抗人F蛋白单克隆抗体的制备和鉴定
作者：刘军权 陈复兴 姚仁南 徐荣佳 陈晓英 骆晓梅
单位：刘军权(解放 军97医院实验科，江苏徐州221004)；陈复兴(解放 军97医院实验科，江苏徐州221004)；姚仁南(解放 军97医院实验科，江苏徐州221004)；徐荣佳(解放 军97医院实验科，江苏徐州221004)；陈晓英(解放 军97医院实验科，江苏徐州221004)；骆晓梅(解放 军97医院实验科，江苏徐州221004)
关键词：F蛋白；单克隆抗体；肝脏
细胞与分子免疫学杂志000227
中图号：R392.11 文献标识码：B
文章编号：1007-8738(2000)02-0166-02
F蛋白是存在于哺乳动物肝细胞质中的一种水溶性不稳定的单链蛋白质，相对分子质量(Mr)为44000。正常人肝组织中大约含F蛋白274mg/g〔1,2〕，而血清中仅含0.2mg/L，提示血清F蛋白作为判断肝损伤程度的可能性。为对F蛋白进行深入研究，并提高对其检测的灵敏度，1995年以来，我们先后制备了3株抗人F蛋白的单克隆抗体(mAb)，并进行了初步鉴定。
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1 材料和方法
1.1 材料 人F蛋白抗原的制备〔3〕:取肝外伤手术切除的新鲜肝组织50g，剪成约5mm3的组织碎块后，置于含有1g/LIV型胶原酶(Sigma)、0.02g/LI型DNA酶和0.1g/LV型透明质酸酶的RPMI1640培养液中，于4℃下磁力搅拌6h。将经酶消化的细胞悬液通过钢网(孔径0.152mm)，去除未消化的组织块。离心(4000g×15min)，收集单个细胞，用生理盐水洗涤3次，加入重蒸水至100mL。用超声波粉碎机(JY-II型)粉碎细胞后，离心(15000g×30min)。取上清，用550g/L饱和硫酸铵盐析，取沉淀物溶解透析，即为粗制的F蛋白抗原。将其经制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后，根据蛋白标准的相对分子质量(Mr，中国科学院上海生化所东风生物技术公司产品)显示的区带，切取Mr约44000的凝胶。提取凝胶中的蛋白，再经分析型PAGE分析，在Mr约为44000处可见1条较浓集的单一区带，即为纯化的人F蛋白抗 原。
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1.2 方法 取纯化的人F蛋白600mg/L0.25mL加等量福氏完全佐剂，腹腔注入Ba1b/c小鼠(雄性，体重约19g，引自南京军区总医院)初次免疫。7d和14d后，分别以150μg的F蛋白加福氏不完全佐剂同上免疫动物。间隔7d和10d，进行第4，5次免疫，免疫原为无佐剂的F蛋白150μg。末次免疫后3d，处死动物，取其脾细胞。按常规方法进行融合、筛选及克隆化，并制备腹水。mAb的特性鉴定：①效价测定：采用间接ELISA法。②Ig亚类测定：由南京军区总医院微生物科协助完成。③特异性鉴定：采用免疫组化染色法，取肝癌患者手术切除的标本中的正常组织(经病理鉴定为正常的肝组织)，常规固定切片、脱蜡后，以50mL/LH2O2甲醇灭活内源性过氧化物酶并固定30min，再以100mL/L小牛血清封闭(37℃30min)。加不同稀释度(1∶100和1∶1000)的mAb腹水(以含100mL/L小牛血清的PBS稀释；阴性对照加正常小鼠血清)，37℃作用45min后，洗涤3次。加HRP-羊抗小鼠IgG(1∶50，上海生物制品所提供)，同上作用及洗涤后，加400mg/L的DAB(0.03mL/LH2O2)显色，并以美兰复染、封片，观察结果。
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2 结果
经细胞融合、筛选和克隆化，获得3株能稳定分泌抗人F蛋白mAb的杂交瘤细胞，命名为4F2，1G3和2B11。3株杂交瘤细胞培养上清中的mAb滴度为1×10-2～1×10-3；腹水中mAb的滴度为1×10-5～1×10-6。mAb的Ig亚类分别为IgG2(4F2)，IgG1(1G3)和IgG1(2B11)。免疫组化的结果表明，3株mAb均能与肝细胞浆内容物结合，而不与血管上皮细胞及纤维组织相结合(图1)。
图1 3株抗人F蛋白mAb对正常肝组织切片的
免疫组化染色鉴定 (免疫过氧化物酶法×400)
注：A：阴性对照;B：4F2;C：1G3;D：2B11.
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3 讨论
自80年代以来，美、英和日本学者已对血清中F蛋白的含量及其与肝脏的关系进行了研究。F蛋白至少有两种表位：一种具有种属特异性；另一种为人类所特有，后者具有较强的抗原性。在肝病患者的血清中，F蛋白较其它检测指标如：甲胎蛋白、谷丙转氨酶和碱性磷酸酶等的参考意义更大〔2〕，可反映肝病的病程、疗效、愈后及肝损伤程度，是一种较为灵 敏而特异的肝功能指标。
我们以盐析法及制备型PAGE提取抗原，建立了3株分泌抗人F蛋白mAb的杂交瘤细胞。免疫组化鉴定证实，提取的F蛋白具有良好的特异性，即只与肝细胞浆结合。目前，国内只有抗人肝F蛋白多克隆抗体制备的报道〔4，5〕，但尚未见应用于临床。因此，本文的结果将对人F蛋白结构和功能的研究，以及用于临床作为判定肝脏疾病的指标，提供重要的试剂。
作者简介：刘军权，男，38岁，主治医师 徐州市铜山路226号，Tel.(0516)3462954-2244 返回主列表(ReturntoMainList)
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参考文献：
〔1〕 David O, Bulk BG. Immunopurification and development of a radioimmunoassay for human and murine F liver protein〔J〕.J Immunol Meth, 1986;91:99-105.
〔2〕 Beckett GJ, Foster GR, Hussey AJ, et al. Plasma glutathiones transferase and F protein are more sensitive than alanine aminotransferase as markers of paracetamol (acetainophen)- induced liver damage〔J〕.Clin Chem,1989;11:2186-2189.
〔3〕 Mihas AA, Saccomam G. Isolation and characterization of a liver- specific antigen(F-Ag) from humanliver〔J〕.Immunochemistry, 1977;14:727-731.
〔4〕牛惠生，李怀芬，袁明月，等.肝F蛋白的提纯与鉴定〔J〕.中西医结合肝病杂志，1994；4(1):18-20.
收稿日期：1999-06-14
修回日期：1999-07-13, http://www.100md.com
单位：刘军权(解放 军97医院实验科，江苏徐州221004)；陈复兴(解放 军97医院实验科，江苏徐州221004)；姚仁南(解放 军97医院实验科，江苏徐州221004)；徐荣佳(解放 军97医院实验科，江苏徐州221004)；陈晓英(解放 军97医院实验科，江苏徐州221004)；骆晓梅(解放 军97医院实验科，江苏徐州221004)
关键词：F蛋白；单克隆抗体；肝脏
细胞与分子免疫学杂志000227
中图号：R392.11 文献标识码：B
文章编号：1007-8738(2000)02-0166-02
F蛋白是存在于哺乳动物肝细胞质中的一种水溶性不稳定的单链蛋白质，相对分子质量(Mr)为44000。正常人肝组织中大约含F蛋白274mg/g〔1,2〕，而血清中仅含0.2mg/L，提示血清F蛋白作为判断肝损伤程度的可能性。为对F蛋白进行深入研究，并提高对其检测的灵敏度，1995年以来，我们先后制备了3株抗人F蛋白的单克隆抗体(mAb)，并进行了初步鉴定。
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1 材料和方法
1.1 材料 人F蛋白抗原的制备〔3〕:取肝外伤手术切除的新鲜肝组织50g，剪成约5mm3的组织碎块后，置于含有1g/LIV型胶原酶(Sigma)、0.02g/LI型DNA酶和0.1g/LV型透明质酸酶的RPMI1640培养液中，于4℃下磁力搅拌6h。将经酶消化的细胞悬液通过钢网(孔径0.152mm)，去除未消化的组织块。离心(4000g×15min)，收集单个细胞，用生理盐水洗涤3次，加入重蒸水至100mL。用超声波粉碎机(JY-II型)粉碎细胞后，离心(15000g×30min)。取上清，用550g/L饱和硫酸铵盐析，取沉淀物溶解透析，即为粗制的F蛋白抗原。将其经制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后，根据蛋白标准的相对分子质量(Mr，中国科学院上海生化所东风生物技术公司产品)显示的区带，切取Mr约44000的凝胶。提取凝胶中的蛋白，再经分析型PAGE分析，在Mr约为44000处可见1条较浓集的单一区带，即为纯化的人F蛋白抗 原。
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1.2 方法 取纯化的人F蛋白600mg/L0.25mL加等量福氏完全佐剂，腹腔注入Ba1b/c小鼠(雄性，体重约19g，引自南京军区总医院)初次免疫。7d和14d后，分别以150μg的F蛋白加福氏不完全佐剂同上免疫动物。间隔7d和10d，进行第4，5次免疫，免疫原为无佐剂的F蛋白150μg。末次免疫后3d，处死动物，取其脾细胞。按常规方法进行融合、筛选及克隆化，并制备腹水。mAb的特性鉴定：①效价测定：采用间接ELISA法。②Ig亚类测定：由南京军区总医院微生物科协助完成。③特异性鉴定：采用免疫组化染色法，取肝癌患者手术切除的标本中的正常组织(经病理鉴定为正常的肝组织)，常规固定切片、脱蜡后，以50mL/LH2O2甲醇灭活内源性过氧化物酶并固定30min，再以100mL/L小牛血清封闭(37℃30min)。加不同稀释度(1∶100和1∶1000)的mAb腹水(以含100mL/L小牛血清的PBS稀释；阴性对照加正常小鼠血清)，37℃作用45min后，洗涤3次。加HRP-羊抗小鼠IgG(1∶50，上海生物制品所提供)，同上作用及洗涤后，加400mg/L的DAB(0.03mL/LH2O2)显色，并以美兰复染、封片，观察结果。
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2 结果
经细胞融合、筛选和克隆化，获得3株能稳定分泌抗人F蛋白mAb的杂交瘤细胞，命名为4F2，1G3和2B11。3株杂交瘤细胞培养上清中的mAb滴度为1×10-2～1×10-3；腹水中mAb的滴度为1×10-5～1×10-6。mAb的Ig亚类分别为IgG2(4F2)，IgG1(1G3)和IgG1(2B11)。免疫组化的结果表明，3株mAb均能与肝细胞浆内容物结合，而不与血管上皮细胞及纤维组织相结合(图1)。
图1 3株抗人F蛋白mAb对正常肝组织切片的
免疫组化染色鉴定 (免疫过氧化物酶法×400)
注：A：阴性对照;B：4F2;C：1G3;D：2B11.
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3 讨论
自80年代以来，美、英和日本学者已对血清中F蛋白的含量及其与肝脏的关系进行了研究。F蛋白至少有两种表位：一种具有种属特异性；另一种为人类所特有，后者具有较强的抗原性。在肝病患者的血清中，F蛋白较其它检测指标如：甲胎蛋白、谷丙转氨酶和碱性磷酸酶等的参考意义更大〔2〕，可反映肝病的病程、疗效、愈后及肝损伤程度，是一种较为灵 敏而特异的肝功能指标。
我们以盐析法及制备型PAGE提取抗原，建立了3株分泌抗人F蛋白mAb的杂交瘤细胞。免疫组化鉴定证实，提取的F蛋白具有良好的特异性，即只与肝细胞浆结合。目前，国内只有抗人肝F蛋白多克隆抗体制备的报道〔4，5〕，但尚未见应用于临床。因此，本文的结果将对人F蛋白结构和功能的研究，以及用于临床作为判定肝脏疾病的指标，提供重要的试剂。
作者简介：刘军权，男，38岁，主治医师 徐州市铜山路226号，Tel.(0516)3462954-2244 返回主列表(ReturntoMainList)
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参考文献：
〔1〕 David O, Bulk BG. Immunopurification and development of a radioimmunoassay for human and murine F liver protein〔J〕.J Immunol Meth, 1986;91:99-105.
〔2〕 Beckett GJ, Foster GR, Hussey AJ, et al. Plasma glutathiones transferase and F protein are more sensitive than alanine aminotransferase as markers of paracetamol (acetainophen)- induced liver damage〔J〕.Clin Chem,1989;11:2186-2189.
〔3〕 Mihas AA, Saccomam G. Isolation and characterization of a liver- specific antigen(F-Ag) from humanliver〔J〕.Immunochemistry, 1977;14:727-731.
〔4〕牛惠生，李怀芬，袁明月，等.肝F蛋白的提纯与鉴定〔J〕.中西医结合肝病杂志，1994；4(1):18-20.
收稿日期：1999-06-14
修回日期：1999-07-13, http://www.100md.com