具有GPX活性的单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析
作者：吴广谋 冯书章 刘子 张国利 郭学军 罗贵民 高姝娟
单位：吴广谋(解放军农牧大学军事兽医研究所，吉林长春130062)；冯书章(解放军农牧大学军事兽医研究所，吉林长春130062)；刘子(解放军农牧大学军事兽医研究所，吉林长春130062)；张国利(解放军农牧大学军事兽医研究所，吉林长春130062)；郭学军(解放军农牧大学军事兽医研究所，吉林长春130062)；罗贵民(吉林大学酶工程实验室)；高姝娟(吉林大学酶工程实验室)
关键词：谷胱甘肽过氧化物酶；抗体酶；可变区基因；克隆
细胞与分子免疫学杂志000208
摘要：目的 利用分泌具有GPX活性的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞3G5，克隆其mAb体的可变区基因。方法 提取杂交瘤细胞的总RNA，分离mRNA，反转录合成cDNA。经PCR扩增VH基因和VL基因，将VH基因和VL基因与载体pGEM-T连接后，进行酶切鉴定和序列分析。结果 构建了2个分别含有VH和VL基因的重组质粒。序列分析表明，VH和VL分别属于ousc heavy chain subgroupIII和mouse light chain subgroupV亚群，长度为372和324bp，编码124和108个氨基酸，在高变区分别有4和2个丝氨酸。结论 克隆的VH和VL基因符合
, http://www.100md.com
功能性重排的鼠抗体可变区基因特征，为将来制备具有GPX活 性的单链抗体提供了可靠的基因材料。
中图号：R392.11 文献标识码：A
文章编号：007-8738(2000)02-0116-04
Cloning and sequencing of variable region genes of monoclonal antibody against GSH with GPX activity
WU Guang- mou
(The Velerinary Institutcl, Changchun University of Agriculture and Animal Sciences, Changchun130062)
, 百拇医药
FENG Shu- zhangLIU Zi
(The Velerinary Institutcl, Changchun University of Agriculture and Animal Sciences, Changchun130062)
Zhang Guo- li
(The Velerinary Institutcl, Changchun University of Agriculture and Animal Sciences, Changchun130062)
GUO Xue- Jun
(The Velerinary Institutcl, Changchun University of Agriculture and Animal Sciences, Changchun130062)
, http://www.100md.com
LUO Gui- min
(Laboratory of Enzyme Engineering, Jilin Universty, Jilin Province, China)
GAOShu- juan
(Laboratory of Enzyme Engineering, Jilin Universty, Jilin Province, China)
Abstract: Aim To clone and sequence variable region genes of monoclonal antibody against GSH with GPX activityfrom hybridoma 3G5. Methods Total RNA was isolated, purifing poly(A+ )RNA (mRNA) was purified through magnesphere technology and cDNA was synthesized by reverse transcription. Both VH and VL genes were amplified
, 百拇医药
by PCR. VH and VL gene were inserted into vector pGEM- T. The recombinant plasmids were identified byrestriction enzyme digestion and sequences were analysed. Results The recombinant plasmids pGEM- T- VH and pGEM- T- VL were constructed. VH and VL genes were categorized into mouse heavy chain subgroup III andmouse light chain subgroup V respectively. The VH and VL genes were revealed to be 372 and 324 bp, encoding 124and 108 amino acids containing 4 and 2 Ser in their high variable domains, respectively.Conclusion The VH and VLgenes have the character of mice antibody variable genes. These genes will be used for expression of single chain Fvwith GPX activity.
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Keywords: glutathioneperoxidase; abzyme; variable region gene; cloning
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是抗氧化应激酶系的重要成员之一，能消除体内的自由基，防止脂质过氧化，在治疗缺血性心脏病、脑缺血、白内障和生理性衰老等疾病中起着重要的作用〔1〕。但GPX的稳定性差、来源有限，各国都在研究酶活性高、穿透力强、性质稳定，且具有导向性的模拟酶，但均未能取得突破性进展。我们应用GSH-S-DNP诱导制备的单克隆抗体(mAb)经化学修饰后，使抗体可变区中的丝氨酸(Ser)变成GPX的主要活性基团—硒代半胱氨酸(Se-Cys)，成为含硒的抗体酶(abzyme)〔2〕，其活力可达到天然酶的水平。由于抗体酶的分子质量大，免疫原性强，难以用于临床，采用单链抗体技术则可解决这个问题。因此，我们对抗GSH的mAb可变区基因进行了克隆和序列分析，为单链抗体基因的构建及制备高活力的单链抗体 酶打下了基础。
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1 材料和方法
1.1 材料 抗原由还原型GSH甲酯与BSA偶联而成，为吉林大学提供。Sp2/0骨髓瘤细胞引自北京生物制品研究所。限制性核酸内切酶，DL2000 DNA markers和pBR322DNA/HindfI marker,购自Takara公司。Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，dNTP，RNA gents total RNA isolation system,PolyAtract mRNA isolation system IV和pGEM-T载体，均购自Promega公司。Mouse ScFv module/recombinant phage antibody system购自Pharmacia公司。
1.2 方法
1.2.1 mAb的制备及酶活性测定 mAb的制备按常规方法进行〔3〕。mAb经纯化、化学突变后，进行酶活测定〔4〕。
, 百拇医药
1.2.2 总RNA的提取和mRNA的纯化 在无RNA酶的环境下，按RNA gents total RNA isolation system和PolyA tract mRNA isolation system IV提供的方法，提取细胞总RNA并分离纯化mRNA。
1.2.3 cDNA第1链的合成及PCR扩增 按Mouse ScFv module/recombinant phage antibody system提供的方法，在反转录酶作用下合成cDNA。分别取上述合成的cDNA产物33μL，然后在第1个管中加入VL基因引物2μL，双馏水64μL；在第2个管中加入VH基因引物1和2各2μL，双馏水62μL，在2管中分别加入100μL石蜡油，于95℃变性5min，在石蜡油面下加入1μLTaqDNA聚合酶(5mU/L)进行PCR扩增。PCR的反应条件为：94℃ 1min，55℃ 2min，72℃ 2min，共30个循环。以20g/L琼脂糖凝胶电泳分析扩增的效果，然后分别切下轻重链DNA带，并分别装入微旋柱中(装以SepharylS-400树脂)，以735g离心2min，上清中即为纯化的VL，VH基因片段。
, 百拇医药
1.2.4 可变区基因的克隆及测序 利用pGEM-T载体系统，在T4DNA连接酶的作用下，将VH和VL基因片段与载体连接，并转化至受体菌DH5α中。转化菌经IPTG/X-Gal琼脂平板蓝白菌落筛选，挑取白色菌落，提取质粒并进行PvuII酶切鉴定，然后，将重组质粒用ABI377全自动荧光DNA序列分析仪进行测序。
2 结果
2.1 mAb的制备及酶活性测定 建立了1株分泌抗GSHmAb的细胞株3G5，该mAb经化学修饰后，其高变区中的Ser变成Se-Cys，其活 性达19mU/mol，为天然酶的3.8倍(表1)。
表1 抗体酶及天然GPX的活性
Tab1 Enzymatic activities of catalytic abzyme and native GPX Compound
, 百拇医药
z/(mU.mol-1)
Se-Cys
0.00005
Rabbit lgG
0
Mutated rabbit lgG
0.0714
3G5 lgM
0
Mutated 3G5 lgM
19
, 百拇医药 Native GPX
5.078
2.2 VH和VL基因的扩增及鉴定 从3G5杂交瘤细胞株中成功地提取出总RNA，分离出mRNA，并以此为模板合成了cDNA。再以合成的cDNA为模板，用PCR分别扩增了VH和VL基因。琼脂糖凝胶电泳分
析表明，VH和VL基因的长度约为370bp和320bp(图1)。
图1 VH及VL基因PCR扩增产物的鉴定
Fig1 Identification of amplified VH and VL gene products
, 百拇医药
1:VH gene PCR product;2:VL gene PCR product;3:pBR322DNA/Hindf I marker.
2.3 重组质粒的鉴定 将VH和VL基因片段与pGEM-T载体连接，转化至受体菌DH5α中。转化菌经IPTG/X-Gal琼脂平板蓝白色菌落筛选，挑取其中的6个白色菌落，提取质粒并进行Pvu II酶切鉴定，分别切下750bp和800bp左右的片段(图2，3)，表明pGE M-T-VH和pGEM-T-VL克隆质粒中，分别含有VH和VL基因片段。
图2 重组质粒pGEM-T-VH的酶切鉴定
, 百拇医药
Fig2 Restriction enzyme map of recombinant plasmid pGEM-T-VH
1-6:pGEM-T-VH cut with Pvu II;7:DL2000 DNA marker.
图3 重组质粒pGEM-T-VL的酶切鉴定
Fig3 Restriction enzyme map of recombinant plasmid pGEM-T-VL
1-6:pGEM-T-VL cut with Pvu II;7:DL2000 DNA marker.
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2.4 VH和VL核苷酸序列的测定及分析 对3个VH和3个VL重组质粒的序列测定表明，3个VH及3个VL基因的序列一致，均符合小鼠可变区框架结构：VH基因由372个核苷酸组成，编码124个氨基酸，属于抗体可变区基因家族的mouse heavy subgroup III(图4)；VL基因由324个核苷酸组成，编码108个氨基酸，属于抗体可变区基因家族的mouse light chain V(图5)；在高变区中VH有4个丝氨酸，VL有2 个丝氨酸。
图4 VH基因的DNA序列及推导的氨基酸序列
Fig4 DNA and deduced amino acid sequences of VH gene
, 百拇医药
图5 VL基因的DNA序列及推导的氨基酸序列
Fig5 DNA and deduced aminoacid sequences of VLgene
3 讨论
我们从抗GSH的细胞株中，提取总RNA，分离mRNA，并反转录成cDNA，扩增出VH和VL基因。然后，对扩增的VH，VL基因进行了克隆和序列分析，为制备高活性的单链抗体酶打下了基础。扩增抗体VH和VL基因，所需要的PCR引物主要是根据可变区基因上下游碱基序列的保守性而设计的〔5〕。由于抗体基因具有许多亚群(subgroup)，设计的引物有可能扩增出不完整的可变区基因。在本实验中，由VH基因扩增出的产物除1条主带外，还有1条较小的辅带，就说明了这一点。本实验所用引物是由Pharmacia设计的多种引物的混合物。测序结果表明，轻重链基因的引 物是针对FR1和FR4区直接设计的。
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在克隆可变区的过程中，我们曾用Parmacia公司设计的linker引物，通过PCR把VH和VL基因连接起来。但测序结果表明：linker基因和VL基因的同源性很高，所克隆的ScFv基因中缺少1个功能
区。因此，在本实验中，我们采用pGEM-T载体对VH和VL基因分别进行克隆。测序结果表明，在抗体可变区中丝氨酸最多，在重链高变区中有4个丝氨酸，在轻链高变区中有2个丝氨酸。这6个丝氨酸经过化学突变对抗体酶的活性起着重要的作用。至于哪个丝氨酸起关键作用，目前正对其立体结构与GPX的立体结 构进行比较，以期能阐明这个问题。
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39770174
作者简介：吴广谋，男，27岁，硕士长春市西安大路175号，Tel.(0431)7973911-66685 2000byJCellMolImmunolPresswww.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn
, 百拇医药
参考文献：
〔1〕 Bock A, Forchhammer K, Heider J, et al. Selenocysteine:the 21st amino acid〔 J〕 . MolMicrobiol,1991;5(3):515- 520.
〔2〕 Luo GM, Zhu ZQ, Ding L, et al. Generation of selenium- containing abzyme by using chemical mutation〔J〕 . Biochem Biophys Res Commun, 1994;198(3):1240- 1247.
〔3〕 K hler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity〔 J〕 .Nature, 1975;256:495- 497.
, http://www.100md.com
〔4〕 Wendel A. Glutathione peroxidase〔 J〕 . Methods Enzymol,1981;77:325- 333.
〔5〕 Kabat EA, Wu TT, Perry HM, et al. Sequence of protein of immunological interest〔M〕 . Fifth ed.US.Department of Health and Human Services, 1991： 1281- 1291, 1416- 1436.
收稿日期：1999-05-31
修回日期：1999-09-22, 百拇医药
单位：吴广谋(解放军农牧大学军事兽医研究所，吉林长春130062)；冯书章(解放军农牧大学军事兽医研究所，吉林长春130062)；刘子(解放军农牧大学军事兽医研究所，吉林长春130062)；张国利(解放军农牧大学军事兽医研究所，吉林长春130062)；郭学军(解放军农牧大学军事兽医研究所，吉林长春130062)；罗贵民(吉林大学酶工程实验室)；高姝娟(吉林大学酶工程实验室)
关键词：谷胱甘肽过氧化物酶；抗体酶；可变区基因；克隆
细胞与分子免疫学杂志000208
摘要：目的 利用分泌具有GPX活性的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞3G5，克隆其mAb体的可变区基因。方法 提取杂交瘤细胞的总RNA，分离mRNA，反转录合成cDNA。经PCR扩增VH基因和VL基因，将VH基因和VL基因与载体pGEM-T连接后，进行酶切鉴定和序列分析。结果 构建了2个分别含有VH和VL基因的重组质粒。序列分析表明，VH和VL分别属于ousc heavy chain subgroupIII和mouse light chain subgroupV亚群，长度为372和324bp，编码124和108个氨基酸，在高变区分别有4和2个丝氨酸。结论 克隆的VH和VL基因符合
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功能性重排的鼠抗体可变区基因特征，为将来制备具有GPX活 性的单链抗体提供了可靠的基因材料。
中图号：R392.11 文献标识码：A
文章编号：007-8738(2000)02-0116-04
Cloning and sequencing of variable region genes of monoclonal antibody against GSH with GPX activity
WU Guang- mou
(The Velerinary Institutcl, Changchun University of Agriculture and Animal Sciences, Changchun130062)
, 百拇医药
FENG Shu- zhangLIU Zi
(The Velerinary Institutcl, Changchun University of Agriculture and Animal Sciences, Changchun130062)
Zhang Guo- li
(The Velerinary Institutcl, Changchun University of Agriculture and Animal Sciences, Changchun130062)
GUO Xue- Jun
(The Velerinary Institutcl, Changchun University of Agriculture and Animal Sciences, Changchun130062)
, http://www.100md.com
LUO Gui- min
(Laboratory of Enzyme Engineering, Jilin Universty, Jilin Province, China)
GAOShu- juan
(Laboratory of Enzyme Engineering, Jilin Universty, Jilin Province, China)
Abstract: Aim To clone and sequence variable region genes of monoclonal antibody against GSH with GPX activityfrom hybridoma 3G5. Methods Total RNA was isolated, purifing poly(A+ )RNA (mRNA) was purified through magnesphere technology and cDNA was synthesized by reverse transcription. Both VH and VL genes were amplified
, 百拇医药
by PCR. VH and VL gene were inserted into vector pGEM- T. The recombinant plasmids were identified byrestriction enzyme digestion and sequences were analysed. Results The recombinant plasmids pGEM- T- VH and pGEM- T- VL were constructed. VH and VL genes were categorized into mouse heavy chain subgroup III andmouse light chain subgroup V respectively. The VH and VL genes were revealed to be 372 and 324 bp, encoding 124and 108 amino acids containing 4 and 2 Ser in their high variable domains, respectively.Conclusion The VH and VLgenes have the character of mice antibody variable genes. These genes will be used for expression of single chain Fvwith GPX activity.
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Keywords: glutathioneperoxidase; abzyme; variable region gene; cloning
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是抗氧化应激酶系的重要成员之一，能消除体内的自由基，防止脂质过氧化，在治疗缺血性心脏病、脑缺血、白内障和生理性衰老等疾病中起着重要的作用〔1〕。但GPX的稳定性差、来源有限，各国都在研究酶活性高、穿透力强、性质稳定，且具有导向性的模拟酶，但均未能取得突破性进展。我们应用GSH-S-DNP诱导制备的单克隆抗体(mAb)经化学修饰后，使抗体可变区中的丝氨酸(Ser)变成GPX的主要活性基团—硒代半胱氨酸(Se-Cys)，成为含硒的抗体酶(abzyme)〔2〕，其活力可达到天然酶的水平。由于抗体酶的分子质量大，免疫原性强，难以用于临床，采用单链抗体技术则可解决这个问题。因此，我们对抗GSH的mAb可变区基因进行了克隆和序列分析，为单链抗体基因的构建及制备高活力的单链抗体 酶打下了基础。
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1 材料和方法
1.1 材料 抗原由还原型GSH甲酯与BSA偶联而成，为吉林大学提供。Sp2/0骨髓瘤细胞引自北京生物制品研究所。限制性核酸内切酶，DL2000 DNA markers和pBR322DNA/HindfI marker,购自Takara公司。Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，dNTP，RNA gents total RNA isolation system,PolyAtract mRNA isolation system IV和pGEM-T载体，均购自Promega公司。Mouse ScFv module/recombinant phage antibody system购自Pharmacia公司。
1.2 方法
1.2.1 mAb的制备及酶活性测定 mAb的制备按常规方法进行〔3〕。mAb经纯化、化学突变后，进行酶活测定〔4〕。
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1.2.2 总RNA的提取和mRNA的纯化 在无RNA酶的环境下，按RNA gents total RNA isolation system和PolyA tract mRNA isolation system IV提供的方法，提取细胞总RNA并分离纯化mRNA。
1.2.3 cDNA第1链的合成及PCR扩增 按Mouse ScFv module/recombinant phage antibody system提供的方法，在反转录酶作用下合成cDNA。分别取上述合成的cDNA产物33μL，然后在第1个管中加入VL基因引物2μL，双馏水64μL；在第2个管中加入VH基因引物1和2各2μL，双馏水62μL，在2管中分别加入100μL石蜡油，于95℃变性5min，在石蜡油面下加入1μLTaqDNA聚合酶(5mU/L)进行PCR扩增。PCR的反应条件为：94℃ 1min，55℃ 2min，72℃ 2min，共30个循环。以20g/L琼脂糖凝胶电泳分析扩增的效果，然后分别切下轻重链DNA带，并分别装入微旋柱中(装以SepharylS-400树脂)，以735g离心2min，上清中即为纯化的VL，VH基因片段。
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1.2.4 可变区基因的克隆及测序 利用pGEM-T载体系统，在T4DNA连接酶的作用下，将VH和VL基因片段与载体连接，并转化至受体菌DH5α中。转化菌经IPTG/X-Gal琼脂平板蓝白菌落筛选，挑取白色菌落，提取质粒并进行PvuII酶切鉴定，然后，将重组质粒用ABI377全自动荧光DNA序列分析仪进行测序。
2 结果
2.1 mAb的制备及酶活性测定 建立了1株分泌抗GSHmAb的细胞株3G5，该mAb经化学修饰后，其高变区中的Ser变成Se-Cys，其活 性达19mU/mol，为天然酶的3.8倍(表1)。
表1 抗体酶及天然GPX的活性
Tab1 Enzymatic activities of catalytic abzyme and native GPX Compound
, 百拇医药
z/(mU.mol-1)
Se-Cys
0.00005
Rabbit lgG
0
Mutated rabbit lgG
0.0714
3G5 lgM
0
Mutated 3G5 lgM
19
, 百拇医药 Native GPX
5.078
2.2 VH和VL基因的扩增及鉴定 从3G5杂交瘤细胞株中成功地提取出总RNA，分离出mRNA，并以此为模板合成了cDNA。再以合成的cDNA为模板，用PCR分别扩增了VH和VL基因。琼脂糖凝胶电泳分
析表明，VH和VL基因的长度约为370bp和320bp(图1)。
图1 VH及VL基因PCR扩增产物的鉴定
Fig1 Identification of amplified VH and VL gene products
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1:VH gene PCR product;2:VL gene PCR product;3:pBR322DNA/Hindf I marker.
2.3 重组质粒的鉴定 将VH和VL基因片段与pGEM-T载体连接，转化至受体菌DH5α中。转化菌经IPTG/X-Gal琼脂平板蓝白色菌落筛选，挑取其中的6个白色菌落，提取质粒并进行Pvu II酶切鉴定，分别切下750bp和800bp左右的片段(图2，3)，表明pGE M-T-VH和pGEM-T-VL克隆质粒中，分别含有VH和VL基因片段。
图2 重组质粒pGEM-T-VH的酶切鉴定
, 百拇医药
Fig2 Restriction enzyme map of recombinant plasmid pGEM-T-VH
1-6:pGEM-T-VH cut with Pvu II;7:DL2000 DNA marker.
图3 重组质粒pGEM-T-VL的酶切鉴定
Fig3 Restriction enzyme map of recombinant plasmid pGEM-T-VL
1-6:pGEM-T-VL cut with Pvu II;7:DL2000 DNA marker.
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2.4 VH和VL核苷酸序列的测定及分析 对3个VH和3个VL重组质粒的序列测定表明，3个VH及3个VL基因的序列一致，均符合小鼠可变区框架结构：VH基因由372个核苷酸组成，编码124个氨基酸，属于抗体可变区基因家族的mouse heavy subgroup III(图4)；VL基因由324个核苷酸组成，编码108个氨基酸，属于抗体可变区基因家族的mouse light chain V(图5)；在高变区中VH有4个丝氨酸，VL有2 个丝氨酸。
图4 VH基因的DNA序列及推导的氨基酸序列
Fig4 DNA and deduced amino acid sequences of VH gene
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图5 VL基因的DNA序列及推导的氨基酸序列
Fig5 DNA and deduced aminoacid sequences of VLgene
3 讨论
我们从抗GSH的细胞株中，提取总RNA，分离mRNA，并反转录成cDNA，扩增出VH和VL基因。然后，对扩增的VH，VL基因进行了克隆和序列分析，为制备高活性的单链抗体酶打下了基础。扩增抗体VH和VL基因，所需要的PCR引物主要是根据可变区基因上下游碱基序列的保守性而设计的〔5〕。由于抗体基因具有许多亚群(subgroup)，设计的引物有可能扩增出不完整的可变区基因。在本实验中，由VH基因扩增出的产物除1条主带外，还有1条较小的辅带，就说明了这一点。本实验所用引物是由Pharmacia设计的多种引物的混合物。测序结果表明，轻重链基因的引 物是针对FR1和FR4区直接设计的。
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在克隆可变区的过程中，我们曾用Parmacia公司设计的linker引物，通过PCR把VH和VL基因连接起来。但测序结果表明：linker基因和VL基因的同源性很高，所克隆的ScFv基因中缺少1个功能
区。因此，在本实验中，我们采用pGEM-T载体对VH和VL基因分别进行克隆。测序结果表明，在抗体可变区中丝氨酸最多，在重链高变区中有4个丝氨酸，在轻链高变区中有2个丝氨酸。这6个丝氨酸经过化学突变对抗体酶的活性起着重要的作用。至于哪个丝氨酸起关键作用，目前正对其立体结构与GPX的立体结 构进行比较，以期能阐明这个问题。
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39770174
作者简介：吴广谋，男，27岁，硕士长春市西安大路175号，Tel.(0431)7973911-66685 2000byJCellMolImmunolPresswww.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn
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参考文献：
〔1〕 Bock A, Forchhammer K, Heider J, et al. Selenocysteine:the 21st amino acid〔 J〕 . MolMicrobiol,1991;5(3):515- 520.
〔2〕 Luo GM, Zhu ZQ, Ding L, et al. Generation of selenium- containing abzyme by using chemical mutation〔J〕 . Biochem Biophys Res Commun, 1994;198(3):1240- 1247.
〔3〕 K hler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity〔 J〕 .Nature, 1975;256:495- 497.
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〔4〕 Wendel A. Glutathione peroxidase〔 J〕 . Methods Enzymol,1981;77:325- 333.
〔5〕 Kabat EA, Wu TT, Perry HM, et al. Sequence of protein of immunological interest〔M〕 . Fifth ed.US.Department of Health and Human Services, 1991： 1281- 1291, 1416- 1436.
收稿日期：1999-05-31
修回日期：1999-09-22, 百拇医药