小鼠凋亡相关新基因TFAR15的克隆和序列分析
作者：孙荣华 黄家强 韩文玲 王应 马大龙
单位：
关键词：TFAR15；EST拼排；凋亡；中图号：Q78
细胞与分子免疫学杂志000202
摘要：目的克隆人白血病细胞凋亡相关新基因TFAR15的小鼠同源序列，并比较其在不同种属间的序列同源性。方法利用EST(expressedsequencetag)拼排、RT-PCR、DNA序列测定
和计算机分析技术，对小鼠TFAR15进行研究。结果首次成功地进行了小鼠TFAR15全长cDNA的克隆和序列分析，发现小鼠TFAR15与小鼠其它cDNA没有明显的同源性，因此提交GenBank并被收录，登录号为AF159368。小鼠TFAR1 5和人FAR15在核苷酸水平上有92.3%的同源性，在氨基酸水平上有高达98.6%的同源性；同时发现小鼠TFAR15在氨基酸水平上与线虫C14A4.11蛋白质有38%的同源性。功能区分析发现，小鼠TFAR15cDNA序列含编码212个氨基酸的开放读码框架，有2个可能的N-糖基化位点，3个可能的caseinkinaseII磷酸化位点，4个可能的PKC磷酸化位点，并且可能是一种胞浆蛋白(cytoplasmicprotein)。结论小鼠TFAR15是进化上高度保守的新基因，可 能具有重要的功能。
, 百拇医药
中图号：Q78
文献标识码：A
文章编号：1007-8738(2000)02-0097-04
cDNA cloning and sequencing of a novel mouse apoptosis related gene TFAR15
SUN Rong- hua,HUANG Jia-qiang,HAN Wen- ling,WANG Ying,MA Da- long
(Department of Immunology,Beijing Medical University,Bei jing 100083, china)
Abstract:Aim To clone a mouse homologous sequence of a human novel gene TFAR15(TF- 1 cell apoptosis relatedgene- 15) and to analyze their sequence homology among the different species. Methods The EST(expressed sequencetag) sequence alignment method, RT- PCR, DNA sequencing, and computer analysis were used for the cDNA cloningof mouse TFAR15. Results The full length of mouse TFAR15 cDNA was successfully cloned and sequenced. There was92.3% homology between mouse and human TFAR15 at the nucleotide level and 98.6% homology at amino acidlevel. It contained an open reading frame encoding 212 amino acids, two potential N- glycosylation sites, threecasein kinase II phosphorylation sites, and four potential PKC phosphorylation sites. It was possible that mouseTFAR15 protein was a cytoplasmic protein. Conclusion Mouse TFAR15 was highly homologous with human TFAR15.Further experiment was needed to confirm its biological activities.
, 百拇医药
Keywords: TFAR15; EST alignment; apoptosis
细胞凋亡，是生理条件下的细胞程序化死亡过程，在胚胎发育、组织发生、造血细胞增殖与分化等许多方面起着十分重要的作用。细胞凋亡是多种分子参与的复杂的细胞内信号传导过程〔1〕。在这一过种中，有些基因被诱导表达或表达水平升高，而有些基因表达水平降低甚至表达完全抑制〔2〕。TFAR15是细胞因子撤除后诱导TF-1细胞凋亡过程中，克隆到的表达增加的一个新基因〔3〕，其生物学功能还有待进一步的研究。初步研究表明，其对某些细胞具有抑制凋亡的效应〔4〕。为进一步了解不同种属间TFAR15序列的同源性，并为小鼠体内TFAR15功能的研究做准备，我们借助EST(expr essedsequencetag)数据库等，成功地进行了小鼠TFAR15全长cDN A的克隆和序列分析。
1材料和方法
, 百拇医药
1.1材料 Swiss小鼠胚胎NIH3T3成纤维细胞株，由本室常规传代培养。Trizol total RNA Isolation System试剂盒和Super Script Preamplification System试剂盒，购自Gibco公司，pGEM-TEasy载体购自Promega公司。
1.2方法 在NCBIGenBank数据库中，利用Blastn检索dbest数据库。将EST数据库检索到的与人TFAR15具有高度同源性的小鼠EST序列拼排，每1个碱基至少经过两条以上EST序列验证，拼排成小鼠TFAR15序列。根据拼排的小鼠TFAR15相对保守序列区合成PCR引物：上游引物从第75位碱基开始，序列为：5′-AAGGTGGGA-AGTGAAGTC-3′；下游引物针对的是mTFAR15基因序列中的1087～1029位碱基，序列为：5′-TGCAG-CATATCGCTTTCAAGTT-3′。利用Trizol total RNA Isolation System试剂盒，提取NIH3T3细胞总RNA，再经Super Script Preamplification System反转录合成cDNA第1链，制备NIH3T3cDNA文库，进行PCR扩增。扩增产物用AT法克隆到pGEM-TEasy载体中，构建pGEM-TmTFAR15克隆，用于测序。由大连宝生物工程公司利用ABI公司的377全自动DNA测序仪，进行DNA序列分析。用ORNL的Grail软件，ExPASy的AACompIdent，Prosite和SignalP软件，GenomNet的Psort，Motif软件及Fickett法，进行mTFAR15核苷酸及蛋白序列的计算机分析。
, http://www.100md.com
2结果
2.1GenBank数据库检索和EST序列拼排 根据公布的人TFAR15 cDNA序列，经国际互联网进入美国GenBank。利用Blastn检索nr数据库，未发现小鼠的TFAR15同源序列；再经EST数据库检索，发现至少有72个长度不一的与人TFAR15高度同源的小鼠EST序列。经过对其中的14个互相重叠的EST序列(GenBank登记号分别为：AI433690，AA915016，AA286381，AI644171，AA168243，AA606706，AU020738，A915016，AA833454，AA546871，AA959814，AA599041，AA848801，AA599041)进行计算机拼排，推断出小鼠全长TFA-R15cDNA序列(图1)。该序列共有1290个碱基，有1个编码212个氨基酸的完整开放读 码框架，polyA尾巴和最常见的加尾信号AATAAA。通过计算机同源性分析证明，人与鼠的cDNA序列间有92.3%的同源性，编码区的同源性高达 94.3%。
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图1拼排的mTFAR15全长cDNA及其编码序列(下画线表示引 物序列)
Fig1CompletecDNAsequenceofalignedmouseTFAR15anditscoding sequence
(theunderlineindicatedtheprimersequences)
2.2PCR扩增和序列测定 根据拼排的mTFAR15全长序列，设计PCR引物，以小鼠NIH3T3细胞cDNA文库为模板进行扩增。扩增产物约为1200bp，经酶切鉴定与预期结果一致(图2)。将PCR扩增产物克隆到pGEM-TEasy载体中，进行序列分析。经过对pGEMT-TFAR15质粒进行序列分析，获得小鼠TFAR15全长核苷酸序列，与预期序列完全一致。通过Gen BankBankit功能进行登记，登录号为AF159368。
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图2pGEMT-mTFAR15的酶切鉴定
Fig2 Restriction enzymes analysis of pGEMT-mTFAR15
1:mTFAR15 PCR product;2:pGEMT-mTFAR15/ScaI;3:pGEMT-mTFAR15/Pvu II；
4:pGEMT-mTFAR15/PstI;5:pGEMT-mTFAR15/NcoI;6:pGEM DNA marker
(2645,1605,1198,676,517,460,396,350,222 bp);7:pGEMT-mTFAR15/EcoR I；
8:pGEMT-mTFAR15.Corresponding enzyme sites of EcoR I,Nco I,Pst I and Pvu II on the sepuence of mTFAR15 PCR product
, 百拇医药
are:452；204；277 and 543；410. No Sca I site.
2.3mTFAR15的氨基酸序列分析 用ORNL的Grail软件，ExPASy的AACompIdent，Prosite和SignalP软件，GenomNet的Psort，Motif软件和Fickett法，进行mTFAR15核苷酸及蛋白序列的计算机分析。mTFAR15全长cDNA可能的最大读码框架为第198～833位碱基，编码212个氨基酸，与人的TFAR15蛋白有98.6%的同源性。mTFAR15蛋白的pI=7.80，分子量为24772.65，有两个可能的N-糖基化位点(分别在第37，75位氨基酸)，3个可能的Casein kinaseII磷酸化位点(分别在第4，130和173位氨基酸)，4个可能的PKC磷酸化位点(分别在第43，130，177和207位氨基酸)。无N-端信号肽序列(N-terminal signal sequence)；C端无核定位信号(NLS)及内质网滞留序列(ER retention motif)。虽然有两个内质网滞留序列信号(XXRR-like motif in the N-terminus:RMTM及KKXX-like motif in the C-terminus:FKTV)，但不能确定是否为ER膜蛋白，其最大可能是一种胞浆蛋白(cytoplasmic-protein)。
, 百拇医药
2.4mTFAR15的氨基酸序列比较 将拼排得到的mTFAR15全长cDNA序列，经国际互联网进入美国GenBank。利用Blastp检索nr数据库，发现小鼠TFAR15与人TFAR15在氨基酸水平上的同源性高达98.6%；与线虫C14A4.11有30%的同源性，相似氨基酸达68%。比较的结果如图3所示(上排为小鼠TFAR15 ，下排为线虫C14A4.11)。
图3鼠TFAR15与线虫C14A4.11的氨基酸序列比较
Fig.3 Amino acid sequence comparison between
mouse TFAR15 and Celegans C14A4.11
3讨论
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我们在TF-1细胞去因子诱导凋亡时，克隆到一个新基因TFAR15。初步研究发现，其对某些细胞有一定的抑制凋亡的作用〔4〕。TFAR15的氨基酸序列与其它已知蛋白的同源性较小。令人感兴趣的是，TFAR15的氨基末端至少有8个甲硫氨酸，其功能意义尚不清楚。为了给TFAR15的功能研究
提供更多的线索，克隆了小鼠的TFAR15cDNA，这对以小鼠为模式生物进行的TFAR15体内外功能研究，具有重要的意义。我们在进行人TFAR15的序列检索时，发现在EST数据库中有大量小鼠EST与人TFAR15高度同源，因而为小鼠TFAR15基因的克隆提供了便利条件。通过将互为重叠的小鼠EST序列进行排列(alignment)，我们成功地获知小鼠TFAR15的全长cDNA序列；又根据拼排的序列在高度保守区域设计引物并进行RT-PCR和序列分析，验证了序列的正确性，为下一步研究打下了基础。这种EST重叠序列拼排技术，又称计算机克隆，已越来越广泛地应用于cDNA的克隆，是一条简便、快捷的技术路线，但最终结果还需要实验验证。
, http://www.100md.com
人与小鼠的TFAR15在氨基酸水平有98.6%的同源性，核苷酸的编码及非编码区的同源性都很高，同时小鼠TFAR15在氨基酸水平上与线虫C14A4.11蛋白有30%的同源性，说明TFAR15在进化中是比较保守的。利用计算机软件进行TFAR15的功能区分析，发现它们都有2个可能的N-糖基化位点，3个可能的Casein kinaseII磷酸化位点和4个可能的PKC磷酸化位点，提示它们可能在细胞信号传导中起一定的作用。
总之，小鼠TFAR15的成功克隆将可进一步促进对TFAR15结构与功能的研究，特别是为TFAR15基因knockout或knockin技术打下了基础，为揭示TFAR15的生理病理功能提供 了条件。
作者简介：孙荣华，女，26岁，博士生 北京市海淀区学院路38号，Tel.(010)62091417
2000byJCellMolImmunolPress www.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn
, 百拇医药
参考文献：
〔1〕 Steller H. Mechanisms and genes of cellular suiside〔J〕.Science,1995;267:1445-1449.
〔2〕 Russ A P,Riedel C,Ballas K,et al.Identification of genes induced by factor deprivation in hematopoietic cellsundergoing apoptosis using gene-trap and site-specific recombination〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA, 1996;93:15279.
〔3〕 Liu HT,Wang YG,Zhang YM,et al.TFAR15,a novel apoptosis-related gene cloned from human leukemiacell line TF-1,could enhance apoptosis of some tumor cells induced by growth factor withdrawal〔J〕.Biochem Biophy Res Commun,1999;254:203-210.
〔4〕 Wang YG,Liu HT,Zhang YM,et al.cDNA cloning and expression of an apoptosis-related gene,humanTFAR15 gene〔J〕.Sci China,1999;42:323-329.
收稿日期：1999-07-15
修回日期：1999-10-27, http://www.100md.com
单位：
关键词：TFAR15；EST拼排；凋亡；中图号：Q78
细胞与分子免疫学杂志000202
摘要：目的克隆人白血病细胞凋亡相关新基因TFAR15的小鼠同源序列，并比较其在不同种属间的序列同源性。方法利用EST(expressedsequencetag)拼排、RT-PCR、DNA序列测定
和计算机分析技术，对小鼠TFAR15进行研究。结果首次成功地进行了小鼠TFAR15全长cDNA的克隆和序列分析，发现小鼠TFAR15与小鼠其它cDNA没有明显的同源性，因此提交GenBank并被收录，登录号为AF159368。小鼠TFAR1 5和人FAR15在核苷酸水平上有92.3%的同源性，在氨基酸水平上有高达98.6%的同源性；同时发现小鼠TFAR15在氨基酸水平上与线虫C14A4.11蛋白质有38%的同源性。功能区分析发现，小鼠TFAR15cDNA序列含编码212个氨基酸的开放读码框架，有2个可能的N-糖基化位点，3个可能的caseinkinaseII磷酸化位点，4个可能的PKC磷酸化位点，并且可能是一种胞浆蛋白(cytoplasmicprotein)。结论小鼠TFAR15是进化上高度保守的新基因，可 能具有重要的功能。
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中图号：Q78
文献标识码：A
文章编号：1007-8738(2000)02-0097-04
cDNA cloning and sequencing of a novel mouse apoptosis related gene TFAR15
SUN Rong- hua,HUANG Jia-qiang,HAN Wen- ling,WANG Ying,MA Da- long
(Department of Immunology,Beijing Medical University,Bei jing 100083, china)
Abstract:Aim To clone a mouse homologous sequence of a human novel gene TFAR15(TF- 1 cell apoptosis relatedgene- 15) and to analyze their sequence homology among the different species. Methods The EST(expressed sequencetag) sequence alignment method, RT- PCR, DNA sequencing, and computer analysis were used for the cDNA cloningof mouse TFAR15. Results The full length of mouse TFAR15 cDNA was successfully cloned and sequenced. There was92.3% homology between mouse and human TFAR15 at the nucleotide level and 98.6% homology at amino acidlevel. It contained an open reading frame encoding 212 amino acids, two potential N- glycosylation sites, threecasein kinase II phosphorylation sites, and four potential PKC phosphorylation sites. It was possible that mouseTFAR15 protein was a cytoplasmic protein. Conclusion Mouse TFAR15 was highly homologous with human TFAR15.Further experiment was needed to confirm its biological activities.
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Keywords: TFAR15; EST alignment; apoptosis
细胞凋亡，是生理条件下的细胞程序化死亡过程，在胚胎发育、组织发生、造血细胞增殖与分化等许多方面起着十分重要的作用。细胞凋亡是多种分子参与的复杂的细胞内信号传导过程〔1〕。在这一过种中，有些基因被诱导表达或表达水平升高，而有些基因表达水平降低甚至表达完全抑制〔2〕。TFAR15是细胞因子撤除后诱导TF-1细胞凋亡过程中，克隆到的表达增加的一个新基因〔3〕，其生物学功能还有待进一步的研究。初步研究表明，其对某些细胞具有抑制凋亡的效应〔4〕。为进一步了解不同种属间TFAR15序列的同源性，并为小鼠体内TFAR15功能的研究做准备，我们借助EST(expr essedsequencetag)数据库等，成功地进行了小鼠TFAR15全长cDN A的克隆和序列分析。
1材料和方法
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1.1材料 Swiss小鼠胚胎NIH3T3成纤维细胞株，由本室常规传代培养。Trizol total RNA Isolation System试剂盒和Super Script Preamplification System试剂盒，购自Gibco公司，pGEM-TEasy载体购自Promega公司。
1.2方法 在NCBIGenBank数据库中，利用Blastn检索dbest数据库。将EST数据库检索到的与人TFAR15具有高度同源性的小鼠EST序列拼排，每1个碱基至少经过两条以上EST序列验证，拼排成小鼠TFAR15序列。根据拼排的小鼠TFAR15相对保守序列区合成PCR引物：上游引物从第75位碱基开始，序列为：5′-AAGGTGGGA-AGTGAAGTC-3′；下游引物针对的是mTFAR15基因序列中的1087～1029位碱基，序列为：5′-TGCAG-CATATCGCTTTCAAGTT-3′。利用Trizol total RNA Isolation System试剂盒，提取NIH3T3细胞总RNA，再经Super Script Preamplification System反转录合成cDNA第1链，制备NIH3T3cDNA文库，进行PCR扩增。扩增产物用AT法克隆到pGEM-TEasy载体中，构建pGEM-TmTFAR15克隆，用于测序。由大连宝生物工程公司利用ABI公司的377全自动DNA测序仪，进行DNA序列分析。用ORNL的Grail软件，ExPASy的AACompIdent，Prosite和SignalP软件，GenomNet的Psort，Motif软件及Fickett法，进行mTFAR15核苷酸及蛋白序列的计算机分析。
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2结果
2.1GenBank数据库检索和EST序列拼排 根据公布的人TFAR15 cDNA序列，经国际互联网进入美国GenBank。利用Blastn检索nr数据库，未发现小鼠的TFAR15同源序列；再经EST数据库检索，发现至少有72个长度不一的与人TFAR15高度同源的小鼠EST序列。经过对其中的14个互相重叠的EST序列(GenBank登记号分别为：AI433690，AA915016，AA286381，AI644171，AA168243，AA606706，AU020738，A915016，AA833454，AA546871，AA959814，AA599041，AA848801，AA599041)进行计算机拼排，推断出小鼠全长TFA-R15cDNA序列(图1)。该序列共有1290个碱基，有1个编码212个氨基酸的完整开放读 码框架，polyA尾巴和最常见的加尾信号AATAAA。通过计算机同源性分析证明，人与鼠的cDNA序列间有92.3%的同源性，编码区的同源性高达 94.3%。
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图1拼排的mTFAR15全长cDNA及其编码序列(下画线表示引 物序列)
Fig1CompletecDNAsequenceofalignedmouseTFAR15anditscoding sequence
(theunderlineindicatedtheprimersequences)
2.2PCR扩增和序列测定 根据拼排的mTFAR15全长序列，设计PCR引物，以小鼠NIH3T3细胞cDNA文库为模板进行扩增。扩增产物约为1200bp，经酶切鉴定与预期结果一致(图2)。将PCR扩增产物克隆到pGEM-TEasy载体中，进行序列分析。经过对pGEMT-TFAR15质粒进行序列分析，获得小鼠TFAR15全长核苷酸序列，与预期序列完全一致。通过Gen BankBankit功能进行登记，登录号为AF159368。
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图2pGEMT-mTFAR15的酶切鉴定
Fig2 Restriction enzymes analysis of pGEMT-mTFAR15
1:mTFAR15 PCR product;2:pGEMT-mTFAR15/ScaI;3:pGEMT-mTFAR15/Pvu II；
4:pGEMT-mTFAR15/PstI;5:pGEMT-mTFAR15/NcoI;6:pGEM DNA marker
(2645,1605,1198,676,517,460,396,350,222 bp);7:pGEMT-mTFAR15/EcoR I；
8:pGEMT-mTFAR15.Corresponding enzyme sites of EcoR I,Nco I,Pst I and Pvu II on the sepuence of mTFAR15 PCR product
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are:452；204；277 and 543；410. No Sca I site.
2.3mTFAR15的氨基酸序列分析 用ORNL的Grail软件，ExPASy的AACompIdent，Prosite和SignalP软件，GenomNet的Psort，Motif软件和Fickett法，进行mTFAR15核苷酸及蛋白序列的计算机分析。mTFAR15全长cDNA可能的最大读码框架为第198～833位碱基，编码212个氨基酸，与人的TFAR15蛋白有98.6%的同源性。mTFAR15蛋白的pI=7.80，分子量为24772.65，有两个可能的N-糖基化位点(分别在第37，75位氨基酸)，3个可能的Casein kinaseII磷酸化位点(分别在第4，130和173位氨基酸)，4个可能的PKC磷酸化位点(分别在第43，130，177和207位氨基酸)。无N-端信号肽序列(N-terminal signal sequence)；C端无核定位信号(NLS)及内质网滞留序列(ER retention motif)。虽然有两个内质网滞留序列信号(XXRR-like motif in the N-terminus:RMTM及KKXX-like motif in the C-terminus:FKTV)，但不能确定是否为ER膜蛋白，其最大可能是一种胞浆蛋白(cytoplasmic-protein)。
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2.4mTFAR15的氨基酸序列比较 将拼排得到的mTFAR15全长cDNA序列，经国际互联网进入美国GenBank。利用Blastp检索nr数据库，发现小鼠TFAR15与人TFAR15在氨基酸水平上的同源性高达98.6%；与线虫C14A4.11有30%的同源性，相似氨基酸达68%。比较的结果如图3所示(上排为小鼠TFAR15 ，下排为线虫C14A4.11)。
图3鼠TFAR15与线虫C14A4.11的氨基酸序列比较
Fig.3 Amino acid sequence comparison between
mouse TFAR15 and Celegans C14A4.11
3讨论
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我们在TF-1细胞去因子诱导凋亡时，克隆到一个新基因TFAR15。初步研究发现，其对某些细胞有一定的抑制凋亡的作用〔4〕。TFAR15的氨基酸序列与其它已知蛋白的同源性较小。令人感兴趣的是，TFAR15的氨基末端至少有8个甲硫氨酸，其功能意义尚不清楚。为了给TFAR15的功能研究
提供更多的线索，克隆了小鼠的TFAR15cDNA，这对以小鼠为模式生物进行的TFAR15体内外功能研究，具有重要的意义。我们在进行人TFAR15的序列检索时，发现在EST数据库中有大量小鼠EST与人TFAR15高度同源，因而为小鼠TFAR15基因的克隆提供了便利条件。通过将互为重叠的小鼠EST序列进行排列(alignment)，我们成功地获知小鼠TFAR15的全长cDNA序列；又根据拼排的序列在高度保守区域设计引物并进行RT-PCR和序列分析，验证了序列的正确性，为下一步研究打下了基础。这种EST重叠序列拼排技术，又称计算机克隆，已越来越广泛地应用于cDNA的克隆，是一条简便、快捷的技术路线，但最终结果还需要实验验证。
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人与小鼠的TFAR15在氨基酸水平有98.6%的同源性，核苷酸的编码及非编码区的同源性都很高，同时小鼠TFAR15在氨基酸水平上与线虫C14A4.11蛋白有30%的同源性，说明TFAR15在进化中是比较保守的。利用计算机软件进行TFAR15的功能区分析，发现它们都有2个可能的N-糖基化位点，3个可能的Casein kinaseII磷酸化位点和4个可能的PKC磷酸化位点，提示它们可能在细胞信号传导中起一定的作用。
总之，小鼠TFAR15的成功克隆将可进一步促进对TFAR15结构与功能的研究，特别是为TFAR15基因knockout或knockin技术打下了基础，为揭示TFAR15的生理病理功能提供 了条件。
作者简介：孙荣华，女，26岁，博士生 北京市海淀区学院路38号，Tel.(010)62091417
2000byJCellMolImmunolPress www.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn
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参考文献：
〔1〕 Steller H. Mechanisms and genes of cellular suiside〔J〕.Science,1995;267:1445-1449.
〔2〕 Russ A P,Riedel C,Ballas K,et al.Identification of genes induced by factor deprivation in hematopoietic cellsundergoing apoptosis using gene-trap and site-specific recombination〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA, 1996;93:15279.
〔3〕 Liu HT,Wang YG,Zhang YM,et al.TFAR15,a novel apoptosis-related gene cloned from human leukemiacell line TF-1,could enhance apoptosis of some tumor cells induced by growth factor withdrawal〔J〕.Biochem Biophy Res Commun,1999;254:203-210.
〔4〕 Wang YG,Liu HT,Zhang YM,et al.cDNA cloning and expression of an apoptosis-related gene,humanTFAR15 gene〔J〕.Sci China,1999;42:323-329.
收稿日期：1999-07-15
修回日期：1999-10-27, http://www.100md.com