)中杀伤细胞的分化；在小鼠中，TLSFJM对ConA和IL-2联合诱导的小鼠胸腺细胞MHC非限制性杀伤细胞的分化也可产生明显抑制作用[2]。本文以小鼠MLR为模型，探讨了TLSFJM对同种异体抗原诱导的小鼠T细胞增殖、杀伤细胞的分化及效应功能的影响。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 RPM-I1640，HEPES，2-ME和PHA均购自Sigma公司；Na251CrO4购自英国Amersham公司；3H-TdR为上海原子能研究所产品；重组人IL-2由第二军医大学曹雪涛教授惠赠。
1.1.2 实验动物 Balb/c小鼠由本校动物中心提供，3周～8周龄;C57BL/6小鼠购自西安医科大学，6周～8周龄;均为雌性，体重18g～22g。
1.1.3 细胞株 人急性T淋巴细胞白血病细胞株JM和小鼠肥大细胞瘤细胞系P815，为本室传代培养。
1.2 方法
, 百拇医药 1.2.1 TLSFJM的制备 将10%NCSRPMI-1640培养JM细胞至对数生长期，用完全RPMI-1640培养基调整细胞数为1×109/L，于37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养48h。离心收获上清、分装，置-70℃保存。
1.2.2 TLSFJM活性的测定 无菌取3周～4周龄Balb/c小鼠胸腺，经120目不锈钢纱网研磨后制备细胞悬液，离心洗涤后调整细胞浓度为1×1010/L，加入96孔培养板中100μl/孔。再加入亚适剂量的PHA(3mg/L)，IL-2(5×104U/L)和不同浓度的TLSFJM100μl。培养48h后，掺入3H-TdR(1.85×104 Bq/孔)，继续培养8h～12h，用多头细胞收集仪将各组细胞收集到"49"型玻璃纤维纸上，远红外烤干后进行β液闪计数。以对胸腺细胞生长产生50%抑制率的JM培养上清的浓度确定为1个抑制单位，计算所用TLSFJM的活性。
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1.2.3 TLSFJM对T细胞增殖的影响 ①混合淋巴细胞反应(MLR)：按文献[3]建立小鼠MLR模型。无菌取Balb/c小鼠(H-2d)脾细胞，经60Co(3000Rad)照射后作为刺激细胞，用含10%NCS的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为2×109/L。取C57BL/6小鼠(H-2b)脾细胞作为反应细胞，调整细胞浓度为2×109/L。将两种细胞等体积混合培养。②TLSFJM对T细胞增殖的影响：MLR在96孔板中进行。于反应起始时，加入不同浓度的TLSFJM。37℃培养60h后掺入3H-TdR，继续培养12h收集细胞,液闪计数。
1.2.4 TLSFJM对CTL分化及功能的影响 ①TLSFJM对CTL分化的影响：在MLR起始时，加入不同浓度的TLSFJM，或在MLR进行的不同时间，加入相同浓度的TLSFJM，5天后，收获效应细胞检测其杀伤活性。②TLSFJM对杀伤相CTL杀伤功能的影响：在MLR的第5天收获效应细胞，在进行杀伤试验时加入不同浓度的TLSFJM，检测其对CTL杀伤活性的影响。③51Cr释放试验：依据文献[3]的方法，用4h51 Cr释放试验检测MLR中诱导的CTL杀伤活性。收获处于对数生长期的P815细胞(H-2d)作为靶细胞，调整细胞浓度为2×109/L。取0.5ml细胞悬液，加入3.7×106 Bq Na251CrO4,37℃孵育2h。洗涤后重悬至1×108/L，在U形板中每孔加入100μl标记细胞悬液。按照一定的效靶比例加入效应细胞，37℃孵育4h，收获上清(100 μl)，γ计数仪计数，并按下列公式计算杀伤率(%)。
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2 结果
2.1 TLSFJM对同种异体抗原诱导的T细胞增殖的抑制作用 将含不同浓度的TLSFJM培养上清与PHA/IL-2联合诱导的小鼠胸腺细胞培养48h后，用3H-TdR掺入法测定其抑制活性。本试验所用TLSFJM的抑制活性为8×106U/L。如图1所示,0.1%TLSFJM能明显抑制同种异体抗原诱导的T细胞的增殖反应。在MLR开始时，加入1%终浓度的TLSFJM，其对T细胞增殖的抑制率达82%，且呈剂量依赖关系。
图1 TLSFJM对同种异体抗原诱导的T细胞增殖的抑制作用
Fig1 The inhibitory effect of TLSFJM on alloantigen-induced T cell proliferation
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2.2 TLSFJM对同种异体抗原诱导的CTL分化的抑制作用 如图2a所示，在MLR开始时，加入1%的TLSFJM可明显抑制CTL的杀伤活性。当TLSFJM的终浓度低至0.01%时，仍有明显的抑制活性；在MLR的不同时间点加入相同浓度(5%)的TLSFJM，抑制CTL分化的程度有所不同，加入的时间愈早，抑制分化的效果愈明显(图2b)。
图2 TLSFJM于不同浓度和不同时间对同种异体抗原诱导的CTL分化及杀伤功能的影响
Fig2 The inhibitory effect of TLSFJM on alloantigen-induced differentiation and cytotoxicity of CTL at different con centrations and time points
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2.3 TLSFJM对已分化的CTL杀伤功能的影响 在MLR的第5天收取效应细胞，进行对靶细胞P815的杀伤试验。发现在杀伤相加入不同浓度的TLSFJM时，对CTL的杀伤功能未见有影响(图2c)。
3 讨论
人T细胞白血病细胞培养上清中所含抑制活性的细胞因子，能抑制造血细胞性肿瘤细胞的生长和有丝分裂原刺激的外周血单个核细胞增殖。来自不同细胞的TLSF对细胞的增殖和分化的抑制谱和抑制程度不尽相同。JM细胞系来源于急性淋巴细胞白血病患者，属于来自胸腺的不成熟T淋巴细胞。其培养上清亦含有TLSF，称为TLSFJM。本研究中发现，TLSFJM可抑制同种异体抗原诱导的小鼠CTL分化，与以往其抑制人MLR中CTL分化的研究结果的报道相一致，从而为进一步探讨TLSFJM在机体内的作用机理提供了有益的动物模型。
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TLSFJM作为一种细胞因子，可能以多种方式直接或间接地调节免疫应答。TLSFJM对T细胞增殖和杀伤性T细胞的分化的强烈抑制作用，有助于阐明急性白血病患者免疫功能紊乱的机制。本室最近研究表明，TLSFJM不仅在小鼠体内可抑制DNFB诱发的变应原特异性炎症反应及小鼠皮片移植排斥反应[4],而且对幼鼠胸腺的发育也有一定程度的抑制，提示在胸腺细胞的个体发育过程中，这种抑制因子可能是不成熟胸腺细胞产生的一种负反馈调节因子。
在本实验中，TLSFJM一方面对同种异体抗原诱导的CD4+T细胞的增殖有明显地抑制作用，同时还可强烈抑制同种异体抗原诱导的CTL的分化。可见，TLSFJM对CD4+和CD8+T细胞均有抑制作用。目前，对CD8+T细胞和CD4+T细胞不同亚群(Th1/Th2,Tc1/Tc2)的平衡与漂移和生理、病理性免疫应答之间关系的研究正日趋深入[5]。TLSFJM是否参与了对Th1/Th2和Tc1/Tc2亚群的调节，以及以何种方式进行调节都值得深入探讨。
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总之，对TLSFJM免疫抑制机理的研究，不但给T细胞的免疫调节增加了新的内容，也为其在临床上的应用(如防治移植排斥反应)提供了实验依据。但目前对TLSFJM的研究还存在许多问题,如尚未阐明其分子的本质及其受体等。纯化该因子并测定其氨基酸序列，寻找其相应受体，探讨其在Th1/Th2和Tc1/Tc2调节中的作用，将是我们下一步工作的方向。
*国家自然科学基金资助项目，No.39270613
作者简介：韩卫宁，女，26岁，博士生。西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374531
参考文献
[1]夏海滨.免疫抑制因子的研究进展.国外医学免疫学分册，1991;14：311～312
[2]金伯泉，刘雪松.一株人急性淋巴细胞白血病所分泌的抑制因子的免疫调节作用.中华血液学杂志，1990;11：247～249
, http://www.100md.com
[3]Brown GR, Meek K, Nishioka Y,et al. CD27-CD27 ligand/CD70 interactions enhance alloantigen-induced proliferation and cytolytic activity in CD8+ T lymphocytes. J Immunol, 1995;154:3686～ 3695
[4]申立中，金伯泉，夏海滨，等.TLSFJM对DNFB诱导的小鼠接触性皮炎和同种异体皮片移植排斥反应的抑制作用.细胞与分子免疫学杂志，1996;12：27～31
[5]Mosmann TR, Li L, Sad S, et al.Functions of CD8 T-cell subsets secreting different cytokine patterns. Immunol,1997; 9:87～92
收稿：1998-10-22
修回：1998-11-09, 百拇医药