人骨形成蛋白-7成熟肽cDNA的克隆和序列测定
作者：王琦 柴玉波 李毅 陈南春 薄勤 陈苏民
单位：王琦(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032)；柴玉波(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032)；李毅(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032)；陈南春(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032)；薄勤(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032)；陈苏民(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032)
关键词：骨形成蛋白-7；克隆；序列测定
细胞与分子免疫学杂志000310
中图号： Q786 文献标识码：B 文章编号：1007-8738(2000)03-0213-02▲
, 百拇医药
人骨形成蛋白7(hBMP7)最早由Celeste等〔1〕克隆并命名。同年，Ozkaynat等〔2〕从人脑cDNA文库中也筛选出此克隆。以后研究表明，BMP7除了诱导成骨外，还具有广泛的生物学活性〔3-6〕。由于hBMP7在神经系统及造血组织中的特殊作用，故其在基础研究和临床应用中具有广阔的前景。我们采用自行设计合成的一对特异性引物，以骨肉瘤的λgt11噬菌体表达文库为模板，通过PCR扩增到hBMP7成熟肽的cDNA。将其克隆入载体pGEM3zf()，所获序列与已发表的序列完全一致，为进一步对其表达和功能研究创造了条件。
图1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
1:PCRmarker(从上至下为：1543，994，697，515，377和237bp)；2：PCR产物.
, 百拇医药
图2重组质粒pGEB7的酶
切鉴定
1：PCRmarker(从上至下为：1543，994，697，515，377和237bp)；2：重组质粒pGEB7的EcoRI+HindIII双酶切.
1 材料和方法
1.1材料大肠杆菌DH5α及质粒pGEM3zf(-)均为本室保存。骨肉瘤细胞U2-OS的λgt11噬菌体表达文库为本室构建。各种限制性内切酶、连接酶和Taq酶均为Gibco公司的产品。AdvantagePCR-purekit为Clontech公司产品。常用试剂为进口分装或国产分析纯。PCR扩增引物自行设计，由上海生物工程中心合成。引物的序列如下：
P1：5′TTTAAATGTCCACGGGGAGCAAAC3′;
, 百拇医药
P2：5′GCGTCGACTTAGTGGCAGCCACAG3′.
1.2方法
1.2.1hBMP7成熟肽基因的扩增PCR反应体系：P1和P2引物(20mmol/L)各1μL，dNTP(10mmol/L)1μL，模板λgt11噬菌体3μL，10×PCRbuffer5μL和Taq酶1U，加水至总体积50μL。PCR反应条件：94℃30s，50℃30s，72℃30s反应5个循环。然后，于94℃30s，55℃30s，72℃30s，反应30个循环。PCR产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.2重组质粒的构建用HincII酶切载体pGEM3zf(-)并回收，同时回收PCR产物，用T4连接酶连接，转化感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆。
1.2.3序列测定利用PE公司ABI310型全自动核酸测序仪进行。
, 百拇医药
2 结果
2.1hBMP-7成熟肽基因的扩增以λgt11噬菌体表达文库为模板，利用自行设计的一对引物，进行PCR扩增hBMP-7成熟肽基因。经两段反应共35个循环后，用15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得约440bp的特异条带，与预期的大小相一致(图1)。
2.2重组质粒的构建回收440bp片段，在T4连接酶作用下，与用HincII酶切的质粒pGEM3zf(-)于16℃连接过夜。以连接产物转化感受态细胞DH5α，加入IPTG和X-gal进行蓝白筛选。随机挑取白色克隆，提取质粒，用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切。经15g/L琼脂糖凝胶鉴定表明，切出440bp片段者为阳性克隆(图2)，将此重组质粒命名为pGEB7。
2.3序列测定利用PE公司ABI310型全自动核酸测序仪测定hBMP7成熟肽基因的序列，所得结果与已发表的序列完全一致(图3)。
, 百拇医药
TCCACGGGGAGCAAACAGCGCAGCCAGAACCGCTCCAAGACGCCCAAGAACCAGGAAGCC(60)
CTGCGGATGGCCAACGTGGCAGAGAACAGCAGCAGCGACCAGAGGCAGGCCTGTAAGAAG(120)
CACGAGCTGTATGTCAGCTTCCGAGACCTGGGCTGGCAGGACTGGATCATCGCGCCTGAA(180)
GGCTACGCCGCCTACTACTGTGAGGGGGAGTGTGCCTTCCCTCTGAACTCCTACATGAAC(240)
GCCACCAACCACGCCATCGTGCAGACGCTGGTCCACTTCATCAACCCGCAAACGGTGCCC(300)
, 百拇医药 AAGCCCTGCTGTGCGCCCACGCAGCTCAATGCCATCTCCGTCCTCTACTTCGATGACAGC(360)
TCCAACGTCATCCTGAAGAAATACAGAAACATGGTGGTCCGGGCCTGTGGCTGCCACTAG(420)
图3BMP7成熟肽编码基因的部分核苷酸序列
3 讨论
hBMP-7具有广泛的生物学活性：①胚胎发育中所产生的BMP-7和BMP-4是诱导交感神经元分化的信号分子。②能抑制胚胎癌性细胞(ECC)的增殖，诱导其分化，可能对一些干细胞肿瘤有治疗价值。③对牙齿的修复、形成有重要作用。④对鼠胚胎菱脑的发育和形成有一定影响，为哺乳动物眼部发育所必需〔5〕。剔除(knockout)该基因的小鼠出生不久即死于肾脏发育不良，提示其可能与小儿肾功能不良所致贫血和骨骼发育不良有关，从而使其在基础研究和临床应用等方面具有比较重要的价值。但天然来源的BMP-7较少，限制了对其功能的研究。国外多用真核表达系统表达BMP-7，只有极少数人尝试用原核表达系统进行表达研究〔7〕，并获得活性产物。以往认为，BMP原核表达后，难以获得高活性的产物，且表达产物往往处于非溶解状态，可溶性产物的量极少。近来本室在原核表达的BMP-2的复性方面获得了突破〔8〕，可得到大量可溶性重组BMP产品，为其体外活性测定方法的建立及功能研究提供了极大的便利。为进一步阐明BMP7结构与功能的关系，研究其在肾脏、神经系统发育及造血系统中的作用，克隆BMP-7成熟肽基因很有必要。
, 百拇医药
我们以骨肉瘤细胞U2-OS的λgt11噬菌体表达文库为模板，利用自行设计的一对引物，仅一轮扩增即得到单1条带。测序结果表明，设计的引物特异性强，扩增得到的基因正确。将扩增产物以平端克隆入载体pGEM3zf(-)，可避免由于酶切处理过程的损失，无论是正向或反向克隆入载体都不影响测序，而且不会破坏引物中所含的酶切位点和起始密码子。hBMP-7成熟肽基因克隆的成功，为其原核表达以及功能研究和应用奠定了基础。■
作者简介：王琦，男，24岁，助教现工作单位：兰州市段家滩171号，解放军兰州医高专生化教研室，Tel.(0931)8972157 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit@fmmu.edu.cn ISSN 1007 8738 细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志 (J Cell Mol Immunol)2000;16(3)
参考文献：
, 百拇医药
〔1〕 Celeste AJ, Iannazzi JA, Taylor RC, et al. Identification of transforming growth factor family members present in bone inductive protein purified form bovine bone〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA, 1990; 87:9843- 9847.
〔2〕 Ozkaynak E, Rueger DC, Drier EA, et al. OP 1 cDNA encodes an osteogenic protein in the TGF β family〔J〕 . EMBO J, 1990; 9: 2085- 2093.
〔3〕 Reissmann E, Ernsberger U, Francis West PH, et al. Involvement of BMP4 and BMP7 in differentiation of the adrenergic phenotype in developing sympathetic neurons〔J〕 . Development, 1996; 122(7):2079- 2088.
, 百拇医药
〔4〕 Giannobile WV, Ryan S, Shih MS, et al. Recombinant human osteogenic protein 1 (OP 1) stimulates periodontal wound healing in class III furcation defects〔J〕 . J Periodontol, 1998; 69(2):129- 137.
〔5〕 Arkell R, Beddington RS. BMP 7 influences pattern and growth of the developing hind brain of mouse embryos〔J〕 . Development, 1997; 124:1- 12.
〔6〕 Luo G, Hofmann C, Bronckers AL, et al. BMP 7 is an inducer of nephrogenesis, and is also required for eye development and skeletal patterning〔J〕 . Genes Development, 1995; 9:2808- 2820.
〔7〕 Wolfman NM. Mutants of bone morphogenetic proteins〔P〕 . 美 国 专 利 U.S.Patent. 1995; PN:5,399,677.
〔8〕 田琼，张绍章，蒲勤.重组人骨形成蛋白-2成熟肽对小鼠辐射损伤的治疗作用及其机制的探 讨〔J〕. 中华放射医学与防护杂志，1998；18(4)：253-255.
收稿日期：1999-08-06
修回日期：1999-10-08, 百拇医药
单位：王琦(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032)；柴玉波(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032)；李毅(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032)；陈南春(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032)；薄勤(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032)；陈苏民(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，陕西西安 710032)
关键词：骨形成蛋白-7；克隆；序列测定
细胞与分子免疫学杂志000310
中图号： Q786 文献标识码：B 文章编号：1007-8738(2000)03-0213-02▲
, 百拇医药
人骨形成蛋白7(hBMP7)最早由Celeste等〔1〕克隆并命名。同年，Ozkaynat等〔2〕从人脑cDNA文库中也筛选出此克隆。以后研究表明，BMP7除了诱导成骨外，还具有广泛的生物学活性〔3-6〕。由于hBMP7在神经系统及造血组织中的特殊作用，故其在基础研究和临床应用中具有广阔的前景。我们采用自行设计合成的一对特异性引物，以骨肉瘤的λgt11噬菌体表达文库为模板，通过PCR扩增到hBMP7成熟肽的cDNA。将其克隆入载体pGEM3zf()，所获序列与已发表的序列完全一致，为进一步对其表达和功能研究创造了条件。
图1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
1:PCRmarker(从上至下为：1543，994，697，515，377和237bp)；2：PCR产物.
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图2重组质粒pGEB7的酶
切鉴定
1：PCRmarker(从上至下为：1543，994，697，515，377和237bp)；2：重组质粒pGEB7的EcoRI+HindIII双酶切.
1 材料和方法
1.1材料大肠杆菌DH5α及质粒pGEM3zf(-)均为本室保存。骨肉瘤细胞U2-OS的λgt11噬菌体表达文库为本室构建。各种限制性内切酶、连接酶和Taq酶均为Gibco公司的产品。AdvantagePCR-purekit为Clontech公司产品。常用试剂为进口分装或国产分析纯。PCR扩增引物自行设计，由上海生物工程中心合成。引物的序列如下：
P1：5′TTTAAATGTCCACGGGGAGCAAAC3′;
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P2：5′GCGTCGACTTAGTGGCAGCCACAG3′.
1.2方法
1.2.1hBMP7成熟肽基因的扩增PCR反应体系：P1和P2引物(20mmol/L)各1μL，dNTP(10mmol/L)1μL，模板λgt11噬菌体3μL，10×PCRbuffer5μL和Taq酶1U，加水至总体积50μL。PCR反应条件：94℃30s，50℃30s，72℃30s反应5个循环。然后，于94℃30s，55℃30s，72℃30s，反应30个循环。PCR产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.2重组质粒的构建用HincII酶切载体pGEM3zf(-)并回收，同时回收PCR产物，用T4连接酶连接，转化感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆。
1.2.3序列测定利用PE公司ABI310型全自动核酸测序仪进行。
, 百拇医药
2 结果
2.1hBMP-7成熟肽基因的扩增以λgt11噬菌体表达文库为模板，利用自行设计的一对引物，进行PCR扩增hBMP-7成熟肽基因。经两段反应共35个循环后，用15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得约440bp的特异条带，与预期的大小相一致(图1)。
2.2重组质粒的构建回收440bp片段，在T4连接酶作用下，与用HincII酶切的质粒pGEM3zf(-)于16℃连接过夜。以连接产物转化感受态细胞DH5α，加入IPTG和X-gal进行蓝白筛选。随机挑取白色克隆，提取质粒，用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切。经15g/L琼脂糖凝胶鉴定表明，切出440bp片段者为阳性克隆(图2)，将此重组质粒命名为pGEB7。
2.3序列测定利用PE公司ABI310型全自动核酸测序仪测定hBMP7成熟肽基因的序列，所得结果与已发表的序列完全一致(图3)。
, 百拇医药
TCCACGGGGAGCAAACAGCGCAGCCAGAACCGCTCCAAGACGCCCAAGAACCAGGAAGCC(60)
CTGCGGATGGCCAACGTGGCAGAGAACAGCAGCAGCGACCAGAGGCAGGCCTGTAAGAAG(120)
CACGAGCTGTATGTCAGCTTCCGAGACCTGGGCTGGCAGGACTGGATCATCGCGCCTGAA(180)
GGCTACGCCGCCTACTACTGTGAGGGGGAGTGTGCCTTCCCTCTGAACTCCTACATGAAC(240)
GCCACCAACCACGCCATCGTGCAGACGCTGGTCCACTTCATCAACCCGCAAACGGTGCCC(300)
, 百拇医药 AAGCCCTGCTGTGCGCCCACGCAGCTCAATGCCATCTCCGTCCTCTACTTCGATGACAGC(360)
TCCAACGTCATCCTGAAGAAATACAGAAACATGGTGGTCCGGGCCTGTGGCTGCCACTAG(420)
图3BMP7成熟肽编码基因的部分核苷酸序列
3 讨论
hBMP-7具有广泛的生物学活性：①胚胎发育中所产生的BMP-7和BMP-4是诱导交感神经元分化的信号分子。②能抑制胚胎癌性细胞(ECC)的增殖，诱导其分化，可能对一些干细胞肿瘤有治疗价值。③对牙齿的修复、形成有重要作用。④对鼠胚胎菱脑的发育和形成有一定影响，为哺乳动物眼部发育所必需〔5〕。剔除(knockout)该基因的小鼠出生不久即死于肾脏发育不良，提示其可能与小儿肾功能不良所致贫血和骨骼发育不良有关，从而使其在基础研究和临床应用等方面具有比较重要的价值。但天然来源的BMP-7较少，限制了对其功能的研究。国外多用真核表达系统表达BMP-7，只有极少数人尝试用原核表达系统进行表达研究〔7〕，并获得活性产物。以往认为，BMP原核表达后，难以获得高活性的产物，且表达产物往往处于非溶解状态，可溶性产物的量极少。近来本室在原核表达的BMP-2的复性方面获得了突破〔8〕，可得到大量可溶性重组BMP产品，为其体外活性测定方法的建立及功能研究提供了极大的便利。为进一步阐明BMP7结构与功能的关系，研究其在肾脏、神经系统发育及造血系统中的作用，克隆BMP-7成熟肽基因很有必要。
, 百拇医药
我们以骨肉瘤细胞U2-OS的λgt11噬菌体表达文库为模板，利用自行设计的一对引物，仅一轮扩增即得到单1条带。测序结果表明，设计的引物特异性强，扩增得到的基因正确。将扩增产物以平端克隆入载体pGEM3zf(-)，可避免由于酶切处理过程的损失，无论是正向或反向克隆入载体都不影响测序，而且不会破坏引物中所含的酶切位点和起始密码子。hBMP-7成熟肽基因克隆的成功，为其原核表达以及功能研究和应用奠定了基础。■
作者简介：王琦，男，24岁，助教现工作单位：兰州市段家滩171号，解放军兰州医高专生化教研室，Tel.(0931)8972157 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit@fmmu.edu.cn ISSN 1007 8738 细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志 (J Cell Mol Immunol)2000;16(3)
参考文献：
, 百拇医药
〔1〕 Celeste AJ, Iannazzi JA, Taylor RC, et al. Identification of transforming growth factor family members present in bone inductive protein purified form bovine bone〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA, 1990; 87:9843- 9847.
〔2〕 Ozkaynak E, Rueger DC, Drier EA, et al. OP 1 cDNA encodes an osteogenic protein in the TGF β family〔J〕 . EMBO J, 1990; 9: 2085- 2093.
〔3〕 Reissmann E, Ernsberger U, Francis West PH, et al. Involvement of BMP4 and BMP7 in differentiation of the adrenergic phenotype in developing sympathetic neurons〔J〕 . Development, 1996; 122(7):2079- 2088.
, 百拇医药
〔4〕 Giannobile WV, Ryan S, Shih MS, et al. Recombinant human osteogenic protein 1 (OP 1) stimulates periodontal wound healing in class III furcation defects〔J〕 . J Periodontol, 1998; 69(2):129- 137.
〔5〕 Arkell R, Beddington RS. BMP 7 influences pattern and growth of the developing hind brain of mouse embryos〔J〕 . Development, 1997; 124:1- 12.
〔6〕 Luo G, Hofmann C, Bronckers AL, et al. BMP 7 is an inducer of nephrogenesis, and is also required for eye development and skeletal patterning〔J〕 . Genes Development, 1995; 9:2808- 2820.
〔7〕 Wolfman NM. Mutants of bone morphogenetic proteins〔P〕 . 美 国 专 利 U.S.Patent. 1995; PN:5,399,677.
〔8〕 田琼，张绍章，蒲勤.重组人骨形成蛋白-2成熟肽对小鼠辐射损伤的治疗作用及其机制的探 讨〔J〕. 中华放射医学与防护杂志，1998；18(4)：253-255.
收稿日期：1999-08-06
修回日期：1999-10-08, 百拇医药