宫颈癌细胞系SiHa中HPV16E6，E7蛋白的表达
作者：陈必良 马向东 王春梅 王德堂 辛晓燕
单位：陈必良(第四军医大学 西京医院妇产科)；马向东(第四军医大学 西京医院妇产科)；王春梅(中心实验室，陕西西安710032)；王德堂(第四军医大学 西京医院妇产科)；辛晓燕(第四军医大学 西京医院妇产科)
关键词：宫颈癌；乳头瘤病毒；免疫荧光；激光扫描共聚；焦显微镜
细胞与分子免疫学杂志000223
中图号：R373.9 文献标识码：B
文章编号：1007-8738(2000)02-0158-02
我们应用免疫荧光染色结合激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)，观察了宫颈癌细胞系SiHa中HPV16型(human papillomavirus type16)E6，E7基因区产物E6，E7蛋白的表达。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料 含HPV基因的宫颈癌细胞系SiHa，由西安医科大学分子生物研究中心李旭教授提供。用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基(Gibco公司)常规培养后，滴于盖玻片培养，制成单层细胞爬片。
1.2 方法 免疫荧光染色用正常羊血清封闭细胞爬片30min，在各细胞爬片上分别加入鼠抗HPVE6的mAb和抗E7的mAb(Zymed公司产品，1∶1000)，37℃孵育1h，用PBS洗涤10min×3次。然后分别加入标记得克萨斯红荧光素(TRITC,北京中山公司产 品)的羊抗鼠IgG(Jackson公司，1∶200)及(异硫氰酸荧光素FITC，北京中山公司)标记的羊抗鼠IgG(Zymed公司，1∶50)，于37℃孵育30min，同上洗涤，在LSCM下观察结果并拍照。实验中以无关抗出血热病毒的抗体(本校病理学教研室提供)代替一抗为阴性对照，以PBS代替一抗为空白对照。所用LSCM的型号为Bio-RadMRC-1024，装有Zeis100显微镜，用于TRITC的激发波长为568nm，用于FITC的波长为488nm。共聚焦系统由Bio-Rad公司提供的Lasersharp软件控制，在peutium90计算机上运行。显微镜聚焦旋钮由步进马达控制，图象采集的显微镜物镜为Plan-Neofluar油浸镜(×40),数值孔径为1.3，图象存为512×512相素类型。扫描所用激光值为3%。
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2 结果
宫颈癌细胞SiHa的免疫荧光染色结果显示，HPV16E6呈鲜艳的红色阳性荧光信号遍布于整个胞质中(图1A)。同时，胞质内呈现HPV16E7明亮的绿色阳性荧光(图1B)，阴性对照和 空白对照的免疫荧光染色均呈阴性。
图1 SiHa细胞中HPV 16 E6蛋白的表达(×400)
A：用TRITC标记的羊抗鼠IgG染色；B：用FITC标记的羊抗鼠IgG染色.
3 讨论
HPV感染，尤其是HPV16型感染是宫颈癌发生的重要原因[1]。应用LSCM技术，对HPV阳性的宫颈癌细胞SiHa中E6，E7蛋白的表达进行了定性和定位分析。证实HPV16E6，E7基因在SiHa细胞胞质中呈强阳性表达，提示HPV16基因在该细胞中有整合及表达，这对于宫颈癌的发生可能具有重要的意义。
, 百拇医药
LSCM是集光镜、激光、电子摄像及微机数字图像处理功能为一体的现代化高精密仪器，结合荧光染料的应用，为活细胞结构及功能的研究开拓了一条新的领域[2]。LSCM是采用荧光标记的特异性抗体，与细胞特定抗原相结合，而进行定性、定位及细胞形态学分析[3]，并可对肿瘤细胞抗原的表达、细胞结构及其离子进行分析，同时可对细胞间通讯进行研究提供理想的手段，因此，必将在基础和临床研究中得到广泛应用[4]。
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39400140
作者简介：陈必良，男，37岁，副教授，硕士西安市长乐西路15号，Tel.(029)3375429
参考文献：
〔1〕 Hu G,Liu W,Mendelsohn J,et al.Expression of epidermal growth factor receptor and human papillomavirus E6/E7 proteins in cervical carcinoma cells〔J〕.J Natl Cancer Inst,1997;89(17):1271-1276.
, 百拇医药
〔2〕 Demandolx D,Davoust J.Multicolour analysis and local image correlation in confocal microscopy〔J〕.J Microsc,1997;185:21-36.
〔3〕 王春梅，黄晓峰，臧益民，等.激光扫描共聚显微镜原理及其在医学研究中的应用〔3〕.第四军医大学学报,1997;18(专刊): 59-62.
〔4〕 Bergfelt L,Emilson A,Lindberg M,et al.Quantitative and 3-dimensional analysis of Langerhans cells in based cell carcinoma,a comparative study using light and confocal laser scanning microscopy〔J〕.Br J Biol Chem,1994;130:273-281.
收稿日期：1999-04-14
修回日期：1999-06-21, http://www.100md.com
单位：陈必良(第四军医大学 西京医院妇产科)；马向东(第四军医大学 西京医院妇产科)；王春梅(中心实验室，陕西西安710032)；王德堂(第四军医大学 西京医院妇产科)；辛晓燕(第四军医大学 西京医院妇产科)
关键词：宫颈癌；乳头瘤病毒；免疫荧光；激光扫描共聚；焦显微镜
细胞与分子免疫学杂志000223
中图号：R373.9 文献标识码：B
文章编号：1007-8738(2000)02-0158-02
我们应用免疫荧光染色结合激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)，观察了宫颈癌细胞系SiHa中HPV16型(human papillomavirus type16)E6，E7基因区产物E6，E7蛋白的表达。
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1 材料与方法
1.1 材料 含HPV基因的宫颈癌细胞系SiHa，由西安医科大学分子生物研究中心李旭教授提供。用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基(Gibco公司)常规培养后，滴于盖玻片培养，制成单层细胞爬片。
1.2 方法 免疫荧光染色用正常羊血清封闭细胞爬片30min，在各细胞爬片上分别加入鼠抗HPVE6的mAb和抗E7的mAb(Zymed公司产品，1∶1000)，37℃孵育1h，用PBS洗涤10min×3次。然后分别加入标记得克萨斯红荧光素(TRITC,北京中山公司产 品)的羊抗鼠IgG(Jackson公司，1∶200)及(异硫氰酸荧光素FITC，北京中山公司)标记的羊抗鼠IgG(Zymed公司，1∶50)，于37℃孵育30min，同上洗涤，在LSCM下观察结果并拍照。实验中以无关抗出血热病毒的抗体(本校病理学教研室提供)代替一抗为阴性对照，以PBS代替一抗为空白对照。所用LSCM的型号为Bio-RadMRC-1024，装有Zeis100显微镜，用于TRITC的激发波长为568nm，用于FITC的波长为488nm。共聚焦系统由Bio-Rad公司提供的Lasersharp软件控制，在peutium90计算机上运行。显微镜聚焦旋钮由步进马达控制，图象采集的显微镜物镜为Plan-Neofluar油浸镜(×40),数值孔径为1.3，图象存为512×512相素类型。扫描所用激光值为3%。
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2 结果
宫颈癌细胞SiHa的免疫荧光染色结果显示，HPV16E6呈鲜艳的红色阳性荧光信号遍布于整个胞质中(图1A)。同时，胞质内呈现HPV16E7明亮的绿色阳性荧光(图1B)，阴性对照和 空白对照的免疫荧光染色均呈阴性。
图1 SiHa细胞中HPV 16 E6蛋白的表达(×400)
A：用TRITC标记的羊抗鼠IgG染色；B：用FITC标记的羊抗鼠IgG染色.
3 讨论
HPV感染，尤其是HPV16型感染是宫颈癌发生的重要原因[1]。应用LSCM技术，对HPV阳性的宫颈癌细胞SiHa中E6，E7蛋白的表达进行了定性和定位分析。证实HPV16E6，E7基因在SiHa细胞胞质中呈强阳性表达，提示HPV16基因在该细胞中有整合及表达，这对于宫颈癌的发生可能具有重要的意义。
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LSCM是集光镜、激光、电子摄像及微机数字图像处理功能为一体的现代化高精密仪器，结合荧光染料的应用，为活细胞结构及功能的研究开拓了一条新的领域[2]。LSCM是采用荧光标记的特异性抗体，与细胞特定抗原相结合，而进行定性、定位及细胞形态学分析[3]，并可对肿瘤细胞抗原的表达、细胞结构及其离子进行分析，同时可对细胞间通讯进行研究提供理想的手段，因此，必将在基础和临床研究中得到广泛应用[4]。
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39400140
作者简介：陈必良，男，37岁，副教授，硕士西安市长乐西路15号，Tel.(029)3375429
参考文献：
〔1〕 Hu G,Liu W,Mendelsohn J,et al.Expression of epidermal growth factor receptor and human papillomavirus E6/E7 proteins in cervical carcinoma cells〔J〕.J Natl Cancer Inst,1997;89(17):1271-1276.
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〔2〕 Demandolx D,Davoust J.Multicolour analysis and local image correlation in confocal microscopy〔J〕.J Microsc,1997;185:21-36.
〔3〕 王春梅，黄晓峰，臧益民，等.激光扫描共聚显微镜原理及其在医学研究中的应用〔3〕.第四军医大学学报,1997;18(专刊): 59-62.
〔4〕 Bergfelt L,Emilson A,Lindberg M,et al.Quantitative and 3-dimensional analysis of Langerhans cells in based cell carcinoma,a comparative study using light and confocal laser scanning microscopy〔J〕.Br J Biol Chem,1994;130:273-281.
收稿日期：1999-04-14
修回日期：1999-06-21, http://www.100md.com