慢性肾衰血透患者TTV检测及其与细胞免疫功能的关系
作者：孙脊峰 傅恩清 焦凯 李占亭 王莉 王惠萍 李光荫
单位：孙脊峰(第四军医大学唐都医院1肾脏内科，2感染病院，3内分泌科，陕西西安710038)；李占亭(第四军医大学唐都医院1肾脏内科，2感染病院，3内分泌科，陕西西安710038)；王莉(第四军医大学唐都医院1肾脏内科，2感染病院，3内分泌科，陕西西安710038)；王惠萍(第四军医大学唐都医院1肾脏内科，2感染病院，3内分泌科，陕西西安710038)；李光荫(第四军医大学唐都医院1肾脏内科，2感染病院，3内分泌科，陕西西安710038)
关键词：慢性肾衰；血液透析；输血传播病毒；T淋巴细胞；可溶性白细胞介素2受体
细胞与分子免疫学杂志000321
摘要：目的观察慢性肾衰(CRF)血液透析(HD)患者中，输血传播病毒(TTV)的感染与患者细胞免疫功能的关系。方法应用巢式逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)，双抗体夹心ELISA法及流式细胞仪，分别检测了90例CRF血透患者和128例对照组血清TTVDNA，可溶性白细胞介素2受体(sIL2R)和外周血T淋巴细胞亚群。并随机选择对其中1株TTV的部分基因序列进行测定，分析TTV与细胞免疫功能、输血次数、HD时间和肝功能的关系。结果⑴90例CRF血透患者中，TTVDNA阳性率为46.67%，明显高于正常对照组(P∨0.001)，与日本报道的TTVDNA序列(AB008394)相应片段的同源性为98.5%。⑵CRF血透患者血清中，sIL2R水平明显高于正常对照组(P∨0.01)；CD3+，CD4+和CD4+/CD8+T细胞比例明显降低(P∨0.01)。⑶TTVDNA阳性率与sIL2R、输血次数及HD时间呈显著的正相关(r=0.486，P∨0.01；r=0.586，P∨0.001；r=0.492，P∨0.01)，与CD+，CD4+和CD4+/CD8+T细胞比例呈负相关(r=0.476，P∨0.01；r=0.483，P∨0.01；r=0.496，P∨0.01)，而与年龄、性别及手术史均无显著的差别和相关性。结论CRF血透患者有严重的TTV感染；其高发生率可能与细胞免疫功能明显低下及其与血液紧密接触有关。
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中图号：R629.5 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)03-0242-04
Detection of transfusion transmitted virus(TTV) and the relationship between TTV infection and cellular immunity in hemodialysis patients with chronic renal failure
SUN Ji-feng LI Zhan-ting WANG LI WANG Hui-ping LI Guang-yin
(Department of Nephrology, Tangdu Hospital, Forth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China )
, 百拇医药
FU En-qing
(Infection Hospital, Tangdu Hospital, Forth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China )
JIAO Kai
(Department of Endocrinology, Tangdu Hospital, Forth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China )
Abstract: Aim To investigate the relationship between transfusion transmitted virus(TTV) infection in hemodialysis patients with chronic renal failure(CRF) and cellular immunity. Methods The serum TTV DNA, soluble interleukin 2 receptor(sIL 2R)and T lymphocyte subsets in 90 CRF hemodialysis patients and 128 controls were detected by nested RT PCR,Sandwich ELISA and flow cytometry. Furthermore, a partial sequence of TTV genes was randomly selected and determined. The relationships between TTV and transfusion times, long or short duration of hemodialysis, liver function and cellular immunity were analysed. Results ⑴ The positive rates of detected TTV DNA (46.67% ) in 90 hemodialysis patients were significantly higher than those in control group(P∨ 0.001)and the homology reached 98.5% in comparison with the segment of TTV DNA sequences reported by Japanese.⑵ In the serum of hemodialysis patients, sIL 2R level increased significantly in comparison with that in the normal control(P∨ 0.01), and CD3+ , CD4+ T cells and CD4+ /CD8+ T cells markedly decreased(P∨ 0.01). ⑶ The positive rate of detected TTV DNA was positively correlated with the transfusion times, duration of hemodialysis and sIL 2R level (r=0.586, P∨ 0.001; r=0.486, P∨ 0.01; r=0.492, respectively, P∨ 0.01)， and it was negatively correlated with CD3+ , CD4+ T cells and CD4+ /CD8+ T cell ratio (r= 0.476, P∨ 0.01; r= 0.483, P∨ 0.01； r= 0.496， respectively P∨ 0.01)， whereas it was not correlated with age, sex and surgery. Conclusion There is a severe TTV infection in hemodialysis patients with CRF, which may be related to the transfusion times and the low cellular immune function.
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Keywords: chronic renal failure;hemodialysis;transfusion trans mitted virus； T lymphocyte； soluble interleukin 2 recepter▲
慢性肾衰(CRF)维持性血液透析(HD)患者常伴有细胞免疫功能缺陷，表现在极易发生感染和肿瘤发生率高等〔1〕。我们采用巢式逆转录聚合酶链反应(RTPCR)，双抗体夹心ELISA法及流式细胞术，分别对HD患者外周血输血传播病毒(TTV)和可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)外周血T淋巴细胞亚群(CD3+，CD4+T细胞及CD4+/CD8+T细胞的比例)进行了检测，并随机对其中1株TTVDNA的部分基因序列进行测定，观察了慢性肾衰HD患者中TTV感染情况的同时，分析了TTV感染与患者细胞免疫功能、输血次数、HD时间及肝功能的关系，以进一步了解HD患者的免疫状态。
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1 材料和方法
1.1材料HD患者90例，正常对照组128例，分为A，B两组。HD组(A)：均为在我院住院的维持性HD患者，其中男47例，女43例，平均年龄52.3岁(24～64岁)，平均HD时间45.6mo(3～108mo)。HD方法采用GambroAK200血透机、CA130醋酸纤维膜中空透析器，血流量300mL/min，常规碳酸氢盐透析液流量500mL/min，每周透析11h，以肝素钠边缘化法抗凝。其原发病为慢性肾炎(54例)、急进性肾炎(3例)、原发性高血压(9例)、糖尿病(15例)及多囊肾(9例)，均有输血史。正常对照组(B)：为健康体检者，其中男71例，女57例，平均年龄51.2岁(20～78岁)。引物设计和主要材料：TaqDNA聚合酶、dNTP和低熔点琼脂糖，均购自华美公司。引物参照文献〔3〕设计，序列为：
P1：5′GCAGCAGCATATGGATATGT3′；
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P2：5′TGACTGTGCTAAAGCCTCTA3′；
P3：5′CTTACACATGAATGCCAGGC3′；
P4：5′GTACTTCTTGCTGGTGAAAT3′.
P1与P2为外引物，P3与P4为内引物，两对引物均位于ORF1保守区，内引物扩增片段的长度为197bp。2400型PCR仪为美国PE公司产品。
1.2方法
1.2.1标本采集和处理A，B两组分别空腹抽血2mL，置于玻璃试管中，离心分离血清。取20μL于经高压灭菌的1.5mL塑料管中，加等量裂解液煮沸10min，再高速离心10min，保存于20℃备用。
1.2.2TTVDNA的检测采用nRTPCR方法。第1次取上清标本2μL为DNA模板，第2轮以第1轮产物2μL为模板，两次PCR反应的体积均为15μL。其中含2.5mmol/LdNTP1μL,2.5mmol/L引物各1μL(第1轮用两条外引物，第2轮用两条内引物)，Taq酶1.5μL，10×Taq酶buffer1.5μL。顶部以石蜡油封闭，均按下列参数进行PCR：94℃30s，56℃30s，72℃30s，共35个循环。开始循环前先于94℃预变性5min，最后于72℃延伸5min。PCR终产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳后，溴化乙锭染色，紫外线检测仪观察结果，出现197bpDNA扩增带者为阳性。每次PCR中均设有阴性、阳性和空白对照。
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1.2.3PCR产物的序列测定扩增产物经7g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的DNA条带，用原平公司纯化试剂盒进行回收纯化，采用双脱氧链末端终止法直接测序。测序试剂盒购自Promega公司，测序仪为BioRad公司产品。
1.2.4血清sIL2R的测定采用双抗体夹心ELISA法。试剂盒由本校免疫教研室提供，具体操作步骤见说明书。
1.2.5T淋巴细胞亚群的测定取100μL小鼠抗凝全血，加10μLFITC标记的抗CD3+,CD4+,CD8+和IgG鼠抗体(抗体为BeckmanCoullter公司产品)混匀。室温放置15min后，用Qprep自动细胞制备仪，加A、B、C液溶解红细胞和稳定淋巴细胞，轻轻摇10min即用ProfileⅡ型流式细胞仪进行分析(美国Coullter公司)。测定条件：激光光源15mW，氢离子激光，波长488nm，1次检测1000个以上细胞。
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2 结果
2.1慢性肾衰血透患者TTV-DNA的检测TTVDNA阳性血清均出现197bp异性条带，与预计片段的大小相一致。90例HD患者中TTV-DNA阳性血清份数和比率分别为(42和46.67%)，明显高于对照组(3和2.34%，P∨0.001)，表明HD患者存在着严重的TTV感染。
2.2PCR产物部分基因序列的测定为确定nPCR检测TTV-DNA结果的可靠性，我们随机对1株TTV-DNA阳性的nPCR产物直接进行了序列测定，经与日本报道的TTV-DNA序列(AB008394)相比较，二者的同源性为98.5%(图1)。
2.3CRF血透患者细胞免疫功能的检测90例CRF血透患者和128例正常对照者外周血中T细胞亚群(CD3+，CD4+和CD8+)和CD4+/CD8+T细胞的比例，以及sIL-2R的水平见表1。
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表1 CRF血透患者细胞免疫功能的测定(
±s)
Tab 1 Detection of cellular immunity in HD patients with CRF Item
Controlgroup
Hdgroup
BeforeHD
AfterHD
sIL-2R(kU/L)
204.5±86.4
354.5±237.9a
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319.7±209.0a
CD3+Tcells(%)
88.9±8.1
58.2±6.9a
61.8±12.1a
CD4+Tcells(%)
49.7±9.3
31.3±7.8a
37.2±8.4a
CD8+Tcells(%)
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31.2±5.8
22.6±6.1b
27.2±8.6a
CD4+/CD8+Tcell
1.9±0.5
1.2±0.3a
1.4±0.4a
aP∨0.05,bP∨0.01vscontrolgroup.
图1从西安分离的1株TTVDNA的部分核苷酸序列(B)与日本株(A：B008394)的比较
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Fig 1 A partial TTV genes(B)were sequenced randomly selected and the homology in comparison with segment of TTV DNA sequences reported by Japanes(A： B008394)
2.4TTVDNA感染患者的细胞免疫功能及临床特征TTVDNA阳性患者和TTVDNA阴性患者与其年龄、性别及手术史均无显著的差别和相关性；而与输血次数、透析时间及血清sIL2R的水平则呈显著的正相关(分别为：r=0.586，P∨0.001；r=0.486，P∨0.01和r=0.492，P∨0.01)；与CD3+，CD4+T细胞及CD4+/CD8+T细胞的比例呈负相关(r=0.476，P∨0.01和r=0.483，P∨0.01)。血清转氨酶(ALT)正常与异常者，TTV的感染阳性率无统计学差异(P∧0.05，表2)。
表2 TTVDNA感染患者的细胞免疫功能及临床特征
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Tab 2 The relationship between TTV and cellular immunity and the clinic character of the patients with TTV infection Clinicaldata
TTV+group
(n=45)
TTV-group
(n=173)
Age(Yr)
52.8±10.7
62.8±17.5
Sex(M/F)
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47/43
145/169
Transfusionrates(%)
100b
81
Operationrates(%)
42
39
HDduration(mo)
55.6±19.8b
35.2±15.4
AbnormalALT(%)
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15
17
sIL2R(kU/L)
589.2±465.1b
223.1±198.8
CD3+Tcells(%)
36.9±8.0b
78.3±22.9
CD4+Tcells(%)
11.3±7.8b
37.2±8.4
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CD8+Tcells(%)
18.1±4.3b
28.7±7.2
CD4+/CD8+Tcells
0.8±0.2b
1.6±0.5
bP∨0.01vsnegativegroup.
3 讨论
HD是治疗CRF的有效替代方法之一，但HD患者是血源性传播疾病的高危人群，其既是血源性传播疾病的受害者，又是血源性传播疾病重要的传染源。CRF血透患者常伴有明显的免疫功能低下，不仅淋巴细胞总数、T细胞及NK细胞数下降，而且淋巴细胞转化功能降低，sIL-2R表达上调，并与膜表面IL-2R竞争结合IL-2，从而产生免疫抑制作用。另外，目前HD中所用机器、耗材(透析器、血路管和穿刺针)，由于经济条件所限，绝大部分医院尚不能完全做到一次性使用和专人专机；加之肾性贫血患者又经常需输血，从而使HD患者感染TTVDNA的问题日益突出。并随着HD时间的延长危险性明显增加，已成为困扰HD患者生活质量、增加并发症、病死率、移植肾丧失功能和工作人员被传染的主要原因〔4〕。
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1997年，Nishizawa等〔2〕首次运用代表性差异分析技术(representionaldifferenceanalysis)，从一个输血后肝炎患者血清中克隆出一段(500bp)未知的DNA序列(N22收录号：AB008394)，通过分子流行病学研究证实，N22与输血后肝炎呈高度相关，因其主要经输血传播，故暂命名为输血传播病毒(transfusiontransmittedvirus，TTV)。Okamoto等〔3〕报道，TTV基因序列的全长为3739bp，属于无包膜的单股DNA病毒，可能归类于细小病毒科(Parvoviridae)。该病毒编码基因含两个开放读码框(ORF)，ORF1位于该基因组的589～2898位核苷酸，编码774个氨基酸，其N端为富含精氨酸的亲水区；ORF2位于该基因组的107～712位核苷酸，编码172个氨基酸。国内外研究表明，通过血液(包括：献血、血制品、血液透析和骨髓移植等)传播TTV已成共识〔2,3,5〕。此外,粪口途径也是TTV重要的传播途径〔3,61〕。
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我们测出HD组TTVDNA的阳性率为46.67%，较上海地区的HD患者(32.5%)明显高〔7〕，但较安徽地区HD患者(54.4%)低〔8〕。对照组为我院正常体检人员，虽不能完全代表正常人群，但其TTVDNA的检出阳性率很低(2.34%)，与HD组相比较差异明显(P∨0.001)，提示HD组患者均有1次以上输血史，对TTV引起的输血传播应有足够的重视。CRF血透患者引起免疫功能低下的原因相当复杂，目前尚不十分清楚，但可能与CRF患者血中毒素的作用及HD过程中透析膜与白细胞的相互作用等有关。本研究发现，CRF血透患者无论透析前、透析后，其外周血T细胞亚群(CD3+，CD4+，CD8+)和CD4+/CD8+T细胞比例均明显低于正常对照组(P∨0.01)，血清中sIL-2R水平明显高于正常对照组(P∨0.01)；透析后与透析前相比较有改善的趋势但无统计学意义，说明HD患者的T细胞数及转化功能是低下的，这可能是HD患者TTV高感染率的原因之一。目前，对TTV的致病性及其与肝炎的相关性尚不清楚，其生物学特性及流行病学特点，由于我们检测的例数不多，也不十分了解，有待进一步研究和探讨。
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慢性肾衰(CRF)维持性血液透析(HD)患者常伴有细胞免疫功能缺陷，表现在极易发生感染和肿瘤发生率高等〔1〕。我们采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，双抗体夹心ELISA法及流式细胞术，分别对HD患者外周血输血传播病毒(TTV)和可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)外周血T淋巴细胞亚群(CD3+，CD4+T细胞及CD4+/CD8+T细胞的比例)进行了检测，并随机对其中1株TV-DNA的部分基因序列进行测定，观察了慢性肾衰HD患者中TTV感染情况的同时，分析了TTV感染与患者细胞免疫功能、输血次数、HD时间及肝功能的关系，以进一步了解HD患者的免疫状态。■
作者简介：孙脊峰，男，38岁，硕士，讲师，主治医师西安市新寺路1号，Tel.(029)3577424(0) 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit@fmmu.edu.cn
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傅恩清(第四军医大学唐都医院1肾脏内科，2感染病院，3内分泌科，陕西西安710038)
焦凯(第四军医大学唐都医院1肾脏内科，2感染病院，3内分泌科，陕西西安710038)
参考文献:
〔1〕 Chatenoud L,Heberin A,Beaurain G, et al. Immune deficiency of uremia patient〔J〕 . Adv Nephrol,1990;19:259- 261.
〔2〕 Nishizawa T, Okamoto H, Keinishi K,et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transminase levels in post transfusion hepatitis of unknown etiology〔J〕 . Biochem Biophys Res Commun, 1997;241:92- 97.
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〔3〕 Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV)associated with post transfusion of unknown etiology〔J〕 . Hepatol Res,1998;10:1- 16.
〔4〕 Alter MJ, Favero MS, Maynard JE. Impact of infection control strategics on the incidence of dialysis associated hepatitis in the United States〔J〕 . J Infect Dis, 1998;153:1149- 1156.
〔5〕 Charlyon M, Adjei P, Poterucha J, et al. TT virus infection in North American blood donors, patients with fulminant hepatic failure and cryptogenic cirrhosis〔J〕 . Hepatology, 1998; 28:839- 842.
, http://www.100md.com
〔6〕骆抗先,章廉,王珊珊,等.一种新型肠传性病毒性肝炎的流行病学、临床、病理和病毒学的初步研究〔J〕.第一军医大学学报,1998;18：87-90.
〔7〕金根娣,张东华,陆志檬,等.上海地区血透患者与供血者中TTVDNA检测〔C〕.全国第五届病毒性肝炎学术会议论文汇编,1998:254-255.
〔8〕凌斌华,庄辉,李奎,等.我国不同人群输血传播病毒感染调查〔J〕.中华流行病学杂志,1999;20(5):277-279.
收稿日期：1999-10-08
修回日期：1999-12-24, 百拇医药
单位：孙脊峰(第四军医大学唐都医院1肾脏内科，2感染病院，3内分泌科，陕西西安710038)；李占亭(第四军医大学唐都医院1肾脏内科，2感染病院，3内分泌科，陕西西安710038)；王莉(第四军医大学唐都医院1肾脏内科，2感染病院，3内分泌科，陕西西安710038)；王惠萍(第四军医大学唐都医院1肾脏内科，2感染病院，3内分泌科，陕西西安710038)；李光荫(第四军医大学唐都医院1肾脏内科，2感染病院，3内分泌科，陕西西安710038)
关键词：慢性肾衰；血液透析；输血传播病毒；T淋巴细胞；可溶性白细胞介素2受体
细胞与分子免疫学杂志000321
摘要：目的观察慢性肾衰(CRF)血液透析(HD)患者中，输血传播病毒(TTV)的感染与患者细胞免疫功能的关系。方法应用巢式逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)，双抗体夹心ELISA法及流式细胞仪，分别检测了90例CRF血透患者和128例对照组血清TTVDNA，可溶性白细胞介素2受体(sIL2R)和外周血T淋巴细胞亚群。并随机选择对其中1株TTV的部分基因序列进行测定，分析TTV与细胞免疫功能、输血次数、HD时间和肝功能的关系。结果⑴90例CRF血透患者中，TTVDNA阳性率为46.67%，明显高于正常对照组(P∨0.001)，与日本报道的TTVDNA序列(AB008394)相应片段的同源性为98.5%。⑵CRF血透患者血清中，sIL2R水平明显高于正常对照组(P∨0.01)；CD3+，CD4+和CD4+/CD8+T细胞比例明显降低(P∨0.01)。⑶TTVDNA阳性率与sIL2R、输血次数及HD时间呈显著的正相关(r=0.486，P∨0.01；r=0.586，P∨0.001；r=0.492，P∨0.01)，与CD+，CD4+和CD4+/CD8+T细胞比例呈负相关(r=0.476，P∨0.01；r=0.483，P∨0.01；r=0.496，P∨0.01)，而与年龄、性别及手术史均无显著的差别和相关性。结论CRF血透患者有严重的TTV感染；其高发生率可能与细胞免疫功能明显低下及其与血液紧密接触有关。
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中图号：R629.5 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)03-0242-04
Detection of transfusion transmitted virus(TTV) and the relationship between TTV infection and cellular immunity in hemodialysis patients with chronic renal failure
SUN Ji-feng LI Zhan-ting WANG LI WANG Hui-ping LI Guang-yin
(Department of Nephrology, Tangdu Hospital, Forth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China )
, 百拇医药
FU En-qing
(Infection Hospital, Tangdu Hospital, Forth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China )
JIAO Kai
(Department of Endocrinology, Tangdu Hospital, Forth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China )
Abstract: Aim To investigate the relationship between transfusion transmitted virus(TTV) infection in hemodialysis patients with chronic renal failure(CRF) and cellular immunity. Methods The serum TTV DNA, soluble interleukin 2 receptor(sIL 2R)and T lymphocyte subsets in 90 CRF hemodialysis patients and 128 controls were detected by nested RT PCR,Sandwich ELISA and flow cytometry. Furthermore, a partial sequence of TTV genes was randomly selected and determined. The relationships between TTV and transfusion times, long or short duration of hemodialysis, liver function and cellular immunity were analysed. Results ⑴ The positive rates of detected TTV DNA (46.67% ) in 90 hemodialysis patients were significantly higher than those in control group(P∨ 0.001)and the homology reached 98.5% in comparison with the segment of TTV DNA sequences reported by Japanese.⑵ In the serum of hemodialysis patients, sIL 2R level increased significantly in comparison with that in the normal control(P∨ 0.01), and CD3+ , CD4+ T cells and CD4+ /CD8+ T cells markedly decreased(P∨ 0.01). ⑶ The positive rate of detected TTV DNA was positively correlated with the transfusion times, duration of hemodialysis and sIL 2R level (r=0.586, P∨ 0.001; r=0.486, P∨ 0.01; r=0.492, respectively, P∨ 0.01)， and it was negatively correlated with CD3+ , CD4+ T cells and CD4+ /CD8+ T cell ratio (r= 0.476, P∨ 0.01; r= 0.483, P∨ 0.01； r= 0.496， respectively P∨ 0.01)， whereas it was not correlated with age, sex and surgery. Conclusion There is a severe TTV infection in hemodialysis patients with CRF, which may be related to the transfusion times and the low cellular immune function.
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Keywords: chronic renal failure;hemodialysis;transfusion trans mitted virus； T lymphocyte； soluble interleukin 2 recepter▲
慢性肾衰(CRF)维持性血液透析(HD)患者常伴有细胞免疫功能缺陷，表现在极易发生感染和肿瘤发生率高等〔1〕。我们采用巢式逆转录聚合酶链反应(RTPCR)，双抗体夹心ELISA法及流式细胞术，分别对HD患者外周血输血传播病毒(TTV)和可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)外周血T淋巴细胞亚群(CD3+，CD4+T细胞及CD4+/CD8+T细胞的比例)进行了检测，并随机对其中1株TTVDNA的部分基因序列进行测定，观察了慢性肾衰HD患者中TTV感染情况的同时，分析了TTV感染与患者细胞免疫功能、输血次数、HD时间及肝功能的关系，以进一步了解HD患者的免疫状态。
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1 材料和方法
1.1材料HD患者90例，正常对照组128例，分为A，B两组。HD组(A)：均为在我院住院的维持性HD患者，其中男47例，女43例，平均年龄52.3岁(24～64岁)，平均HD时间45.6mo(3～108mo)。HD方法采用GambroAK200血透机、CA130醋酸纤维膜中空透析器，血流量300mL/min，常规碳酸氢盐透析液流量500mL/min，每周透析11h，以肝素钠边缘化法抗凝。其原发病为慢性肾炎(54例)、急进性肾炎(3例)、原发性高血压(9例)、糖尿病(15例)及多囊肾(9例)，均有输血史。正常对照组(B)：为健康体检者，其中男71例，女57例，平均年龄51.2岁(20～78岁)。引物设计和主要材料：TaqDNA聚合酶、dNTP和低熔点琼脂糖，均购自华美公司。引物参照文献〔3〕设计，序列为：
P1：5′GCAGCAGCATATGGATATGT3′；
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P2：5′TGACTGTGCTAAAGCCTCTA3′；
P3：5′CTTACACATGAATGCCAGGC3′；
P4：5′GTACTTCTTGCTGGTGAAAT3′.
P1与P2为外引物，P3与P4为内引物，两对引物均位于ORF1保守区，内引物扩增片段的长度为197bp。2400型PCR仪为美国PE公司产品。
1.2方法
1.2.1标本采集和处理A，B两组分别空腹抽血2mL，置于玻璃试管中，离心分离血清。取20μL于经高压灭菌的1.5mL塑料管中，加等量裂解液煮沸10min，再高速离心10min，保存于20℃备用。
1.2.2TTVDNA的检测采用nRTPCR方法。第1次取上清标本2μL为DNA模板，第2轮以第1轮产物2μL为模板，两次PCR反应的体积均为15μL。其中含2.5mmol/LdNTP1μL,2.5mmol/L引物各1μL(第1轮用两条外引物，第2轮用两条内引物)，Taq酶1.5μL，10×Taq酶buffer1.5μL。顶部以石蜡油封闭，均按下列参数进行PCR：94℃30s，56℃30s，72℃30s，共35个循环。开始循环前先于94℃预变性5min，最后于72℃延伸5min。PCR终产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳后，溴化乙锭染色，紫外线检测仪观察结果，出现197bpDNA扩增带者为阳性。每次PCR中均设有阴性、阳性和空白对照。
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1.2.3PCR产物的序列测定扩增产物经7g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的DNA条带，用原平公司纯化试剂盒进行回收纯化，采用双脱氧链末端终止法直接测序。测序试剂盒购自Promega公司，测序仪为BioRad公司产品。
1.2.4血清sIL2R的测定采用双抗体夹心ELISA法。试剂盒由本校免疫教研室提供，具体操作步骤见说明书。
1.2.5T淋巴细胞亚群的测定取100μL小鼠抗凝全血，加10μLFITC标记的抗CD3+,CD4+,CD8+和IgG鼠抗体(抗体为BeckmanCoullter公司产品)混匀。室温放置15min后，用Qprep自动细胞制备仪，加A、B、C液溶解红细胞和稳定淋巴细胞，轻轻摇10min即用ProfileⅡ型流式细胞仪进行分析(美国Coullter公司)。测定条件：激光光源15mW，氢离子激光，波长488nm，1次检测1000个以上细胞。
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2 结果
2.1慢性肾衰血透患者TTV-DNA的检测TTVDNA阳性血清均出现197bp异性条带，与预计片段的大小相一致。90例HD患者中TTV-DNA阳性血清份数和比率分别为(42和46.67%)，明显高于对照组(3和2.34%，P∨0.001)，表明HD患者存在着严重的TTV感染。
2.2PCR产物部分基因序列的测定为确定nPCR检测TTV-DNA结果的可靠性，我们随机对1株TTV-DNA阳性的nPCR产物直接进行了序列测定，经与日本报道的TTV-DNA序列(AB008394)相比较，二者的同源性为98.5%(图1)。
2.3CRF血透患者细胞免疫功能的检测90例CRF血透患者和128例正常对照者外周血中T细胞亚群(CD3+，CD4+和CD8+)和CD4+/CD8+T细胞的比例，以及sIL-2R的水平见表1。
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表1 CRF血透患者细胞免疫功能的测定(
±s)Tab 1 Detection of cellular immunity in HD patients with CRF Item
Controlgroup
Hdgroup
BeforeHD
AfterHD
sIL-2R(kU/L)
204.5±86.4
354.5±237.9a
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319.7±209.0a
CD3+Tcells(%)
88.9±8.1
58.2±6.9a
61.8±12.1a
CD4+Tcells(%)
49.7±9.3
31.3±7.8a
37.2±8.4a
CD8+Tcells(%)
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31.2±5.8
22.6±6.1b
27.2±8.6a
CD4+/CD8+Tcell
1.9±0.5
1.2±0.3a
1.4±0.4a
aP∨0.05,bP∨0.01vscontrolgroup.
图1从西安分离的1株TTVDNA的部分核苷酸序列(B)与日本株(A：B008394)的比较
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Fig 1 A partial TTV genes(B)were sequenced randomly selected and the homology in comparison with segment of TTV DNA sequences reported by Japanes(A： B008394)
2.4TTVDNA感染患者的细胞免疫功能及临床特征TTVDNA阳性患者和TTVDNA阴性患者与其年龄、性别及手术史均无显著的差别和相关性；而与输血次数、透析时间及血清sIL2R的水平则呈显著的正相关(分别为：r=0.586，P∨0.001；r=0.486，P∨0.01和r=0.492，P∨0.01)；与CD3+，CD4+T细胞及CD4+/CD8+T细胞的比例呈负相关(r=0.476，P∨0.01和r=0.483，P∨0.01)。血清转氨酶(ALT)正常与异常者，TTV的感染阳性率无统计学差异(P∧0.05，表2)。
表2 TTVDNA感染患者的细胞免疫功能及临床特征
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Tab 2 The relationship between TTV and cellular immunity and the clinic character of the patients with TTV infection Clinicaldata
TTV+group
(n=45)
TTV-group
(n=173)
Age(Yr)
52.8±10.7
62.8±17.5
Sex(M/F)
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47/43
145/169
Transfusionrates(%)
100b
81
Operationrates(%)
42
39
HDduration(mo)
55.6±19.8b
35.2±15.4
AbnormalALT(%)
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15
17
sIL2R(kU/L)
589.2±465.1b
223.1±198.8
CD3+Tcells(%)
36.9±8.0b
78.3±22.9
CD4+Tcells(%)
11.3±7.8b
37.2±8.4
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CD8+Tcells(%)
18.1±4.3b
28.7±7.2
CD4+/CD8+Tcells
0.8±0.2b
1.6±0.5
bP∨0.01vsnegativegroup.
3 讨论
HD是治疗CRF的有效替代方法之一，但HD患者是血源性传播疾病的高危人群，其既是血源性传播疾病的受害者，又是血源性传播疾病重要的传染源。CRF血透患者常伴有明显的免疫功能低下，不仅淋巴细胞总数、T细胞及NK细胞数下降，而且淋巴细胞转化功能降低，sIL-2R表达上调，并与膜表面IL-2R竞争结合IL-2，从而产生免疫抑制作用。另外，目前HD中所用机器、耗材(透析器、血路管和穿刺针)，由于经济条件所限，绝大部分医院尚不能完全做到一次性使用和专人专机；加之肾性贫血患者又经常需输血，从而使HD患者感染TTVDNA的问题日益突出。并随着HD时间的延长危险性明显增加，已成为困扰HD患者生活质量、增加并发症、病死率、移植肾丧失功能和工作人员被传染的主要原因〔4〕。
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1997年，Nishizawa等〔2〕首次运用代表性差异分析技术(representionaldifferenceanalysis)，从一个输血后肝炎患者血清中克隆出一段(500bp)未知的DNA序列(N22收录号：AB008394)，通过分子流行病学研究证实，N22与输血后肝炎呈高度相关，因其主要经输血传播，故暂命名为输血传播病毒(transfusiontransmittedvirus，TTV)。Okamoto等〔3〕报道，TTV基因序列的全长为3739bp，属于无包膜的单股DNA病毒，可能归类于细小病毒科(Parvoviridae)。该病毒编码基因含两个开放读码框(ORF)，ORF1位于该基因组的589～2898位核苷酸，编码774个氨基酸，其N端为富含精氨酸的亲水区；ORF2位于该基因组的107～712位核苷酸，编码172个氨基酸。国内外研究表明，通过血液(包括：献血、血制品、血液透析和骨髓移植等)传播TTV已成共识〔2,3,5〕。此外,粪口途径也是TTV重要的传播途径〔3,61〕。
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我们测出HD组TTVDNA的阳性率为46.67%，较上海地区的HD患者(32.5%)明显高〔7〕，但较安徽地区HD患者(54.4%)低〔8〕。对照组为我院正常体检人员，虽不能完全代表正常人群，但其TTVDNA的检出阳性率很低(2.34%)，与HD组相比较差异明显(P∨0.001)，提示HD组患者均有1次以上输血史，对TTV引起的输血传播应有足够的重视。CRF血透患者引起免疫功能低下的原因相当复杂，目前尚不十分清楚，但可能与CRF患者血中毒素的作用及HD过程中透析膜与白细胞的相互作用等有关。本研究发现，CRF血透患者无论透析前、透析后，其外周血T细胞亚群(CD3+，CD4+，CD8+)和CD4+/CD8+T细胞比例均明显低于正常对照组(P∨0.01)，血清中sIL-2R水平明显高于正常对照组(P∨0.01)；透析后与透析前相比较有改善的趋势但无统计学意义，说明HD患者的T细胞数及转化功能是低下的，这可能是HD患者TTV高感染率的原因之一。目前，对TTV的致病性及其与肝炎的相关性尚不清楚，其生物学特性及流行病学特点，由于我们检测的例数不多，也不十分了解，有待进一步研究和探讨。
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慢性肾衰(CRF)维持性血液透析(HD)患者常伴有细胞免疫功能缺陷，表现在极易发生感染和肿瘤发生率高等〔1〕。我们采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，双抗体夹心ELISA法及流式细胞术，分别对HD患者外周血输血传播病毒(TTV)和可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)外周血T淋巴细胞亚群(CD3+，CD4+T细胞及CD4+/CD8+T细胞的比例)进行了检测，并随机对其中1株TV-DNA的部分基因序列进行测定，观察了慢性肾衰HD患者中TTV感染情况的同时，分析了TTV感染与患者细胞免疫功能、输血次数、HD时间及肝功能的关系，以进一步了解HD患者的免疫状态。■
作者简介：孙脊峰，男，38岁，硕士，讲师，主治医师西安市新寺路1号，Tel.(029)3577424(0) 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit@fmmu.edu.cn
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傅恩清(第四军医大学唐都医院1肾脏内科，2感染病院，3内分泌科，陕西西安710038)
焦凯(第四军医大学唐都医院1肾脏内科，2感染病院，3内分泌科，陕西西安710038)
参考文献:
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〔2〕 Nishizawa T, Okamoto H, Keinishi K,et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transminase levels in post transfusion hepatitis of unknown etiology〔J〕 . Biochem Biophys Res Commun, 1997;241:92- 97.
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〔3〕 Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV)associated with post transfusion of unknown etiology〔J〕 . Hepatol Res,1998;10:1- 16.
〔4〕 Alter MJ, Favero MS, Maynard JE. Impact of infection control strategics on the incidence of dialysis associated hepatitis in the United States〔J〕 . J Infect Dis, 1998;153:1149- 1156.
〔5〕 Charlyon M, Adjei P, Poterucha J, et al. TT virus infection in North American blood donors, patients with fulminant hepatic failure and cryptogenic cirrhosis〔J〕 . Hepatology, 1998; 28:839- 842.
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〔7〕金根娣,张东华,陆志檬,等.上海地区血透患者与供血者中TTVDNA检测〔C〕.全国第五届病毒性肝炎学术会议论文汇编,1998:254-255.
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收稿日期：1999-10-08
修回日期：1999-12-24, 百拇医药