传染性法氏囊病病毒HZ96VP2cDNA的结构分析及在大肠杆菌中的表达*
作者：于涟 宋坤华 金勇丰 李双茂 张耀洲
单位：浙江大学华家池校区，动物免疫研究所，生物化学研究所，杭州，310029
关键词：IBD；VVP2cDNA；结构分析；非融合表达
细胞与分子免疫学杂志990206
摘 要：以随机引物反转录传染性法氏囊病病毒(IBDV)杭州分离株HZ96基因组合成第1链cDNA。以第1链cDNA为模板，PCR扩增HZ96VP2 cDNA；Sanger双脱氧法测序HZ96VP2 cDNA，并对其基因结构氨基酸序列进行计算分析；构建非融合表达质粒，在大肠杆菌中表达VP2蛋白。结果表明，克隆的HZ96VP2cDNA全长为1431个核苷酸对(bp),含起始密码子ATG和终止密码子TAA,编码VP2第20至第495共476个氨基酸;HZ96VP2在核苷酸和氨基酸水平上，与其它I型IBDV VP2的同性均在90%以上;对HZ96分离株与强毒株VP2cDNA编码的氨基酸序列进行二级结构和亲水性分析发现，HZ96分离株VP2第279和284位氨基酸的变异，可导致附近区域(274～290位氨基酸)的亲水性降低和α-螺旋的消失。HZ96VP2在大肠杆菌中的表达量为8%。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类号：Q752
Analysis and expression in E.coli of VP2 cDNA of infectious
bursal disease virus HZ96 strain*
Yu Lian, Song Kunhua, Jin Yongfeng1, Li Shuangmao,Zhang Yaozhou1**
(Institute of Animal Immunology, Zhejiang University at Huajiachi, 1Institute of Biochemistry, Zhejiang University at Huajiachi, Hangzhou 310029)
, 百拇医药
Keywords：IBDV VP2 cDNA structural analysis non-fusion expression
Abstract：VP2 cDNA of infectious bursal disease virus HZ96 strain was cloned and sequenced. The length of cloned VP2 cDNA of HZ96 is 1431 base pair(bp) including initial codon ATG and stop codon TAA which encodes VP2 protein from 20 th to 495 th amino acid. Analysis of HZ96 VP2 cDNA indicates that the degree of homology of VP2 of HZ96 and other VP2 of serotype I of IBDV is more than 90% in nucleotide and amino acid sequences. Comparison of hydrophilicity profiles and plot of alpha-helix curves of HZ96 and virulent strain STC show that variant amino acids at positions 279 and 284 result in reduced hydrophilicity and the deletion of alpha-helix of HZ96 VP2. HZ96 VP2 was cloned into the non-fusion expression vector pBv221 (pBvVP2). Then pBvVp2 was transformed into E.coli. The quantity of expressed VP2 reach to 8% of the total bacterial proteins upon induction.
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传染性法氏囊病病毒(IBDV)属于Birnaviridae科,Avibirnavirus属。IBDV从血清学上分为I型和II型,但只有I型能引起感染的鸡发生病理性反应。IBDV通过破坏前B细胞而引起2周～3周龄的鸡发生免疫抑制〔1〕,给世界养鸡业带来巨大损失。
IBDV基因组由两条双链RNA组成(A段和B段)。A段(约3.2kb)具有两个开放阅读框架(ORF):A1和A2,其中ORF A1编码1个相对分子质量(Mr)为108000的前体蛋白质,经翻译后加工成为3个成熟蛋白质VP2(Mr为32000～40000)，VP3(Mr为30000～32000)和VP4(Mr为22000)。VP2和VP3形成病毒粒子的外壳,而VP4则参与前体蛋白质的剪切。ORF A2编码1种功能不明的蛋白质VP5(Mr为17000)〔2〕。B段(约2.8kb)只编码1种蛋白质VP1(Mr为90000)，它具有依赖RNA的RNA聚合酶活性,基因组可能通过两片段的末端和VP1相连。
, 百拇医药
VP2既是IBDV的主要结构蛋白,又是IBDV的主要宿主保护性抗原。它包括至少3个与诱导中和性抗体有关的抗原表位。在VP2的206位和第350位氨基酸残基之间存在一高变区。最近研究表明，VP2的高变区与IBDV的抗原变异、毒力强弱、以及病毒中和性抗体的诱导和识别有关〔3〕。另外，重组表达的VP2还能诱导某些培养细胞发生细胞凋亡〔4〕。美国、德国和澳大利亚等国的研究工作者，相继在原核和多种真核表达系统中表达了VP2〔5～8〕。国内对VP2分子生物学的研究起步相对较晚，主要是基因克隆和原核表达〔9，10〕。我们在全序列测定HZ96VP2cDNA的基础上,对其基因结构和氨基酸序列进行了比较分析,并初步研究了它在大肠杆菌中的表达,为进一步探索VP2的基因工程疫苗、VP2基因免疫，以及VP2诱导细胞凋亡的机制，并进而为建立1种细胞凋亡的研究模型打下了基础。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 毒株、质粒及菌株 IBDVHZ96毒株，由本校华家池校区动物免疫研究所于1996年分离,并在鸡胚成纤维细胞(CEFs)中连续传代，其毒力明显致弱。质粒pBluescriptSK，pBv221和菌株E.coliTG1、Jm109，均由本校生物化学研究所保存。
1.2 酶及试剂 反转录酶,BamHI,HindIII,BglII,SalI和XbaI,购自Gibco公司;Klenow,AccI,SacI和XhoI,购自BoerhringerMannheim公司，PCR反应系统购自Promega公司。随机引物由浙江博联生物技术中心设计并合成，测序试剂盒SequenaseVersion2.0Kit为U.S.Biochemical产品。
1.3 PCR引物的设计与合成 比较CuI，PBG98，CJ801bkf，00273和STC等I型IBDV毒株A段的序列,在VP2的5′端保守区设计了1条引物:
, 百拇医药 5′-1(189-212):5′AAAAGATCTATGCCAACAACCGGACCGGCGTCC3′;
Bgl II
在3′端保守区也设计了1条引物:
3′-1(1617-1593):5′AAAAGCTTACGCGGCTCGAGCAGTTCCTGAAGC3′;
HindIII
引物在中国科学院上海生物化学研究所合成。
1.4 dsRNA的纯化 按文献〔11〕的方法进行。
1.5 RTPCR 将纯化的HZ96基因组于100℃沸水浴10min,冰浴5min,以6核苷酸随机引物为反转录引物合成第1链cDNA,RNaseH消化残余RNA，酚/氯仿抽提,酒精沉淀。以第1链cDNA为模板,加入引物5′-1和3′-1,于100μl反应体系中进行PCR反应。先在94℃保温120s,然后设置35个循环:94℃,54s;57℃,90s;72℃,120s;最后72℃延伸600s,以低融点胶回收PCR产物。
, 百拇医药
1.6 克隆及制作酶切图谱 以Bgl II和Hind III双酶切PCR产物,以BamHI和HindIII双酶切质粒pBluescript Sk,连接并转化TG1菌株,挑取兰、白斑筛选重组质粒。酶切鉴定,制作HZ96 VP2酶切图谱。重组质粒命名为pBlVP2。
1.7 HZ96VP2cDNA序列分析及结构分析 手工测序采用Sequenase Version2.0Kit(U.S.Biochemical)试剂盒;自动测序在本校湖滨校区肿瘤研究所完成;结构分析采用PC Gene软件进行。
1.8 非融合表达质粒pBvVP2的构建 以Xba I酶切质粒pBlVP2,Klenow补平,Sal I酶切,低融点胶回收1.4kb片段。另以BamH I酶切质粒pBV221,Klenow补平,Sal I酶切,低融点胶回收3.6kb片段,连接、转化TG1菌株,酶切筛选重组质粒,重组质粒命名为pBvVP2。
, 百拇医药 1.9 SDSPAGE及薄层扫描分析 以非融合表达质粒pBvVP2转化JM109菌株,挑取单菌落培养过夜,1%接种于5ml LB液体培养基(含100ng/ml氨卞青霉素)中，30℃振荡培养至A600=0.4～0.5。立即转移至42℃培养4.5h,低速离心收集菌体,用100μl1×SDS-PAGE上样缓冲液裂解细胞,煮5min,离心(12000r/min)10min,取25μl上清上样,分离胶浓度为10%,考马斯亮蓝染色,CS-930型Shimadzu薄层扫描仪扫描凝胶。
2 结果
1.1 dsRNA反转录 纯化的HZ96基因组经1%琼脂糖凝胶电泳,可分为约3.2kb和2.8kb两条带。以随机引物反转录变性RNA,放射自显影证明,合成的第1链cDNA有部分大于1.4kb,因此可以此为模板扩增VP2 cDNA。
2.2 PCR扩增VP2cDNA 以反转录合成的第1链cDNA为模板,用引物5′-1和3′-1进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测，只有1条约1.4kb大小的片段。用Acc I酶切低融点胶回收的1.4kb片段,电泳后得到的两条带分别为0.56kb和0.8kb(图1),与文献报道的结果基本一致。
, 百拇医药
图1 RTPCR及鉴定
Fig1 Identification of PCR products
1:1kb ladder; 2:PCR products;3:PCR products digested by Acc I
2.3 HZ96VP2cDNA内切酶图谱 以Sac I,Acc I,Hind III,BamH I+Sac I,Acc I+Sac I,Xba I+Xho I,Xba I,BamH I酶切重组质粒pBlVP2(图2),并绘制pBlVP2酶切图谱(图3)。
图2 重组质粒pBlVP2的酶切鉴定
Fig2 Plasmid pBlVP2 digested by different restriction enzymes
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1: 1kb ladder; 2: Hind III; 3: Sac I;4: BamH I+ Sac I; 5：Xho I + Xba I; 6:Acc I; 7: BamH I+ Xba I; 8: Sac I+ Acc I;9:Xba I
图3 IBDVHZ96VP2cDNA内切酶图谱
Fig3 Restriction map of IBDV HZ96 VP2 cDNA
2.4 HZ96VP2cDNA及氨基酸序列分析 HZ96VP2 cDNA(Genbank注册号为AF121256)与其它I型弱毒株CJ-801bkf，Cu-I和PBG98的同源性均在98%以上，其中大部分变异集中在637位与996位核苷酸之间。推测的VP2氨基酸序列比较显示，HZ96VP2和上述弱毒株一样：在253位、279位和284位的氨基酸分别为His，Asn和Thr；而强毒株52/70，STC和002-73，在这3个位置的氨基酸则分别为Gln，Asp和Ala。HZ96VP2和强毒株代表STC氨基酸亲水性及α-螺旋的分析表明，3个位置氨基酸的替代：253位(Gln→His)，279位(Asp→Asn)和284位(Ala→Thr)，可导致HZ96VP2氨基酸250位与260位之间,274位和290位之间两个区域亲水性降低，同时279位(Asp→Asn)和284位(Ala→Thr)的替代还可导致274位与290位之间α-螺旋的消失。这一区域亲水性的降低，以及α-螺旋的消失可能会导致VP2构象的改变，进而改变VP2的抗原性和IBDV的毒力。
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2.5 HZ96VP2在大肠杆菌中的非融合表达表 达质粒pBvVP2中,起始密码子ATG与Shine-Dalgarno(SD)序列之间的距离为6个核苷酸,VP2cDNA位于强温串联启动子PRPL的调控之下,强转录终止子rrnBT1T2位于VP2cDNA的下游(图4)。经高温诱导,与对照pBv221相比较，在Mr为52000左右的地方出现1条明显的条带,大小与VP2蛋白应一致(图5),经薄层扫描分析,表达量为8%左右。
图4 表达质粒pBvVP2的图谱
Fig4 Map of the expression plasmid pBvVP2
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图5表达VP2蛋白的SDS-PAGE
Fig 5 SDS-PAGE of expressed VP2 protein in E.coli
1:pBv221(induced); 2：pBvVP2(induced);3：Relative molecular mass(Mr)marker
3 讨论
HZ96 VP2 cDNA与其它I型IBDV弱毒株CJ-801bkf，Cu-I和PBG98的同源性平均值为98%,而与I型IBDV强毒株52/70，STC和002-73的同源性平均值为96%。VP2在氨基酸水平上的同源性平均值分别为97.8%和96.5%,而其中的变异，80%左右集中在占全长30%的高变区。在核苷酸水平上,同为欧洲株的Cu-I与PBG98的同源性高达99.51%,美国强毒株STC和英国强毒株52/70的同源性为98%,而STC与澳大利亚强毒株002-73的同源性为92.4%;在氨基酸水平上,以上数值分别为:98.95%，98.95%和97.26%。上面的统计数据表明，VP2氨基酸的变异速度略低于核苷酸的变异速度。这种变异规律符合生物的进化规则。VP2的变异程度(无论是核苷酸还是氨基酸)均与地域有关。
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HZ96VP2在254位、279位和284位3个位置上的氨基酸点突变，可能会导致VP2构象的改变。由于VP2是IBDV的主要结构蛋白,因此，VP2构象的改变有可能通过改变病毒粒子的表面构象进而改变IBDV的毒力。构象的改变可导致细胞表面受体无法识别IBDV病毒粒子,或者宿主体内的免疫系统能有效地监视构象改变的病毒粒子，从而遏制IBDV在体内的大量繁殖。VP2和病毒粒子高级结构的研究将有助于解决这一问题。
静国忠等利用pBv221构建了起始密码子ATG距SD序列6个核苷酸,表达金黄色葡萄球菌核酸酶A的表达质粒,目的基因的表达量高达40%〔12〕。由于VP2编码序列中，含有大量对大肠杆菌来说难于识别的稀有密码子,虽然采用了这一强表达质粒,但表达量只能达8%。因此，提高VP2在大肠杆菌中的表达量是一个值得深入研究的课题。
VP2和VP3是IBDV的主要结构蛋白,在GenBank中未能查找到与HZ96VP2同源的核酸结合蛋白序列。我们推测，VP1和VP3是稳定基因组RNA的主要蛋白,而VP2则包裹于IBDV粒子的外层。这一病毒粒子的结构模型可部分地解释VP2的有关功能:IBDV能诱导细胞凋亡〔13〕,VP2也是细胞凋亡的诱导剂,而VP3则不具有这种功能〔4〕;VP2能诱导中和性抗体;VP2与病毒的毒力、不同毒株的抗原变异有关等等。有关IBDV VP2基因工程疫苗的研制和其基因免疫的探索正在进行中。
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致谢:感谢本校湖滨校区肿瘤研究所耿礼义博士在DNA测序中给予的帮助，华家池校区陈功同学文稿打印过程中提供的方便!
*国家自然科学基金资助项目，No.39370526，浙江省科委"九五"攻关项目，No.961102168
作者简介：于涟，女，55岁，教授，研究生导师；张耀洲：联系作者。杭州市凯旋路268号，Tel.(0571)6971414
参考文献
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[12]静国忠,刘利军,刘志革,等.金黄色葡萄球菌核酸酶A基因在大肠杆菌中的高效表达.生物工程学报,1994;10:18～23
[13]Vasconcelos AC, Lam KM. Apoptosis induced by infectious bursal disease virus. J Gen Virol, 1994; 75:1803～ 1806
收稿：1998-12-30
修回：1999-03-11, 百拇医药
单位：浙江大学华家池校区，动物免疫研究所，生物化学研究所，杭州，310029
关键词：IBD；VVP2cDNA；结构分析；非融合表达
细胞与分子免疫学杂志990206
摘 要：以随机引物反转录传染性法氏囊病病毒(IBDV)杭州分离株HZ96基因组合成第1链cDNA。以第1链cDNA为模板，PCR扩增HZ96VP2 cDNA；Sanger双脱氧法测序HZ96VP2 cDNA，并对其基因结构氨基酸序列进行计算分析；构建非融合表达质粒，在大肠杆菌中表达VP2蛋白。结果表明，克隆的HZ96VP2cDNA全长为1431个核苷酸对(bp),含起始密码子ATG和终止密码子TAA,编码VP2第20至第495共476个氨基酸;HZ96VP2在核苷酸和氨基酸水平上，与其它I型IBDV VP2的同性均在90%以上;对HZ96分离株与强毒株VP2cDNA编码的氨基酸序列进行二级结构和亲水性分析发现，HZ96分离株VP2第279和284位氨基酸的变异，可导致附近区域(274～290位氨基酸)的亲水性降低和α-螺旋的消失。HZ96VP2在大肠杆菌中的表达量为8%。
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Analysis and expression in E.coli of VP2 cDNA of infectious
bursal disease virus HZ96 strain*
Yu Lian, Song Kunhua, Jin Yongfeng1, Li Shuangmao,Zhang Yaozhou1**
(Institute of Animal Immunology, Zhejiang University at Huajiachi, 1Institute of Biochemistry, Zhejiang University at Huajiachi, Hangzhou 310029)
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Keywords：IBDV VP2 cDNA structural analysis non-fusion expression
Abstract：VP2 cDNA of infectious bursal disease virus HZ96 strain was cloned and sequenced. The length of cloned VP2 cDNA of HZ96 is 1431 base pair(bp) including initial codon ATG and stop codon TAA which encodes VP2 protein from 20 th to 495 th amino acid. Analysis of HZ96 VP2 cDNA indicates that the degree of homology of VP2 of HZ96 and other VP2 of serotype I of IBDV is more than 90% in nucleotide and amino acid sequences. Comparison of hydrophilicity profiles and plot of alpha-helix curves of HZ96 and virulent strain STC show that variant amino acids at positions 279 and 284 result in reduced hydrophilicity and the deletion of alpha-helix of HZ96 VP2. HZ96 VP2 was cloned into the non-fusion expression vector pBv221 (pBvVP2). Then pBvVp2 was transformed into E.coli. The quantity of expressed VP2 reach to 8% of the total bacterial proteins upon induction.
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传染性法氏囊病病毒(IBDV)属于Birnaviridae科,Avibirnavirus属。IBDV从血清学上分为I型和II型,但只有I型能引起感染的鸡发生病理性反应。IBDV通过破坏前B细胞而引起2周～3周龄的鸡发生免疫抑制〔1〕,给世界养鸡业带来巨大损失。
IBDV基因组由两条双链RNA组成(A段和B段)。A段(约3.2kb)具有两个开放阅读框架(ORF):A1和A2,其中ORF A1编码1个相对分子质量(Mr)为108000的前体蛋白质,经翻译后加工成为3个成熟蛋白质VP2(Mr为32000～40000)，VP3(Mr为30000～32000)和VP4(Mr为22000)。VP2和VP3形成病毒粒子的外壳,而VP4则参与前体蛋白质的剪切。ORF A2编码1种功能不明的蛋白质VP5(Mr为17000)〔2〕。B段(约2.8kb)只编码1种蛋白质VP1(Mr为90000)，它具有依赖RNA的RNA聚合酶活性,基因组可能通过两片段的末端和VP1相连。
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VP2既是IBDV的主要结构蛋白,又是IBDV的主要宿主保护性抗原。它包括至少3个与诱导中和性抗体有关的抗原表位。在VP2的206位和第350位氨基酸残基之间存在一高变区。最近研究表明，VP2的高变区与IBDV的抗原变异、毒力强弱、以及病毒中和性抗体的诱导和识别有关〔3〕。另外，重组表达的VP2还能诱导某些培养细胞发生细胞凋亡〔4〕。美国、德国和澳大利亚等国的研究工作者，相继在原核和多种真核表达系统中表达了VP2〔5～8〕。国内对VP2分子生物学的研究起步相对较晚，主要是基因克隆和原核表达〔9，10〕。我们在全序列测定HZ96VP2cDNA的基础上,对其基因结构和氨基酸序列进行了比较分析,并初步研究了它在大肠杆菌中的表达,为进一步探索VP2的基因工程疫苗、VP2基因免疫，以及VP2诱导细胞凋亡的机制，并进而为建立1种细胞凋亡的研究模型打下了基础。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 毒株、质粒及菌株 IBDVHZ96毒株，由本校华家池校区动物免疫研究所于1996年分离,并在鸡胚成纤维细胞(CEFs)中连续传代，其毒力明显致弱。质粒pBluescriptSK，pBv221和菌株E.coliTG1、Jm109，均由本校生物化学研究所保存。
1.2 酶及试剂 反转录酶,BamHI,HindIII,BglII,SalI和XbaI,购自Gibco公司;Klenow,AccI,SacI和XhoI,购自BoerhringerMannheim公司，PCR反应系统购自Promega公司。随机引物由浙江博联生物技术中心设计并合成，测序试剂盒SequenaseVersion2.0Kit为U.S.Biochemical产品。
1.3 PCR引物的设计与合成 比较CuI，PBG98，CJ801bkf，00273和STC等I型IBDV毒株A段的序列,在VP2的5′端保守区设计了1条引物:
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Bgl II
在3′端保守区也设计了1条引物:
3′-1(1617-1593):5′AAAAGCTTACGCGGCTCGAGCAGTTCCTGAAGC3′;
HindIII
引物在中国科学院上海生物化学研究所合成。
1.4 dsRNA的纯化 按文献〔11〕的方法进行。
1.5 RTPCR 将纯化的HZ96基因组于100℃沸水浴10min,冰浴5min,以6核苷酸随机引物为反转录引物合成第1链cDNA,RNaseH消化残余RNA，酚/氯仿抽提,酒精沉淀。以第1链cDNA为模板,加入引物5′-1和3′-1,于100μl反应体系中进行PCR反应。先在94℃保温120s,然后设置35个循环:94℃,54s;57℃,90s;72℃,120s;最后72℃延伸600s,以低融点胶回收PCR产物。
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1.6 克隆及制作酶切图谱 以Bgl II和Hind III双酶切PCR产物,以BamHI和HindIII双酶切质粒pBluescript Sk,连接并转化TG1菌株,挑取兰、白斑筛选重组质粒。酶切鉴定,制作HZ96 VP2酶切图谱。重组质粒命名为pBlVP2。
1.7 HZ96VP2cDNA序列分析及结构分析 手工测序采用Sequenase Version2.0Kit(U.S.Biochemical)试剂盒;自动测序在本校湖滨校区肿瘤研究所完成;结构分析采用PC Gene软件进行。
1.8 非融合表达质粒pBvVP2的构建 以Xba I酶切质粒pBlVP2,Klenow补平,Sal I酶切,低融点胶回收1.4kb片段。另以BamH I酶切质粒pBV221,Klenow补平,Sal I酶切,低融点胶回收3.6kb片段,连接、转化TG1菌株,酶切筛选重组质粒,重组质粒命名为pBvVP2。
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2 结果
1.1 dsRNA反转录 纯化的HZ96基因组经1%琼脂糖凝胶电泳,可分为约3.2kb和2.8kb两条带。以随机引物反转录变性RNA,放射自显影证明,合成的第1链cDNA有部分大于1.4kb,因此可以此为模板扩增VP2 cDNA。
2.2 PCR扩增VP2cDNA 以反转录合成的第1链cDNA为模板,用引物5′-1和3′-1进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测，只有1条约1.4kb大小的片段。用Acc I酶切低融点胶回收的1.4kb片段,电泳后得到的两条带分别为0.56kb和0.8kb(图1),与文献报道的结果基本一致。
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图1 RTPCR及鉴定
Fig1 Identification of PCR products
1:1kb ladder; 2:PCR products;3:PCR products digested by Acc I
2.3 HZ96VP2cDNA内切酶图谱 以Sac I,Acc I,Hind III,BamH I+Sac I,Acc I+Sac I,Xba I+Xho I,Xba I,BamH I酶切重组质粒pBlVP2(图2),并绘制pBlVP2酶切图谱(图3)。
图2 重组质粒pBlVP2的酶切鉴定
Fig2 Plasmid pBlVP2 digested by different restriction enzymes
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1: 1kb ladder; 2: Hind III; 3: Sac I;4: BamH I+ Sac I; 5：Xho I + Xba I; 6:Acc I; 7: BamH I+ Xba I; 8: Sac I+ Acc I;9:Xba I
图3 IBDVHZ96VP2cDNA内切酶图谱
Fig3 Restriction map of IBDV HZ96 VP2 cDNA
2.4 HZ96VP2cDNA及氨基酸序列分析 HZ96VP2 cDNA(Genbank注册号为AF121256)与其它I型弱毒株CJ-801bkf，Cu-I和PBG98的同源性均在98%以上，其中大部分变异集中在637位与996位核苷酸之间。推测的VP2氨基酸序列比较显示，HZ96VP2和上述弱毒株一样：在253位、279位和284位的氨基酸分别为His，Asn和Thr；而强毒株52/70，STC和002-73，在这3个位置的氨基酸则分别为Gln，Asp和Ala。HZ96VP2和强毒株代表STC氨基酸亲水性及α-螺旋的分析表明，3个位置氨基酸的替代：253位(Gln→His)，279位(Asp→Asn)和284位(Ala→Thr)，可导致HZ96VP2氨基酸250位与260位之间,274位和290位之间两个区域亲水性降低，同时279位(Asp→Asn)和284位(Ala→Thr)的替代还可导致274位与290位之间α-螺旋的消失。这一区域亲水性的降低，以及α-螺旋的消失可能会导致VP2构象的改变，进而改变VP2的抗原性和IBDV的毒力。
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2.5 HZ96VP2在大肠杆菌中的非融合表达表 达质粒pBvVP2中,起始密码子ATG与Shine-Dalgarno(SD)序列之间的距离为6个核苷酸,VP2cDNA位于强温串联启动子PRPL的调控之下,强转录终止子rrnBT1T2位于VP2cDNA的下游(图4)。经高温诱导,与对照pBv221相比较，在Mr为52000左右的地方出现1条明显的条带,大小与VP2蛋白应一致(图5),经薄层扫描分析,表达量为8%左右。
图4 表达质粒pBvVP2的图谱
Fig4 Map of the expression plasmid pBvVP2
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图5表达VP2蛋白的SDS-PAGE
Fig 5 SDS-PAGE of expressed VP2 protein in E.coli
1:pBv221(induced); 2：pBvVP2(induced);3：Relative molecular mass(Mr)marker
3 讨论
HZ96 VP2 cDNA与其它I型IBDV弱毒株CJ-801bkf，Cu-I和PBG98的同源性平均值为98%,而与I型IBDV强毒株52/70，STC和002-73的同源性平均值为96%。VP2在氨基酸水平上的同源性平均值分别为97.8%和96.5%,而其中的变异，80%左右集中在占全长30%的高变区。在核苷酸水平上,同为欧洲株的Cu-I与PBG98的同源性高达99.51%,美国强毒株STC和英国强毒株52/70的同源性为98%,而STC与澳大利亚强毒株002-73的同源性为92.4%;在氨基酸水平上,以上数值分别为:98.95%，98.95%和97.26%。上面的统计数据表明，VP2氨基酸的变异速度略低于核苷酸的变异速度。这种变异规律符合生物的进化规则。VP2的变异程度(无论是核苷酸还是氨基酸)均与地域有关。
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HZ96VP2在254位、279位和284位3个位置上的氨基酸点突变，可能会导致VP2构象的改变。由于VP2是IBDV的主要结构蛋白,因此，VP2构象的改变有可能通过改变病毒粒子的表面构象进而改变IBDV的毒力。构象的改变可导致细胞表面受体无法识别IBDV病毒粒子,或者宿主体内的免疫系统能有效地监视构象改变的病毒粒子，从而遏制IBDV在体内的大量繁殖。VP2和病毒粒子高级结构的研究将有助于解决这一问题。
静国忠等利用pBv221构建了起始密码子ATG距SD序列6个核苷酸,表达金黄色葡萄球菌核酸酶A的表达质粒,目的基因的表达量高达40%〔12〕。由于VP2编码序列中，含有大量对大肠杆菌来说难于识别的稀有密码子,虽然采用了这一强表达质粒,但表达量只能达8%。因此，提高VP2在大肠杆菌中的表达量是一个值得深入研究的课题。
VP2和VP3是IBDV的主要结构蛋白,在GenBank中未能查找到与HZ96VP2同源的核酸结合蛋白序列。我们推测，VP1和VP3是稳定基因组RNA的主要蛋白,而VP2则包裹于IBDV粒子的外层。这一病毒粒子的结构模型可部分地解释VP2的有关功能:IBDV能诱导细胞凋亡〔13〕,VP2也是细胞凋亡的诱导剂,而VP3则不具有这种功能〔4〕;VP2能诱导中和性抗体;VP2与病毒的毒力、不同毒株的抗原变异有关等等。有关IBDV VP2基因工程疫苗的研制和其基因免疫的探索正在进行中。
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致谢:感谢本校湖滨校区肿瘤研究所耿礼义博士在DNA测序中给予的帮助，华家池校区陈功同学文稿打印过程中提供的方便!
*国家自然科学基金资助项目，No.39370526，浙江省科委"九五"攻关项目，No.961102168
作者简介：于涟，女，55岁，教授，研究生导师；张耀洲：联系作者。杭州市凯旋路268号，Tel.(0571)6971414
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收稿：1998-12-30
修回：1999-03-11, 百拇医药