流式细胞仪国产鞘液的研制
作者：曹云新 程司 刘智广 张晓楠
单位：曹云新(第四军医大学中心实 验室，陕西西安710032)；程司(第四军医大学中心实 验室，陕西西安710032)；刘智广(第四军医大学中心实 验室，陕西西安710032)；张晓楠(第四军医大学中心实 验室，陕西西安710032)
关键词：鞘液；研制；流式细胞仪
细胞与分子免疫学杂志000232
中图号：R446.11+3 文献标识码：B
文章编号：1007-8738(2000)02-0176-02
流式细胞仪(FCM)已成为当代分析细胞学领域检测细胞分子特征的主要工具之一，在医学、生物学和肿瘤学等学科中得到广泛应用〔1，2〕。FCM所用的鞘液是维持仪器正常运转的主要消耗试剂，其主要作用是经荧光染色的单细胞悬液和鞘液同时进入流动室，在气体压力的作用下，形成包绕细胞悬液的壳液流，使细胞依次排列成单行，一个跟一个地以均等的速度通过检测区，而得到精确测量〔3〕。与仪器配套的Coulter鞘液消耗量大(从开机到停机一直连续使用)，需用外汇进口，不仅价格较高，而且周期较长。为解决这一问题，我们经过两年半的反复试验，研制出与Coulter鞘液具有同样效果的鞘液，经1年来的使用，证明自制试剂可完全代替进口试剂。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 ESPIC Elite ESP流式细胞仪、Q-PREP免疫学样品制备仪和低速台式离心机，为上海安亭科学仪器厂产品。标准荧光球，抗CD3mAb-FITC，MSIgG1-FITC和DNA-PrepReagent(DNA染色试
剂盒)，均为美国Coulter公司产品。
1.2 方法 自制鞘液的配制参照Coulter公司试剂配方略有改进，由氯化钠、氯化钾、磷酸缓冲液(pH7.3～7.4)和防腐剂配制而成。所用试剂均为国产试剂，配制用水为双蒸馏水。①试剂比较试验：用进口鞘液和自制鞘液分别对标准荧光球、免疫荧光样品(人外周血淋巴细胞CD3)和细胞周期分析样品进行对比试验，比较标准荧光球的变异系数(CV%)、CD3+T细胞亚群表达率和荧光强度，以及细胞周期各时相的百分比。②稳定性试验：将自制鞘液室温放置0，30，180和360d，用标准荧光球鉴定 自制鞘液的稳定性和保存时间。
, 百拇医药
统计学处理：分别计算两种鞘液对标准荧光球、CD3+T细胞和细胞周期各时相的均数与标准差，并做t检验。
2 结果
自制鞘液与进口鞘液对标准荧光球的FCM测定结果相似(P>0.05,表1)；免疫荧光样品的FCM测定结果相似(P>0.05，图1，表2)；细胞周期各时相的FCM测定结果相似(P>0.05，表3)。本实验的结果表明，自制鞘液的灵敏度、分辨率与进口鞘液基本一致。将自制鞘液在室温下放置不同时间，对标准荧光球进行测定结果也基本相同(P>0.05)，表明自制 鞘液在室温下最少可放置1年(表4)。
图1 两种鞘液对CD3+T细胞测定的直方图
表1 两种鞘液对标准荧光球的测定结果 测定指标
, http://www.100md.com
自制鞘液
进口鞘液
荧光(
±S)
CV%
荧光(±S)
CV%
前向光
450.2±7.5a
0.95
451.9±7.3
, 百拇医药
0.99
绿色荧光
438.4±8.3a
1.07
439.8±8.1
1.13
橙色荧光
430.1±8.7a
1.16
432.1±8.9
1.19
红色荧光
, 百拇医药
439.2±8.1a
1.09
440.3±8.5
1.07
aP>0.05 vs 进口鞘液.表2 两种鞘液对CD3+T细胞的测定 试剂
CD3+细胞(%)
CD3+分子的
荧光强度(+S)
自制鞘液
, http://www.100md.com
72.7±6.1a
7.89±2.89a
进口鞘液
73.1±5.4
7.78±2.85
aP>0.05 vs 进口鞘液.表3 两种鞘液对细胞周期各时相的测定 测定指标
自制鞘液
进口鞘液
G1期细胞%
78.6±2.7a
, 百拇医药
79.1±2.6
S期细胞%
10.4±1.3a
10.2±1.7
G2期细胞%
11.0±2.1a
10.7±1.9
DNA荧光强度
80.8±2.4a
81.1±2.2
aP>0.05vs进口鞘液.表4 用标准荧光球对自制鞘液稳定性的试验 测定指标
, 百拇医药
0d
30d
180d
360d
荧光(+S)
CV(%)
荧光(+S)
CV(%)
荧光(+S)
, http://www.100md.com
CV(%)
荧光(+S)
CV(%)
前向光
452.9±7.6
0.91
451.2±7.5
0.98
451.7±7.9
1.01
450.2±8.2
, http://www.100md.com
1.09
绿色荧光
438.4±8.7
1.09
439.8±8.8
1.11
438.9±8.2
1.17
437.5±9.0
1.13
橙色荧光
431.1±8.2
, http://www.100md.com
1.12
432.1±8.4
1.13
430.9±8.7
1.16
431.7±8.7
1.17
红色荧光
439.2±8.3
1.06
438.8±8.1
1.04
, 百拇医药
437.7±9.0
1.08
437.2±8.9
1.12
3 讨论
鞘液是流式细胞仪分析检测样品的必备试剂，其质量如何直接影响测定的结果。我们在研制鞘液的过程中，发现劣质试剂尤其是含杂质多、荧光成分多的试剂，在波长488nm激发光的照射下会产生杂峰，虽然对于高表达标志物的测定影响不大，但测定低表达标志物的荧光强度时，可使测定结果与实际值产生较大偏差。因此，在配制鞘液时，应选择纯度较高的试剂和水，鞘液的pH值应调到7.0～7.5范围内，同时注意等渗条件，以不破坏细胞的完整性为原则。总之，我们配制的鞘液经实验结果表明,完全可以代替进口鞘液，且保存期较长、成本较低，有利于FCM的普及使用。
, 百拇医药
作者简介：曹云新，女，40岁，实验师 西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374573
参考文献：
〔1〕左连富.流式细胞术与生物医学〔M〕.沈阳:辽宁科学 技术出版社,1996：8-9.
〔2〕曹云新，刘智广.流式细胞仪全血白细胞样品制备试
剂的研究〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,1999;15(2)：156-158.
〔3〕宋根平，李素文.流式细胞术的原理和应用〔M〕.北京 ：北京师范大学出版社，1992：9-35.
收稿日期：1999-10-15
修回日期：1999-11-02, 百拇医药
单位：曹云新(第四军医大学中心实 验室，陕西西安710032)；程司(第四军医大学中心实 验室，陕西西安710032)；刘智广(第四军医大学中心实 验室，陕西西安710032)；张晓楠(第四军医大学中心实 验室，陕西西安710032)
关键词：鞘液；研制；流式细胞仪
细胞与分子免疫学杂志000232
中图号：R446.11+3 文献标识码：B
文章编号：1007-8738(2000)02-0176-02
流式细胞仪(FCM)已成为当代分析细胞学领域检测细胞分子特征的主要工具之一，在医学、生物学和肿瘤学等学科中得到广泛应用〔1，2〕。FCM所用的鞘液是维持仪器正常运转的主要消耗试剂，其主要作用是经荧光染色的单细胞悬液和鞘液同时进入流动室，在气体压力的作用下，形成包绕细胞悬液的壳液流，使细胞依次排列成单行，一个跟一个地以均等的速度通过检测区，而得到精确测量〔3〕。与仪器配套的Coulter鞘液消耗量大(从开机到停机一直连续使用)，需用外汇进口，不仅价格较高，而且周期较长。为解决这一问题，我们经过两年半的反复试验，研制出与Coulter鞘液具有同样效果的鞘液，经1年来的使用，证明自制试剂可完全代替进口试剂。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 ESPIC Elite ESP流式细胞仪、Q-PREP免疫学样品制备仪和低速台式离心机，为上海安亭科学仪器厂产品。标准荧光球，抗CD3mAb-FITC，MSIgG1-FITC和DNA-PrepReagent(DNA染色试
剂盒)，均为美国Coulter公司产品。
1.2 方法 自制鞘液的配制参照Coulter公司试剂配方略有改进，由氯化钠、氯化钾、磷酸缓冲液(pH7.3～7.4)和防腐剂配制而成。所用试剂均为国产试剂，配制用水为双蒸馏水。①试剂比较试验：用进口鞘液和自制鞘液分别对标准荧光球、免疫荧光样品(人外周血淋巴细胞CD3)和细胞周期分析样品进行对比试验，比较标准荧光球的变异系数(CV%)、CD3+T细胞亚群表达率和荧光强度，以及细胞周期各时相的百分比。②稳定性试验：将自制鞘液室温放置0，30，180和360d，用标准荧光球鉴定 自制鞘液的稳定性和保存时间。
, 百拇医药
统计学处理：分别计算两种鞘液对标准荧光球、CD3+T细胞和细胞周期各时相的均数与标准差，并做t检验。
2 结果
自制鞘液与进口鞘液对标准荧光球的FCM测定结果相似(P>0.05,表1)；免疫荧光样品的FCM测定结果相似(P>0.05，图1，表2)；细胞周期各时相的FCM测定结果相似(P>0.05，表3)。本实验的结果表明，自制鞘液的灵敏度、分辨率与进口鞘液基本一致。将自制鞘液在室温下放置不同时间，对标准荧光球进行测定结果也基本相同(P>0.05)，表明自制 鞘液在室温下最少可放置1年(表4)。
图1 两种鞘液对CD3+T细胞测定的直方图
表1 两种鞘液对标准荧光球的测定结果 测定指标
, http://www.100md.com
自制鞘液
进口鞘液
荧光(
±S)CV%
荧光(
±S)CV%
前向光
450.2±7.5a
0.95
451.9±7.3
, 百拇医药
0.99
绿色荧光
438.4±8.3a
1.07
439.8±8.1
1.13
橙色荧光
430.1±8.7a
1.16
432.1±8.9
1.19
红色荧光
, 百拇医药
439.2±8.1a
1.09
440.3±8.5
1.07
aP>0.05 vs 进口鞘液.表2 两种鞘液对CD3+T细胞的测定 试剂
CD3+细胞(%)
CD3+分子的
荧光强度(
+S)自制鞘液
, http://www.100md.com
72.7±6.1a
7.89±2.89a
进口鞘液
73.1±5.4
7.78±2.85
aP>0.05 vs 进口鞘液.表3 两种鞘液对细胞周期各时相的测定 测定指标
自制鞘液
进口鞘液
G1期细胞%
78.6±2.7a
, 百拇医药
79.1±2.6
S期细胞%
10.4±1.3a
10.2±1.7
G2期细胞%
11.0±2.1a
10.7±1.9
DNA荧光强度
80.8±2.4a
81.1±2.2
aP>0.05vs进口鞘液.表4 用标准荧光球对自制鞘液稳定性的试验 测定指标
, 百拇医药
0d
30d
180d
360d
荧光(
+S)CV(%)
荧光(
+S)CV(%)
荧光(
+S), http://www.100md.com
CV(%)
荧光(
+S)CV(%)
前向光
452.9±7.6
0.91
451.2±7.5
0.98
451.7±7.9
1.01
450.2±8.2
, http://www.100md.com
1.09
绿色荧光
438.4±8.7
1.09
439.8±8.8
1.11
438.9±8.2
1.17
437.5±9.0
1.13
橙色荧光
431.1±8.2
, http://www.100md.com
1.12
432.1±8.4
1.13
430.9±8.7
1.16
431.7±8.7
1.17
红色荧光
439.2±8.3
1.06
438.8±8.1
1.04
, 百拇医药
437.7±9.0
1.08
437.2±8.9
1.12
3 讨论
鞘液是流式细胞仪分析检测样品的必备试剂，其质量如何直接影响测定的结果。我们在研制鞘液的过程中，发现劣质试剂尤其是含杂质多、荧光成分多的试剂，在波长488nm激发光的照射下会产生杂峰，虽然对于高表达标志物的测定影响不大，但测定低表达标志物的荧光强度时，可使测定结果与实际值产生较大偏差。因此，在配制鞘液时，应选择纯度较高的试剂和水，鞘液的pH值应调到7.0～7.5范围内，同时注意等渗条件，以不破坏细胞的完整性为原则。总之，我们配制的鞘液经实验结果表明,完全可以代替进口鞘液，且保存期较长、成本较低，有利于FCM的普及使用。
, 百拇医药
作者简介：曹云新，女，40岁，实验师 西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374573
参考文献：
〔1〕左连富.流式细胞术与生物医学〔M〕.沈阳:辽宁科学 技术出版社,1996：8-9.
〔2〕曹云新，刘智广.流式细胞仪全血白细胞样品制备试
剂的研究〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,1999;15(2)：156-158.
〔3〕宋根平，李素文.流式细胞术的原理和应用〔M〕.北京 ：北京师范大学出版社，1992：9-35.
收稿日期：1999-10-15
修回日期：1999-11-02, 百拇医药