单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因部分缺失重组质粒的构建及序列分析*
作者：甄荣芬 喻启桂 陈伟 樊荣 薛采芳
单位：第四军医大学基础部抗感染研究室，西安，710032
关键词：单纯疱疹病毒；胸苷激酶基因；缺失突变；序列分析
细胞与分子免疫学杂志990203摘 要：目的：构建HSV-1型胸苷激酶基因部分缺失的重组质粒并进行序列测定。方法：以pUC18/TK重组质粒DNA为模板，用PCR方法扩增TK5′端503bp基因片段，并将扩增的片段克隆入载体pUC18中(pUC18/TK1)；用PstI和HindⅢ双酶切pUC18/TK，获得TK3′端383bp片段，将此酶切片段克隆入pUC18/TK1中，并进行测序。结果：构建成重组质粒pUC18/TK-。经酶切鉴定获得1条约900bp的基因片段；序列测定证实,HSV-1 17syn+TK基因缺失了第493～744位251对碱基。结论：成功地构建了部分缺失的HSV-1/TK-基因重组质粒，为研制其突变株奠定了基础。
, 百拇医药
中国图书资料分类号：Q78R373.11
Construction and seguencing recombinat plasmid of the thymidine
kinase gene deletion mutation of herpes smplex virus type I
Zhen Rongfen, Yu Qigui, Chen Wei， Fan Rong, Xue Caifang
(Laboratory of Anti infectious Diseases,the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Keywords：herpes simplex virus thymidine kinase deletion mutation seguencing mutation
, 百拇医药
Abstract：Aim:Constructing and seguencing recombinated plasmid of the thymidine kinase gene deletion mutation of herpes smplex virus type I (HSV-1). Methods: The 5′-TK 503bp was amplified by PCR. And the TK genic DNA of HSV-1 17syn+ strain in the recombinated plasmid pUC18(pUC18/TK) was used as tamplate. The amplified fragment was cloned into pUC18 vector( pUC18/TK1). Then the pUC18/TK was cleaved with both pst I and Hind III enzymes. The 3′-TK 383bp fragment was obtained and cloned into plasmid pUC18/TK1. It's sequence was analysed. Results:The recombination plasmid pUC18/TK- was constructed. The 251 bp from location 493 to 744 of TK gene of HSV-1 17syn+ strain was deleted in the plasmid pUC18/TK- . The other part of the sequence did not vary. Conclusion:The recombinated plasmid of HSV-1/TK- in which part genome was delected was successfully constructed.The plasmid pUC18/TK- laid a good fundation for further constructing TK deletion mutant of HSV-1.
, 百拇医药
单纯疱疹病毒I型(herpes simplex virus type I,HSV-I)的胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因为其早期基因,若发生突变则形成突变株[tk(-)HSV-I],能在鼠三叉神经节细胞等非分裂细胞中建立潜伏感染，但不能激活[1]，故对正常神经细胞无破坏作用。但tk(-)HSV-I能感染分裂细胞(如神经胶质瘤细胞和视网膜瘤细胞等)，并能在这些细胞中增殖，使之溶解破坏[2]。体外研究表明，tk(-)HSV-I突变株可杀伤U87和L19等神经胶质瘤细胞[3,4]。经皮下、肾包膜下及颅内右前叶直接注射tk(-)HSV-I突变株于荷神经胶质瘤的裸鼠及具有免疫活性的大鼠体内，可使肿瘤组织发生坏死，但不破坏正常组织。因此,本研究拟构建部分缺失的HSV-1/TK-基因重组质粒,以为进一步构建TK基因部分缺失的重组HSV-1突变株奠定基础。
1 材料和方法
1.1 质粒 重组质粒pUC18/TK(含HSV-1 17syn+株TK基因的全部编码区序列),由本室构建[5]。
, 百拇医药
1.2 引物 通过计算机辅助分析，根据HSV-1 17syn+TK基因序列，在其5′端设计一段引物(引物1)，引入EcoRI酶切位点；根据HSV-1 17syn+TK基因第468～492位碱基序列，设计一段反向引物(引物2),并引入PstI酶切位点。引物由美国OperonTechnologies公司合成。其序列如：引物1:For:5′-CGGAATTCATGGCTTCGTACCCCTGCCATCA-3′引物2:Rev:5′-TACTGCAGATGGCGGTCGAAGATGAGGGTGA-3′
1.3 质粒的提取、酶切、连接及转录 主要方法均参照《分子克隆》一书进行。
1.4 HSV-1 17syn+TK基因部分序列(503bp)重组质粒的构建 PCR反应体系：模板为本室构建的重组质粒pUC18/TK600ng,引物1For和引物2Rev各1μmol/L，4种dNTP各200 μmol/L，3mmol/LMgCl2,5 μl10×PCR缓冲液，总体积50μ1。PCR反应液经100℃煮沸变性5min后，每管加入Taq聚合酶0.8U,以20μ1液体石蜡油封面后，进行PCR扩增：即94℃1min,60℃1min,72℃延伸90s,共35个循环。然后于72℃延伸10min。PCR产物在含0.5mg/L溴化乙锭(EB)的10g/L琼脂糖凝胶中电泳,在紫外灯下观察结果。经10g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳回收503bp片段。用SurePure DNA Extraction Kit(Embi Tec公司产品)纯化回收的DNA片段。经EcoR I和Pst I双酶切后,克隆入经相应酶切后制备的pUC18载体中,转化感受态JM109细菌。将得到的阳性克隆，经PCR及EcoR I和Pst I双酶切鉴定，命名为pUC18/TK1重组质粒。
, 百拇医药
1.5 HSV-1TK基因部分缺失重组质粒的构建 用Pst I和Hind III双酶切pUC18/TK重组质粒，回收TK3′端383bp的片段；克隆入用同种酶切消化的pUC18/TK1中，转化感受态JM109细菌，将得到的阳性克隆，经PCR及EcoR I和Hind III双酶切鉴定，命名为pUC18/TK-重组质粒(图1)。
图1 pUC18/TK-重组质粒的构建
Fig 1 Construction of recombinat plasmid pUC18/TK-
1.6 pUC18/TK-序列的测定 pUC18/TK-重组质粒经用QIAGEN公司产品QIAamp Tip25-Kit纯化后，由美国夏威夷大学生物中心Neil博士在Applied Biosystems Model 373A Version全自动序分析仪中进行[5]测序。
, 百拇医药
2 结果
2.1 pUC18/TK1重组质粒DNA的鉴定 用引物1For和引物2Rev，对pUC18/TK重质粒进行扩增。将扩增产物克隆入pUC18载体中，经转化得到的阳性克隆，用EcoR I及Pst I双酶切和PCR鉴定，获得预期的503bp基因片段(图2)。
图2 重组pUC18/TK1的PCR鉴定
Fig 2 Identification of the recombinant plasmid pUC18/TK1 by PCR
1,2,3 and 5: Positive colonies;4 and 9: DNA molecular weight markers;6 and 7: Negative colonies
, 百拇医药
2.2 pUC18/TK-重组质粒DNA的鉴定 将构建的pUC18/TK-重组质粒，用EcoR I和Hind III双酶切消化及PCR扩增鉴定，得到1条预期约900bp的基因片段(图3)。
图3 重组pUC18/TK-质粒的酶切鉴定
Fig 3 Identification of the recombinant pUC18/TK- plasmid with EcoRI and Hind III
1:Negative control; 2:DNA molecular weight makers; 3,4,5,6 and 7:Positive colonies
, 百拇医药
2.3 pUC18/TK-重组质粒DNA的序列测定 序列测定的结果显示,pUC18/TK-重组质粒DNA缺失了HSV-117Syn+株TK基因第493～744位251对碱基序列，其余基因序列相同。缺失后的TK基因序列约为900bp(图4)。
图4 pUC18/TK-重组质粒的DNA序列
Fig 4 Nucleotide sequence of the recombinant plasmid pUC18/TK-
Dotted line shows deletion of nucleotide sequence
, 百拇医药
3 讨论
TK基因是肿瘤基因治疗中应用最多、最重要的药物敏感靶基因之一。将HSV-1TK基因克隆入腺病毒或逆转录病毒载体中，经包装细胞包装成对快速分裂的细胞具有感染性的重组病毒，将其感染肿瘤病毒细胞，使TK基因与肿瘤细胞基因组DNA整合，便可成为抗疱疹病毒核苷类药物(如无环鸟苷和丙氧鸟苷等)的靶基因，达到杀伤肿瘤细胞的目的。将TK基因去除一小段克隆入载体中，与野生型HSV-1TK基因组DNA在活细胞内重组后，可筛选出HSV-1TK基因部分缺失的突变株，这种突变株不能在正常神经胶质细胞中增殖，但能在胶质细胞瘤细胞等快速分裂的神经细胞中增殖并使之溶解破坏，因而可用重组的HSV-1TK基因部分缺失的突变株治疗神经胶质瘤等脑部的恶性肿瘤。
本研究采用生物工程技术，将HSV-117syn+TK基因的5′端503bp片段与3′端383bp片段连接，构建成缺失第493～744位251对碱基序列的TK基因载体，为构建TK基因部分缺失的重组HSV-1突变株，治疗神经胶质瘤等脑部恶性肿瘤奠定了基础。
, http://www.100md.com
*国家自然科学基金资助项目，NO.39570807
作者简介：甄荣芬，女，52岁，副教授。西安市长乐西路17号,Tel(029)3374536
参考文献
[1]Coen DM, Kosz-Vnenchak M, Jacobson JG, et al.Thymidine kinase-negative herpes simpex virus mutants establish lantency in mouse trigeminal but do not reactivate. Proc Natl Acad Sci USA,1989;86(12):4736～4740
[2]Robert LM, Amy M, James MM, et al. Exprimental therapy of human glioma by means of a genetically engineered virus mutant. Sience,1991; 252(5007):854～856
, 百拇医药
[3]James MM, Amy M, Donald MC. Reduction and elimination of encephalitis in an experimental glioma therapy model with attenuated herpes simplex mutants that retain susceptibility to acyclovir. Neurosurgery.1993; 32(4):597～603
[4]William WGJ, McDermott M, Goldie J, et al. Selective destruction of gliomas in immunocompetent rats by thymidine kinase-defective herpes simplex virus type 1. J Natl Cancer Inst, 1994; 86(13):1209～ 1215
[5]喻启桂,胡宁婕,薛采芳,等.单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因的扩增、克隆和测序.第四军医大学学报,1998;19(3):257～260。
收稿：1998-11-10
修回：1999-03-12, 百拇医药
单位：第四军医大学基础部抗感染研究室，西安，710032
关键词：单纯疱疹病毒；胸苷激酶基因；缺失突变；序列分析
细胞与分子免疫学杂志990203摘 要：目的：构建HSV-1型胸苷激酶基因部分缺失的重组质粒并进行序列测定。方法：以pUC18/TK重组质粒DNA为模板，用PCR方法扩增TK5′端503bp基因片段，并将扩增的片段克隆入载体pUC18中(pUC18/TK1)；用PstI和HindⅢ双酶切pUC18/TK，获得TK3′端383bp片段，将此酶切片段克隆入pUC18/TK1中，并进行测序。结果：构建成重组质粒pUC18/TK-。经酶切鉴定获得1条约900bp的基因片段；序列测定证实,HSV-1 17syn+TK基因缺失了第493～744位251对碱基。结论：成功地构建了部分缺失的HSV-1/TK-基因重组质粒，为研制其突变株奠定了基础。
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中国图书资料分类号：Q78R373.11
Construction and seguencing recombinat plasmid of the thymidine
kinase gene deletion mutation of herpes smplex virus type I
Zhen Rongfen, Yu Qigui, Chen Wei， Fan Rong, Xue Caifang
(Laboratory of Anti infectious Diseases,the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Keywords：herpes simplex virus thymidine kinase deletion mutation seguencing mutation
, 百拇医药
Abstract：Aim:Constructing and seguencing recombinated plasmid of the thymidine kinase gene deletion mutation of herpes smplex virus type I (HSV-1). Methods: The 5′-TK 503bp was amplified by PCR. And the TK genic DNA of HSV-1 17syn+ strain in the recombinated plasmid pUC18(pUC18/TK) was used as tamplate. The amplified fragment was cloned into pUC18 vector( pUC18/TK1). Then the pUC18/TK was cleaved with both pst I and Hind III enzymes. The 3′-TK 383bp fragment was obtained and cloned into plasmid pUC18/TK1. It's sequence was analysed. Results:The recombination plasmid pUC18/TK- was constructed. The 251 bp from location 493 to 744 of TK gene of HSV-1 17syn+ strain was deleted in the plasmid pUC18/TK- . The other part of the sequence did not vary. Conclusion:The recombinated plasmid of HSV-1/TK- in which part genome was delected was successfully constructed.The plasmid pUC18/TK- laid a good fundation for further constructing TK deletion mutant of HSV-1.
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单纯疱疹病毒I型(herpes simplex virus type I,HSV-I)的胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因为其早期基因,若发生突变则形成突变株[tk(-)HSV-I],能在鼠三叉神经节细胞等非分裂细胞中建立潜伏感染，但不能激活[1]，故对正常神经细胞无破坏作用。但tk(-)HSV-I能感染分裂细胞(如神经胶质瘤细胞和视网膜瘤细胞等)，并能在这些细胞中增殖，使之溶解破坏[2]。体外研究表明，tk(-)HSV-I突变株可杀伤U87和L19等神经胶质瘤细胞[3,4]。经皮下、肾包膜下及颅内右前叶直接注射tk(-)HSV-I突变株于荷神经胶质瘤的裸鼠及具有免疫活性的大鼠体内，可使肿瘤组织发生坏死，但不破坏正常组织。因此,本研究拟构建部分缺失的HSV-1/TK-基因重组质粒,以为进一步构建TK基因部分缺失的重组HSV-1突变株奠定基础。
1 材料和方法
1.1 质粒 重组质粒pUC18/TK(含HSV-1 17syn+株TK基因的全部编码区序列),由本室构建[5]。
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1.2 引物 通过计算机辅助分析，根据HSV-1 17syn+TK基因序列，在其5′端设计一段引物(引物1)，引入EcoRI酶切位点；根据HSV-1 17syn+TK基因第468～492位碱基序列，设计一段反向引物(引物2),并引入PstI酶切位点。引物由美国OperonTechnologies公司合成。其序列如：引物1:For:5′-CGGAATTCATGGCTTCGTACCCCTGCCATCA-3′引物2:Rev:5′-TACTGCAGATGGCGGTCGAAGATGAGGGTGA-3′
1.3 质粒的提取、酶切、连接及转录 主要方法均参照《分子克隆》一书进行。
1.4 HSV-1 17syn+TK基因部分序列(503bp)重组质粒的构建 PCR反应体系：模板为本室构建的重组质粒pUC18/TK600ng,引物1For和引物2Rev各1μmol/L，4种dNTP各200 μmol/L，3mmol/LMgCl2,5 μl10×PCR缓冲液，总体积50μ1。PCR反应液经100℃煮沸变性5min后，每管加入Taq聚合酶0.8U,以20μ1液体石蜡油封面后，进行PCR扩增：即94℃1min,60℃1min,72℃延伸90s,共35个循环。然后于72℃延伸10min。PCR产物在含0.5mg/L溴化乙锭(EB)的10g/L琼脂糖凝胶中电泳,在紫外灯下观察结果。经10g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳回收503bp片段。用SurePure DNA Extraction Kit(Embi Tec公司产品)纯化回收的DNA片段。经EcoR I和Pst I双酶切后,克隆入经相应酶切后制备的pUC18载体中,转化感受态JM109细菌。将得到的阳性克隆，经PCR及EcoR I和Pst I双酶切鉴定，命名为pUC18/TK1重组质粒。
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1.5 HSV-1TK基因部分缺失重组质粒的构建 用Pst I和Hind III双酶切pUC18/TK重组质粒，回收TK3′端383bp的片段；克隆入用同种酶切消化的pUC18/TK1中，转化感受态JM109细菌，将得到的阳性克隆，经PCR及EcoR I和Hind III双酶切鉴定，命名为pUC18/TK-重组质粒(图1)。
图1 pUC18/TK-重组质粒的构建
Fig 1 Construction of recombinat plasmid pUC18/TK-
1.6 pUC18/TK-序列的测定 pUC18/TK-重组质粒经用QIAGEN公司产品QIAamp Tip25-Kit纯化后，由美国夏威夷大学生物中心Neil博士在Applied Biosystems Model 373A Version全自动序分析仪中进行[5]测序。
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2 结果
2.1 pUC18/TK1重组质粒DNA的鉴定 用引物1For和引物2Rev，对pUC18/TK重质粒进行扩增。将扩增产物克隆入pUC18载体中，经转化得到的阳性克隆，用EcoR I及Pst I双酶切和PCR鉴定，获得预期的503bp基因片段(图2)。
图2 重组pUC18/TK1的PCR鉴定
Fig 2 Identification of the recombinant plasmid pUC18/TK1 by PCR
1,2,3 and 5: Positive colonies;4 and 9: DNA molecular weight markers;6 and 7: Negative colonies
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2.2 pUC18/TK-重组质粒DNA的鉴定 将构建的pUC18/TK-重组质粒，用EcoR I和Hind III双酶切消化及PCR扩增鉴定，得到1条预期约900bp的基因片段(图3)。
图3 重组pUC18/TK-质粒的酶切鉴定
Fig 3 Identification of the recombinant pUC18/TK- plasmid with EcoRI and Hind III
1:Negative control; 2:DNA molecular weight makers; 3,4,5,6 and 7:Positive colonies
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2.3 pUC18/TK-重组质粒DNA的序列测定 序列测定的结果显示,pUC18/TK-重组质粒DNA缺失了HSV-117Syn+株TK基因第493～744位251对碱基序列，其余基因序列相同。缺失后的TK基因序列约为900bp(图4)。
图4 pUC18/TK-重组质粒的DNA序列
Fig 4 Nucleotide sequence of the recombinant plasmid pUC18/TK-
Dotted line shows deletion of nucleotide sequence
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3 讨论
TK基因是肿瘤基因治疗中应用最多、最重要的药物敏感靶基因之一。将HSV-1TK基因克隆入腺病毒或逆转录病毒载体中，经包装细胞包装成对快速分裂的细胞具有感染性的重组病毒，将其感染肿瘤病毒细胞，使TK基因与肿瘤细胞基因组DNA整合，便可成为抗疱疹病毒核苷类药物(如无环鸟苷和丙氧鸟苷等)的靶基因，达到杀伤肿瘤细胞的目的。将TK基因去除一小段克隆入载体中，与野生型HSV-1TK基因组DNA在活细胞内重组后，可筛选出HSV-1TK基因部分缺失的突变株，这种突变株不能在正常神经胶质细胞中增殖，但能在胶质细胞瘤细胞等快速分裂的神经细胞中增殖并使之溶解破坏，因而可用重组的HSV-1TK基因部分缺失的突变株治疗神经胶质瘤等脑部的恶性肿瘤。
本研究采用生物工程技术，将HSV-117syn+TK基因的5′端503bp片段与3′端383bp片段连接，构建成缺失第493～744位251对碱基序列的TK基因载体，为构建TK基因部分缺失的重组HSV-1突变株，治疗神经胶质瘤等脑部恶性肿瘤奠定了基础。
, http://www.100md.com
*国家自然科学基金资助项目，NO.39570807
作者简介：甄荣芬，女，52岁，副教授。西安市长乐西路17号,Tel(029)3374536
参考文献
[1]Coen DM, Kosz-Vnenchak M, Jacobson JG, et al.Thymidine kinase-negative herpes simpex virus mutants establish lantency in mouse trigeminal but do not reactivate. Proc Natl Acad Sci USA,1989;86(12):4736～4740
[2]Robert LM, Amy M, James MM, et al. Exprimental therapy of human glioma by means of a genetically engineered virus mutant. Sience,1991; 252(5007):854～856
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[3]James MM, Amy M, Donald MC. Reduction and elimination of encephalitis in an experimental glioma therapy model with attenuated herpes simplex mutants that retain susceptibility to acyclovir. Neurosurgery.1993; 32(4):597～603
[4]William WGJ, McDermott M, Goldie J, et al. Selective destruction of gliomas in immunocompetent rats by thymidine kinase-defective herpes simplex virus type 1. J Natl Cancer Inst, 1994; 86(13):1209～ 1215
[5]喻启桂,胡宁婕,薛采芳,等.单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因的扩增、克隆和测序.第四军医大学学报,1998;19(3):257～260。
收稿：1998-11-10
修回：1999-03-12, 百拇医药