信号分子PLCγ－2PH结构域与PKC的结合*
作者：季少平 药立波 白玉杰 范金水 王吉村 苏成芝
单位：第四军医大学生物化学与分子生物学教研室,西安，710032
关键词：信号转导；PLCγ-2；Btk；PH结构域；PKC；Westernblot
New Page 3摘 要：目的：从大鼠脾脏克隆信号分子PLCγ-2氨基端PH结构域基因，并进行GST融合表达。检测信号分子PLCγ-2氨基端PH结构域与PKC的结合，为进一步研究其在信号转导中所介导的功能、寻找其新配基奠定基础。方法:采用异硫氰酸胍变性和酚氯仿抽提的方法，从大鼠新鲜脾组织中提取总RNA，紫外线定量后，反转录合成cDNA，以PCR扩增目的基因片段，双酶切后定向克隆到载体pUC19中。将引物末端用同位素([r-32p]ATP)标记后，以双脱氧终止法测序；再将基因片段定向克隆到表达载体pGEX-4T-1中。以IPTG在低温条件下(26℃)诱导1h,进行GST融合表达。用agarosebeads“锚定”,并纯化表达的GST-PH融合蛋白。将Jurkat细胞的裂解液与上述纯化的融合蛋白共孵育，以Westernblot检测PH结构域与PKC的结合。结果:信号分子PLCγ-2的PH结构域基因完全正确，内部不含终止码，为一开放读框。在表达载体pGEX-4T-1中得到融合表达，表达产物为可溶性的。Westernblot检测到PH结构域与PKC的结合。结论：从组织细胞中克隆PH结构域基因的方法是可行的，并可在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达，于26℃条件下诱导表达的蛋白大部分为可溶性蛋白质。在体外，Btk及PLCγ-2的PH结构域可与PKC结合。
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中国图书资料分类号：Q71
Binding of PH domain of signaling molecule PLCγ-2 to PKC
Ji Shaoping, Yao Libo, Bai Yujie, Fan Jingshui Wang Jicun Su Chengzhi
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, the Fourth Military Medical University ,Xi'an 710032)
Keywords：signaling transduction PLCγ-2 Btk PH domain PKC Western blot
Abstract：Aim: To screen for novel ligands of PLCγ-2 PH domain, to investigate function of the PH domain in signal transduction processes and to examine binding of the PH domain to PKC, rat spleen was employed to clone gene of the PH domain. Method: Total RNA molecules were isolated and purified from fresh spleen and mRNAs were reversely transcribed into cDNAs. After PCR the fragments of DNA were cloned into vector pUC19. The dideoxy termination sequencing was employed to sequence with labeled primers. The fragments of DNA was subsequently cloned into pGEX-4T-1 and the PH domain was expressed in fusion protein with GST with inducement by IPTG at 26℃ for 1 hour. The fusion protein was purified and anchored at agarose beads. The purified fusion protein was incubated with the lysate of Jurkat cells at 4℃ for 2 hour with occasional gentle vibration. After SDS-PAGE, the protein was transferred to PVDF membrane. The protein detection reagents of ECL were employed to detect binding of the PH domain to PKC. Results: The sequence of the gene encoding for the PH domain was correct.The PH domains were rightly expressed in E.coli JM109 in fusion protein with GST. Molecular mass of the protein bands detected by western blot in both PLCγ-2 PH domain and Btk PH domain lanes were in accord with that of PKC(about 76 kd) and no corresponding protein band was detected in GST lane. Conclusion: The method of cloning PH domain gene are feasible in studies on signal transduction processes. The PH domains of PLCγ-2 N-terminal and Btk PH domain can bind to PKC in vitro though function of the association remained unknown.
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多细胞生物的细胞表面多有接受外界信号的受体。有关这些受体及其所介导的信号途径，研究得最为广泛且了解得最清楚的是与G-蛋白偶联的7次跨膜受体。当G-蛋白活化时，一方面激活腺苷酸环化酶产生cAMP作为第2信使，此外还可激活磷脂酶C(PLC)，继而分解膜磷脂产生其它信使。而PLC又可分为4型，即β，γ，δ和ε，各型具有不同的功能，可介导不同的信号转导途径(各型又可分为不同亚型)。G-蛋白活化后，其α和βγ亚基均可激活PLCβ，继而分解膜磷脂产生肌醇三磷酸(IP3)和二酰基甘油(DG)。二者均可作为第2信使在细胞内发挥作用,但G-蛋白不能激活PLCγ[1]。研究表明，PLCγ-2除有磷脂酶催化区域外，分子的羧基端和氨基端各有1个PH结构域，这两个PH结构域在PLCγ-2的功能发挥中起什么样的作用尚不明了。最近，Bae等[2]发现，磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)可通过与PLCγ的SH2结构域结合而激活PLCγ，而磷脂酰肌醇类又可作为PH结构域的一类配基。PLCγ的PH结构域在PIP3对PLCγ的激活中是否起作用尚待研究。
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除上述外，细胞内部信号转导还有其它途径。尤其是以蛋白质磷酸化为特征的一系列信号转导过程，因与基因的表达调控有关，涉及到细胞的许多病理生理过程，因而引起人们的重视。不同的信号分子之间相互识别、准确无误地传递信号，既依赖于信号分子所具有的激酶区(催化靶分子磷酸化)，更有赖于各信号分子特定的相互识别与结合部位(结构域)。这些结构域在网络性信号传导中，起着“网络接头”的作用，可使特定的信号分子发生磷酸化。目前,可将这些识别与结合部位主要分为3类，即：src homology 2(SH2)结构域、src homology 3(SH3)结构域和pleckstrin homology(PH)结构域[3]。其中PH结构域为1993年才被发现的，它们约由120个氨基酸构成，相互间一级序列的同源性不高(约20%)，但却有着十分相似的空间结构(拓扑结构一致)。目前认为，PH结构域在信号转导中发挥的主要作用是介导信号分子本身与脂质的结合，以利于信号分子在质膜定位[4]。此外，该结构域还能与G-蛋白的βγ亚基结合[5]，但所介导的功能不详。最近，又发现Btk的PH结构域可与PKC结合[6]，是否其它PH结构域也可与PKC结合仍不清楚。PKC作为一种第二信使依赖的蛋白激酶，在细胞内信号转导过程中常常发挥着核心作用[7]。此外，PKC介导的信号传递还涉及到细胞的增殖、分化和调亡等。
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目前，对于PH结构域的其它配基及其它功能尚不清楚。因PH结构域的空间结构的差异，有人预测不同的PH结构域都有各自不同的配基。推测正是由于这些结构域的介导，才决定了象PLCγ-2这样的分子的定位及特定功能的发挥，在信号传递过程中发挥着特定作用。但对于其中PH结构域如何与配基结合、如何发挥作用，目前还不清楚。我们从组织细胞中，克隆并表达了这种信号分子的一个PH结构域，检测了它们与PKC的结合情况，目的在于进一步寻找其新的配基，探讨其所介导的信号转导功能。
1 材料和方法
1.1 引物设计 在计算机软件Pegene和Oligo的辅助下设计引物，PH结构域的引物序列为：5′CTGGATCCGTGGACACCCTTCCAGAA3′；5′GGAATTCTCATGCGTTCATCGCTTCCTG3′。其中5′端引物引入BamH1的酶切位点；3′端引物引入EcoR1的酶切位点及终止码。
1.2 目的基因片段cDNA的获得 采用略作调整的一步法,从大鼠的新鲜组织中提取总RNA[7]。定量后，按反转录试剂盒(购自Promega公司)中说明书的方法，将mRNA反转录合成cDNA。
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1.3 目的基因片段的扩增与克隆 在100μl反应体系中，含有10×PCR缓冲液10μl,5′端引物和3′端引物各100pmol，cDNA0.4μg,4×dNTP各0.2mmol/L,MgCl2 2.0mmol/L。95℃预变性2min后,加入Taq DNA聚合酶(Promega公司)4μ。按94℃ 40 s,55℃ 40 s,72℃ 60 s进行35个循环，另在72℃延伸120s。其产物经1.2%agarose gel电泳，可见有大小相近的目的基因片段得以扩增。切下琼脂糖凝胶中的目的基因条带，以glassmilk试剂盒(购自Clontech公司)回收片段，以BamH I+EcoR I(深圳晶美公司产品)双酶切目的片段后，定向插入同样双酶切的pUC19载体中，以T4DNA连接酶连接(16℃，16h)。将重组后的pUC19转化处于感受态的E.coli JM109菌株，铺于含有X-gal和IPTG的平皿，做蓝白筛选。过夜培养后，钓取白色菌落，扩大培养、提取质粒,以BamH I+EcoR I双酶切鉴定,切下与预期基因片段大小相近的片段。
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1.4 序列测定以 [r-32p]ATP将引物末端标记。按T7 DNA Polymerase sequencing kit(Promega公司)操作说明书的方法操作，采用双脱氧终止法测定序列。电泳后，将凝胶吹干，做放射自显影。
1.5 目的基因片段与GST的融合表达 将测序后的重组载体以BamH I+EcoR I消化，切下的片段再与此两种酶切后的pGEX-4T-1载体定向连接，然后导入感受态的E.coliJM109菌株，铺于平皿。过夜培养后，筛选鉴定阳性克隆，于含氨苄青霉素(0.1g/L)的LB培养基中培养过夜。取5ml转种于500ml含0.1g/L氨苄青霉素和1%葡萄糖的LB培养基中，继续培养约3h(A600≈0.3)后，取出，置室温约40min(使培养液降至室温，低于26℃)，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，于26℃继续培养1h。取1ml的培养液离心(5000r/min)2min(剩余细菌按同样方法收菌后备用)。加入2×蛋白上样缓冲液(含100mmol/LTris-ClpH6.8,200 mmol/L二硫苏糖醇，4%SDS，0.2%溴酚蓝及20%甘油)50μl，混匀。煮沸(5min)，离心(10000 r/min,10 min),取上清做SDSPAGE。
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1.6 工程菌的裂解及表达蛋白的可溶性鉴定 实验分无载体工程菌组、GST阴性对照组、GST-PLCγ-2PH结构域组和GST-BtkPH结构域阳性对照组[15]。将约500ml培养液收获的工程菌沉淀重悬于5ml冰冷的STE(10mmol/L Tris,150mmol/L NaCl,1.0mmol/L EDTA,0.1g/L溶菌酶及1.0mmol/L苯*****)中，冰浴15min。加入DTT至终浓度为5mmol/L，十二烷基肌氨酸钠至终浓度为1.5%,冰浴至溶液变得粘稠(约2min)。以超声波破碎细胞(输出功率40，4℃,2×1min),离心(12,000r/min,4℃，20min)。取上清加入2%的Triton-X100,混匀后，以0.45μm滤膜过滤，加入0.02%的NaN3，存于4℃备用。分别取50μl上清和全部沉淀(沉淀约占总体积的1%～2%)，加入2×蛋白上样缓冲液50μl，按上述方法做SDS-PAGE。
1.7 Jurkat细胞的培养及裂解 将人T细胞白血病细胞系Jurkat接种于RPMI-1640培养基(含10%的胎牛血清)中，于37℃、5%CO2条件下培养。离心(1000r/min，室温，1min)，收集细胞沉积(约5×107)，-70℃冻存。应用时，于4℃下解冻，加入2mlNP-40细胞裂解液(1%NP-40，20mmol/LTris-Cl,pH8.0,150mmol/LNaCl,0.02%NaN3,100mmol/LCaCl2,用前加入0.0017%aprotinin,1.0mmol/LPMSF)剧烈震荡(4℃，2×1.0min)。离心(14000g,4℃,10min)，取上清于4℃存放备用。
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1.8 表达蛋白的纯化及浓度调整 取8 mg agarose beads(Sigma公司产品)加水1ml,4℃,1h(使小珠子全部泡涨)，离心(2000g,4℃ 3 min)，加入1mlPBS,重复离心，共3次。将agarosebeads重悬于1mlPBS(含1%的TritonX100和0.01%NaN3)中。取0.1ml处理后的agarose beads，加入1ml经1.6处理的工程菌上清(不包括无载体工程菌组)，4℃孵育60min(不时轻轻摇动，以利于GST与agarose beads结合)。离心(2000g,4℃,3min)，加入1ml PBST(含0.05%Tween-20的PBS)，重复离心，共3次(每次弃去上清的90%，以免丢失沉淀的agarose beads)，沉淀重悬于含0.02%NaN3的PBST中。通过SDS-PAGE,调整各组蛋白的浓度(以电泳后蛋白条带的粗细为参照，用无载体工程菌上清作为稀释液)，使之接近一致，以免非特异结合造成的差异。
1.9 表达融合蛋白与PKC的结合 取按1.8处理的agarose beads混悬液0.1ml(各组的agarose beads已结合约等量的表达蛋白)，加入经1.7处理的Jurkat细胞上清0.5ml,4℃孵育60min(不时轻轻摇动，以利于可与PH结构域结合的蛋白与之结合)，离心(2000g,4℃,3min)，取沉淀，加入1mlNP40缓冲液(不含aprotinin，PMSF和CaCl2),重复离心，共5次(小心吸去上清，不能丢失沉淀)。
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1.10 Westernblot鉴定PH结构域与PKC的结合 将1.9所得沉淀重悬于30μ lNP-40缓冲液中,加入5×蛋白上样缓冲液，常规做SDS-PAGE。取下聚丙稀酰胺凝胶，用甲醇浸泡固定PVDF(polyvinylidene difluoride)膜，于冰浴条件下转移(100V，3h)。以PBST洗去PVDF膜上残留的转移缓冲液，用含5%明胶的PBST封闭后，浸泡PVDF膜，37℃，轻摇1h。取PVDF膜及1μg兔抗鼠PKCβ1抗体(溶于1.5mlPBS中)封入小塑料袋中，4℃过夜。用20mlPBST漂洗PVDF膜(37℃，轻轻摇动)，共3次(1×15min，2×5min)。再将PVDF膜及1μg羊抗兔抗体(溶于1.5mlPBS)，封入小塑料袋中，37℃，轻摇1.5h。同上以PBST20ml漂洗PVDF膜，共5次(1×15min，4×5min)。用滤纸吸干多余的PBST。取Westernblot检测试剂盒ECL(为Amersham公司的化学发光试剂)中1号液及2号液各1ml，混匀，立即投入PVDF膜，反应1min后，滤纸吸干多余的反应液，于暗室条件下压上X-光片，感光10min。
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2 结果
2.1 PLCγ-2PH结构域基因片段的扩增及鉴定 于PH结构域基因的5′端和3′端各设计1条引物，以PCR扩增PH结构域基因，得到1条长约400bp的基因片段(图1，见第Ⅳ页)与预期的PH结构域基因(应为408bp)大小相一致。
图1 PCR扩增的PH结构域基因片段的琼脂糖凝胶电泳鉴定
Fig1 Identification of the amplified PH domain gene by 1.2 % agarose gel electrophoresis
1: pGEM 7zf(+)/Hae Ⅲ marker; 2 and 3: Amplification of the PH domain gene from the cDNA; 4: Negative control without cDNA
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2.2 PLCγ-2PH结构域基因片段的克隆与鉴定 将上述扩增的目的片段分别用BamHI和EcoRI消化后，定向插入pUC19载体中，构建出两种重组质粒，再提取质粒经上述两种酶消化后，得到大小约400bp(酶切后应为399bp)的插入片段(图2，见第Ⅳ页)。
图2 重组质粒的双酶切鉴定
Fig2 Identification of the recombinant plasmids digested with BamH 1 and EcoR 1 in 1.2 % agarose gel electrophoresis
1: Positive clone; 2: Negative clone; 3: The marker fragments are 657,458， 434,328 and 289 bp in length, from top to bottom
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2.3 PLCγ-2PH结构域基因片段的序列测定 用末端终止法，测定了PLCγ-2氨基端的PH结构域基因片段的全部核苷酸序列(图3，见第Ⅳ页)。PH结构域基因片段的全长为399bp,编码133个氨基酸。编码的氨基酸序列与文献报道的序列相一致。序列两端的PCR引物及酶切位点正确，序列内部不含终止码，为一开放读框。
图3 PLCγ-2 PH结构域cDNA的末端终止法测序
Fig3 Sequencing of PLCγ-2 PH domain cDNA
2.4 PLCγ-2的PH结构域与GST的融合表达 插入表达载体pGEX-4T-1中的PH结构基因，经IPTG的诱导得到表达(图4，见第Ⅳ页)。图4显示，未经诱导的重组载体无明显目的蛋白的表达，经诱导后得到的表达蛋白的相对分子质量(Mr)约为4×104 (PLCγ-2的PH结构域与GST融合后的Mr实为4.063×104，与预期的分子大小相一致。
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图4 PLCγ-2 PH结构域的诱导表达
Fig4 Expression of GST─PLCγ-2 PH domain
1: The protein markers are 97 400, 66 200, 43 000,31 000, 21 100 and 14 400, from top to bottom; 2: Expression of GST-PLCγ-2 PH domain induced at 26℃ for 1h; 3: Negative control; 4: Expression of GST
2.5 表达蛋白溶解状态的鉴定 将诱导培养后的工程菌重悬，以超声波破碎法裂解，取全部沉淀(约50μl)及50μl上清。变性后，各取15μl上样，做SDS-PAGE。结果表明，上清和沉淀中均有粗细相近的新生蛋白条带(图5，见第Ⅳ页)。因沉淀物的体积仅占总体积的约2%，故所表达的目的蛋白的大部分是可溶性的，占目的蛋白总量的95%以上。
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图5 表达蛋白溶解状态的鉴定
Fig5 Identification of lytic state of expression protein
1: Precipitate of the lysate; 2:Supernatant of the lysate; 3: Protein markers are 97 400, 66 200, 43 000,31 000, 21 100 and 14 400, from top to bottom; 4: Total protein from bacteria lysate
2.6 表达蛋白的纯化及Westernblot分析 表达的融合蛋白用agarose beads纯化后，经SDS-PAGE表明，已得到较高纯度的蛋白(图6A，见第Ⅳ页)。Western blot结果显示，PLCγ-2PH结构域同BtkPH结构域一样，在其泳道中检测到有PKC的存在；而单纯的GST泳道未检测到PKC的存在(图6B，见第Ⅳ页)，表明PLCγ-2PH结构域在体外可与PKC结合。
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图6 表达蛋白的纯化(A)和Western blot检测表达蛋白与PKC的结合(B)
Fig6 Purification of the expressed protein(A) and assay of binding of expression protein to PKC(B)
(A) 1: Purified PLCγ-2 PH domain-GST; 2: Purified Btk PH domain-GST; 3: Purified GST; (B)1: Binding of PLCγ-2 PH domain-GST to PKC; 2:Binding of Btk PH domain-GST to PKC; 3: Binding of GST to PKC; 4: Lysate of Jurkat cells
3 讨论
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细胞间的相互协调是多细胞生物体生存的基本条件。单细胞生物不仅需要与外界进行物质交流，而且需与外界进行信息交流。各种外界信号到达细胞后如何引起细胞的生理、病理改变逐渐引起人们的重视。大多数细胞外信号分子并不能直接透过细胞膜，需要通过细胞膜表面的受体转导才能传导到细胞内。跨膜后的信号在细胞内的传递过程因信号种类不同而异。信号传递过程及其方式的变化可影响到细胞的生长、发育、凋亡，以及肿瘤细胞的发生和发展。
随着分子生物学的快速发展，对细胞内信号传递过程的认识显得更为迫切和重要。但由于信号分子大多在细胞内部含量低、直接检测困难，而纯化信号蛋白的PH结构域更为困难。目前已知大多数信号分子的PH结构域具有相对独立的空间结构。有资料表明，几种独立的PH结构域仍能与相应配基结合[9]。我们应用基因工程的方法，从新鲜组织中克隆了信号分子PLCγ-2的PH结构域基因，并得以在大肠杆菌中与GST融合表达，为对其进一步纯化及功能研究提供了条件。以上结果表明，我们所用克隆表达PH结构域基因的方法是可行的。
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PLC在磷脂酰肌醇的信号通路中发挥着重要的作用。同PKC一样，激活后都会在胞浆内移位[10]，这一现象往往与该分子本身特定的结合结构域有关。研究表明，PLC和PKC都存在一个称为C2的同源区，该结构域可能参与了PLC和PKC的移位。对于PLC来说，其分子中的其它结构域也可能参与该分子的移位，其中可能涉及到PH结构域。PKC作为一类丝氨酸/苏氨酸激酶，在一系列以蛋白磷酸化为特征的信号转导过程中具有重要的作用，因激活的PKC可催化PLCγ分子中的丝氨酸磷酸化[11]。我们的研究结果表明，PLCγ-2的PH结构域与GST的融合蛋白在体外可与PKC结合，而单纯的GST却不能与PKC结合。推测若PH结构域在体内也能与PKC结合，那么在PKC对PLCγ的催化过程中，PLCγ-2的PH结构域可能起着识别与“接合”(adapt)PKC的作用。当然PLCγ-2还存在着其它结构域，是否可与PKC结合尚不清楚。另外，PLCγ-2的PH结构域对PKC活性的影响，以及二者结合的生理作用也正在进一步研究之中。
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*国家自然科学基金资助项目，No.3974002
作者简介：季少平，男，35岁，讲师，博士生。西安市长乐西路17号，Tel(029)3374516
参考文献
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收稿：1998-06-25
修回：1998-10-22, 百拇医药
单位：第四军医大学生物化学与分子生物学教研室,西安，710032
关键词：信号转导；PLCγ-2；Btk；PH结构域；PKC；Westernblot
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Binding of PH domain of signaling molecule PLCγ-2 to PKC
Ji Shaoping, Yao Libo, Bai Yujie, Fan Jingshui Wang Jicun Su Chengzhi
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, the Fourth Military Medical University ,Xi'an 710032)
Keywords：signaling transduction PLCγ-2 Btk PH domain PKC Western blot
Abstract：Aim: To screen for novel ligands of PLCγ-2 PH domain, to investigate function of the PH domain in signal transduction processes and to examine binding of the PH domain to PKC, rat spleen was employed to clone gene of the PH domain. Method: Total RNA molecules were isolated and purified from fresh spleen and mRNAs were reversely transcribed into cDNAs. After PCR the fragments of DNA were cloned into vector pUC19. The dideoxy termination sequencing was employed to sequence with labeled primers. The fragments of DNA was subsequently cloned into pGEX-4T-1 and the PH domain was expressed in fusion protein with GST with inducement by IPTG at 26℃ for 1 hour. The fusion protein was purified and anchored at agarose beads. The purified fusion protein was incubated with the lysate of Jurkat cells at 4℃ for 2 hour with occasional gentle vibration. After SDS-PAGE, the protein was transferred to PVDF membrane. The protein detection reagents of ECL were employed to detect binding of the PH domain to PKC. Results: The sequence of the gene encoding for the PH domain was correct.The PH domains were rightly expressed in E.coli JM109 in fusion protein with GST. Molecular mass of the protein bands detected by western blot in both PLCγ-2 PH domain and Btk PH domain lanes were in accord with that of PKC(about 76 kd) and no corresponding protein band was detected in GST lane. Conclusion: The method of cloning PH domain gene are feasible in studies on signal transduction processes. The PH domains of PLCγ-2 N-terminal and Btk PH domain can bind to PKC in vitro though function of the association remained unknown.
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多细胞生物的细胞表面多有接受外界信号的受体。有关这些受体及其所介导的信号途径，研究得最为广泛且了解得最清楚的是与G-蛋白偶联的7次跨膜受体。当G-蛋白活化时，一方面激活腺苷酸环化酶产生cAMP作为第2信使，此外还可激活磷脂酶C(PLC)，继而分解膜磷脂产生其它信使。而PLC又可分为4型，即β，γ，δ和ε，各型具有不同的功能，可介导不同的信号转导途径(各型又可分为不同亚型)。G-蛋白活化后，其α和βγ亚基均可激活PLCβ，继而分解膜磷脂产生肌醇三磷酸(IP3)和二酰基甘油(DG)。二者均可作为第2信使在细胞内发挥作用,但G-蛋白不能激活PLCγ[1]。研究表明，PLCγ-2除有磷脂酶催化区域外，分子的羧基端和氨基端各有1个PH结构域，这两个PH结构域在PLCγ-2的功能发挥中起什么样的作用尚不明了。最近，Bae等[2]发现，磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)可通过与PLCγ的SH2结构域结合而激活PLCγ，而磷脂酰肌醇类又可作为PH结构域的一类配基。PLCγ的PH结构域在PIP3对PLCγ的激活中是否起作用尚待研究。
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除上述外，细胞内部信号转导还有其它途径。尤其是以蛋白质磷酸化为特征的一系列信号转导过程，因与基因的表达调控有关，涉及到细胞的许多病理生理过程，因而引起人们的重视。不同的信号分子之间相互识别、准确无误地传递信号，既依赖于信号分子所具有的激酶区(催化靶分子磷酸化)，更有赖于各信号分子特定的相互识别与结合部位(结构域)。这些结构域在网络性信号传导中，起着“网络接头”的作用，可使特定的信号分子发生磷酸化。目前,可将这些识别与结合部位主要分为3类，即：src homology 2(SH2)结构域、src homology 3(SH3)结构域和pleckstrin homology(PH)结构域[3]。其中PH结构域为1993年才被发现的，它们约由120个氨基酸构成，相互间一级序列的同源性不高(约20%)，但却有着十分相似的空间结构(拓扑结构一致)。目前认为，PH结构域在信号转导中发挥的主要作用是介导信号分子本身与脂质的结合，以利于信号分子在质膜定位[4]。此外，该结构域还能与G-蛋白的βγ亚基结合[5]，但所介导的功能不详。最近，又发现Btk的PH结构域可与PKC结合[6]，是否其它PH结构域也可与PKC结合仍不清楚。PKC作为一种第二信使依赖的蛋白激酶，在细胞内信号转导过程中常常发挥着核心作用[7]。此外，PKC介导的信号传递还涉及到细胞的增殖、分化和调亡等。
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目前，对于PH结构域的其它配基及其它功能尚不清楚。因PH结构域的空间结构的差异，有人预测不同的PH结构域都有各自不同的配基。推测正是由于这些结构域的介导，才决定了象PLCγ-2这样的分子的定位及特定功能的发挥，在信号传递过程中发挥着特定作用。但对于其中PH结构域如何与配基结合、如何发挥作用，目前还不清楚。我们从组织细胞中，克隆并表达了这种信号分子的一个PH结构域，检测了它们与PKC的结合情况，目的在于进一步寻找其新的配基，探讨其所介导的信号转导功能。
1 材料和方法
1.1 引物设计 在计算机软件Pegene和Oligo的辅助下设计引物，PH结构域的引物序列为：5′CTGGATCCGTGGACACCCTTCCAGAA3′；5′GGAATTCTCATGCGTTCATCGCTTCCTG3′。其中5′端引物引入BamH1的酶切位点；3′端引物引入EcoR1的酶切位点及终止码。
1.2 目的基因片段cDNA的获得 采用略作调整的一步法,从大鼠的新鲜组织中提取总RNA[7]。定量后，按反转录试剂盒(购自Promega公司)中说明书的方法，将mRNA反转录合成cDNA。
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1.3 目的基因片段的扩增与克隆 在100μl反应体系中，含有10×PCR缓冲液10μl,5′端引物和3′端引物各100pmol，cDNA0.4μg,4×dNTP各0.2mmol/L,MgCl2 2.0mmol/L。95℃预变性2min后,加入Taq DNA聚合酶(Promega公司)4μ。按94℃ 40 s,55℃ 40 s,72℃ 60 s进行35个循环，另在72℃延伸120s。其产物经1.2%agarose gel电泳，可见有大小相近的目的基因片段得以扩增。切下琼脂糖凝胶中的目的基因条带，以glassmilk试剂盒(购自Clontech公司)回收片段，以BamH I+EcoR I(深圳晶美公司产品)双酶切目的片段后，定向插入同样双酶切的pUC19载体中，以T4DNA连接酶连接(16℃，16h)。将重组后的pUC19转化处于感受态的E.coli JM109菌株，铺于含有X-gal和IPTG的平皿，做蓝白筛选。过夜培养后，钓取白色菌落，扩大培养、提取质粒,以BamH I+EcoR I双酶切鉴定,切下与预期基因片段大小相近的片段。
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1.4 序列测定以 [r-32p]ATP将引物末端标记。按T7 DNA Polymerase sequencing kit(Promega公司)操作说明书的方法操作，采用双脱氧终止法测定序列。电泳后，将凝胶吹干，做放射自显影。
1.5 目的基因片段与GST的融合表达 将测序后的重组载体以BamH I+EcoR I消化，切下的片段再与此两种酶切后的pGEX-4T-1载体定向连接，然后导入感受态的E.coliJM109菌株，铺于平皿。过夜培养后，筛选鉴定阳性克隆，于含氨苄青霉素(0.1g/L)的LB培养基中培养过夜。取5ml转种于500ml含0.1g/L氨苄青霉素和1%葡萄糖的LB培养基中，继续培养约3h(A600≈0.3)后，取出，置室温约40min(使培养液降至室温，低于26℃)，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，于26℃继续培养1h。取1ml的培养液离心(5000r/min)2min(剩余细菌按同样方法收菌后备用)。加入2×蛋白上样缓冲液(含100mmol/LTris-ClpH6.8,200 mmol/L二硫苏糖醇，4%SDS，0.2%溴酚蓝及20%甘油)50μl，混匀。煮沸(5min)，离心(10000 r/min,10 min),取上清做SDSPAGE。
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1.6 工程菌的裂解及表达蛋白的可溶性鉴定 实验分无载体工程菌组、GST阴性对照组、GST-PLCγ-2PH结构域组和GST-BtkPH结构域阳性对照组[15]。将约500ml培养液收获的工程菌沉淀重悬于5ml冰冷的STE(10mmol/L Tris,150mmol/L NaCl,1.0mmol/L EDTA,0.1g/L溶菌酶及1.0mmol/L苯*****)中，冰浴15min。加入DTT至终浓度为5mmol/L，十二烷基肌氨酸钠至终浓度为1.5%,冰浴至溶液变得粘稠(约2min)。以超声波破碎细胞(输出功率40，4℃,2×1min),离心(12,000r/min,4℃，20min)。取上清加入2%的Triton-X100,混匀后，以0.45μm滤膜过滤，加入0.02%的NaN3，存于4℃备用。分别取50μl上清和全部沉淀(沉淀约占总体积的1%～2%)，加入2×蛋白上样缓冲液50μl，按上述方法做SDS-PAGE。
1.7 Jurkat细胞的培养及裂解 将人T细胞白血病细胞系Jurkat接种于RPMI-1640培养基(含10%的胎牛血清)中，于37℃、5%CO2条件下培养。离心(1000r/min，室温，1min)，收集细胞沉积(约5×107)，-70℃冻存。应用时，于4℃下解冻，加入2mlNP-40细胞裂解液(1%NP-40，20mmol/LTris-Cl,pH8.0,150mmol/LNaCl,0.02%NaN3,100mmol/LCaCl2,用前加入0.0017%aprotinin,1.0mmol/LPMSF)剧烈震荡(4℃，2×1.0min)。离心(14000g,4℃,10min)，取上清于4℃存放备用。
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1.8 表达蛋白的纯化及浓度调整 取8 mg agarose beads(Sigma公司产品)加水1ml,4℃,1h(使小珠子全部泡涨)，离心(2000g,4℃ 3 min)，加入1mlPBS,重复离心，共3次。将agarosebeads重悬于1mlPBS(含1%的TritonX100和0.01%NaN3)中。取0.1ml处理后的agarose beads，加入1ml经1.6处理的工程菌上清(不包括无载体工程菌组)，4℃孵育60min(不时轻轻摇动，以利于GST与agarose beads结合)。离心(2000g,4℃,3min)，加入1ml PBST(含0.05%Tween-20的PBS)，重复离心，共3次(每次弃去上清的90%，以免丢失沉淀的agarose beads)，沉淀重悬于含0.02%NaN3的PBST中。通过SDS-PAGE,调整各组蛋白的浓度(以电泳后蛋白条带的粗细为参照，用无载体工程菌上清作为稀释液)，使之接近一致，以免非特异结合造成的差异。
1.9 表达融合蛋白与PKC的结合 取按1.8处理的agarose beads混悬液0.1ml(各组的agarose beads已结合约等量的表达蛋白)，加入经1.7处理的Jurkat细胞上清0.5ml,4℃孵育60min(不时轻轻摇动，以利于可与PH结构域结合的蛋白与之结合)，离心(2000g,4℃,3min)，取沉淀，加入1mlNP40缓冲液(不含aprotinin，PMSF和CaCl2),重复离心，共5次(小心吸去上清，不能丢失沉淀)。
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1.10 Westernblot鉴定PH结构域与PKC的结合 将1.9所得沉淀重悬于30μ lNP-40缓冲液中,加入5×蛋白上样缓冲液，常规做SDS-PAGE。取下聚丙稀酰胺凝胶，用甲醇浸泡固定PVDF(polyvinylidene difluoride)膜，于冰浴条件下转移(100V，3h)。以PBST洗去PVDF膜上残留的转移缓冲液，用含5%明胶的PBST封闭后，浸泡PVDF膜，37℃，轻摇1h。取PVDF膜及1μg兔抗鼠PKCβ1抗体(溶于1.5mlPBS中)封入小塑料袋中，4℃过夜。用20mlPBST漂洗PVDF膜(37℃，轻轻摇动)，共3次(1×15min，2×5min)。再将PVDF膜及1μg羊抗兔抗体(溶于1.5mlPBS)，封入小塑料袋中，37℃，轻摇1.5h。同上以PBST20ml漂洗PVDF膜，共5次(1×15min，4×5min)。用滤纸吸干多余的PBST。取Westernblot检测试剂盒ECL(为Amersham公司的化学发光试剂)中1号液及2号液各1ml，混匀，立即投入PVDF膜，反应1min后，滤纸吸干多余的反应液，于暗室条件下压上X-光片，感光10min。
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2 结果
2.1 PLCγ-2PH结构域基因片段的扩增及鉴定 于PH结构域基因的5′端和3′端各设计1条引物，以PCR扩增PH结构域基因，得到1条长约400bp的基因片段(图1，见第Ⅳ页)与预期的PH结构域基因(应为408bp)大小相一致。
图1 PCR扩增的PH结构域基因片段的琼脂糖凝胶电泳鉴定
Fig1 Identification of the amplified PH domain gene by 1.2 % agarose gel electrophoresis
1: pGEM 7zf(+)/Hae Ⅲ marker; 2 and 3: Amplification of the PH domain gene from the cDNA; 4: Negative control without cDNA
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2.2 PLCγ-2PH结构域基因片段的克隆与鉴定 将上述扩增的目的片段分别用BamHI和EcoRI消化后，定向插入pUC19载体中，构建出两种重组质粒，再提取质粒经上述两种酶消化后，得到大小约400bp(酶切后应为399bp)的插入片段(图2，见第Ⅳ页)。
图2 重组质粒的双酶切鉴定
Fig2 Identification of the recombinant plasmids digested with BamH 1 and EcoR 1 in 1.2 % agarose gel electrophoresis
1: Positive clone; 2: Negative clone; 3: The marker fragments are 657,458， 434,328 and 289 bp in length, from top to bottom
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2.3 PLCγ-2PH结构域基因片段的序列测定 用末端终止法，测定了PLCγ-2氨基端的PH结构域基因片段的全部核苷酸序列(图3，见第Ⅳ页)。PH结构域基因片段的全长为399bp,编码133个氨基酸。编码的氨基酸序列与文献报道的序列相一致。序列两端的PCR引物及酶切位点正确，序列内部不含终止码，为一开放读框。
图3 PLCγ-2 PH结构域cDNA的末端终止法测序
Fig3 Sequencing of PLCγ-2 PH domain cDNA
2.4 PLCγ-2的PH结构域与GST的融合表达 插入表达载体pGEX-4T-1中的PH结构基因，经IPTG的诱导得到表达(图4，见第Ⅳ页)。图4显示，未经诱导的重组载体无明显目的蛋白的表达，经诱导后得到的表达蛋白的相对分子质量(Mr)约为4×104 (PLCγ-2的PH结构域与GST融合后的Mr实为4.063×104，与预期的分子大小相一致。
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图4 PLCγ-2 PH结构域的诱导表达
Fig4 Expression of GST─PLCγ-2 PH domain
1: The protein markers are 97 400, 66 200, 43 000,31 000, 21 100 and 14 400, from top to bottom; 2: Expression of GST-PLCγ-2 PH domain induced at 26℃ for 1h; 3: Negative control; 4: Expression of GST
2.5 表达蛋白溶解状态的鉴定 将诱导培养后的工程菌重悬，以超声波破碎法裂解，取全部沉淀(约50μl)及50μl上清。变性后，各取15μl上样，做SDS-PAGE。结果表明，上清和沉淀中均有粗细相近的新生蛋白条带(图5，见第Ⅳ页)。因沉淀物的体积仅占总体积的约2%，故所表达的目的蛋白的大部分是可溶性的，占目的蛋白总量的95%以上。
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图5 表达蛋白溶解状态的鉴定
Fig5 Identification of lytic state of expression protein
1: Precipitate of the lysate; 2:Supernatant of the lysate; 3: Protein markers are 97 400, 66 200, 43 000,31 000, 21 100 and 14 400, from top to bottom; 4: Total protein from bacteria lysate
2.6 表达蛋白的纯化及Westernblot分析 表达的融合蛋白用agarose beads纯化后，经SDS-PAGE表明，已得到较高纯度的蛋白(图6A，见第Ⅳ页)。Western blot结果显示，PLCγ-2PH结构域同BtkPH结构域一样，在其泳道中检测到有PKC的存在；而单纯的GST泳道未检测到PKC的存在(图6B，见第Ⅳ页)，表明PLCγ-2PH结构域在体外可与PKC结合。
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图6 表达蛋白的纯化(A)和Western blot检测表达蛋白与PKC的结合(B)
Fig6 Purification of the expressed protein(A) and assay of binding of expression protein to PKC(B)
(A) 1: Purified PLCγ-2 PH domain-GST; 2: Purified Btk PH domain-GST; 3: Purified GST; (B)1: Binding of PLCγ-2 PH domain-GST to PKC; 2:Binding of Btk PH domain-GST to PKC; 3: Binding of GST to PKC; 4: Lysate of Jurkat cells
3 讨论
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细胞间的相互协调是多细胞生物体生存的基本条件。单细胞生物不仅需要与外界进行物质交流，而且需与外界进行信息交流。各种外界信号到达细胞后如何引起细胞的生理、病理改变逐渐引起人们的重视。大多数细胞外信号分子并不能直接透过细胞膜，需要通过细胞膜表面的受体转导才能传导到细胞内。跨膜后的信号在细胞内的传递过程因信号种类不同而异。信号传递过程及其方式的变化可影响到细胞的生长、发育、凋亡，以及肿瘤细胞的发生和发展。
随着分子生物学的快速发展，对细胞内信号传递过程的认识显得更为迫切和重要。但由于信号分子大多在细胞内部含量低、直接检测困难，而纯化信号蛋白的PH结构域更为困难。目前已知大多数信号分子的PH结构域具有相对独立的空间结构。有资料表明，几种独立的PH结构域仍能与相应配基结合[9]。我们应用基因工程的方法，从新鲜组织中克隆了信号分子PLCγ-2的PH结构域基因，并得以在大肠杆菌中与GST融合表达，为对其进一步纯化及功能研究提供了条件。以上结果表明，我们所用克隆表达PH结构域基因的方法是可行的。
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PLC在磷脂酰肌醇的信号通路中发挥着重要的作用。同PKC一样，激活后都会在胞浆内移位[10]，这一现象往往与该分子本身特定的结合结构域有关。研究表明，PLC和PKC都存在一个称为C2的同源区，该结构域可能参与了PLC和PKC的移位。对于PLC来说，其分子中的其它结构域也可能参与该分子的移位，其中可能涉及到PH结构域。PKC作为一类丝氨酸/苏氨酸激酶，在一系列以蛋白磷酸化为特征的信号转导过程中具有重要的作用，因激活的PKC可催化PLCγ分子中的丝氨酸磷酸化[11]。我们的研究结果表明，PLCγ-2的PH结构域与GST的融合蛋白在体外可与PKC结合，而单纯的GST却不能与PKC结合。推测若PH结构域在体内也能与PKC结合，那么在PKC对PLCγ的催化过程中，PLCγ-2的PH结构域可能起着识别与“接合”(adapt)PKC的作用。当然PLCγ-2还存在着其它结构域，是否可与PKC结合尚不清楚。另外，PLCγ-2的PH结构域对PKC活性的影响，以及二者结合的生理作用也正在进一步研究之中。
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*国家自然科学基金资助项目，No.3974002
作者简介：季少平，男，35岁，讲师，博士生。西安市长乐西路17号，Tel(029)3374516
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收稿：1998-06-25
修回：1998-10-22, 百拇医药