IL-12的真核表达载体增强小鼠对DNA疫苗的免疫应答
作者：杜德伟 周永兴 冯志华 姚志强
单位：杜德伟(第四军医大学唐都医院感染病防治中心，陕西西安 710038)；周永兴(第四军医大学唐都医院感染病防治中心，陕西西安 710038)；冯志华(第四军医大学唐都医院感染病防治中心，陕西西安 710038)；姚志强(第四军医大学唐都医院感染病防治中心，陕西西安 710038)
关键词：基因疫苗；乙型肝炎表面抗原；小鼠；IL-12；真核表达载体
细胞与分子免疫学杂志000309
中图号:R：512.6 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)03-0211-02▲
病毒感染严重危害人类身体健康,清除病毒感染主要依靠细胞免疫或细胞因子的作用。细胞免疫是通过特异性CTL识别、杀伤破坏病毒感染的细胞，以清除感染细胞内的病毒。大量资料表明，慢性乙型肝炎及其病毒携带者的细胞免疫功能明显低下〔1〕。基因疫苗(核酸疫苗和DNA疫苗)是指含有编码某种蛋白抗原基因的真核表达质粒，直接接种体内后，可被体细胞摄取并表达相应抗原，进而激发保护性免疫应答，包括特异性CTL应答及特异性抗体的产生〔2〕。IL-12是目前发现的对体内免疫活性细胞诱导和调节作用最强、范围最广的细胞因子。我们将HBVDNA疫苗(pCR3.1-S)〔3〕与编码鼠IL-12的真核表达载体〔4〕pWRG3169(下简称IL-12)共同免疫小鼠后，观察其对小鼠免疫应答的影响。
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1 材料和方法
1.1材料雌性Balb/c小鼠,5～8wk龄,体重15～20g,购自本校实验动物中心。P815小鼠肥大细胞瘤细胞系由本室保存，含有HBVS抗原的真核表达质粒pCR3.1S，系姚志强教授在比利时鲁汶大学构建。编码鼠IL12p35，p40的真核表达载体pWRG3169由美国Rakhmilevich博士惠赠。脂质体为美国Gibco公司产品；G418，RPMI1640细胞培养基为美国Sigma公司产品；小牛血清为杭州四季青公司产品；抗HBsELISA检测试剂盒及异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG，购于华美西安公司。小鼠抗HBs、抗小鼠CD4+，CD8+单克隆抗体(mAb)，购于武汉博士德公司。
1.2方法
1.2.1质粒转染P815细胞及表达产物的检测用碱裂解法大量提取质粒，并经聚乙二醇(PEG)沉淀法纯化。采用脂质体转染技术将纯化后的pCR3.1S质粒转染P815细胞，用含G418(350mg/L)的细胞培养基筛选。当对照细胞大部分死亡后，换含G418(150mg/L)的细胞培养基培养约2wk，以间接免疫荧光法检测转染细胞内HBsAg的表达。表达HBsAg的细胞作为杀伤实验中的靶细胞。
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1.2.2质粒免疫及抗HBs的检测将15只小鼠随机分为3组，每组5只，以5g/L布比卡因和10g/L对羟基苯甲酸甲酯处理小鼠股四头肌，24h后，于同一部位注射质粒。第1组：注射100μgpCR3.1空载体，第2组：注射pCR3.1和pCR3.1S各50μg，第3组：注射pCR3.1S和IL12各50μg，每2wk1次，连续8wk。免疫后，剪尾采血100μL取上清，用间接ELISA检测试剂盒测定血清抗HBs，操作按照说明书进行。
1.2.3小鼠特异性CTL杀伤活性测定小鼠免疫8wk后，拉颈处死，无菌取其脾脏，研磨过滤制成单细胞悬液，用4h51Cr释放法测定CTL的杀伤效应，效应细胞∶靶细胞(E∶T)为100∶1。其计算公式：
2 结果
2.1IL-12基因真核表达载体对抗HBs产生的影响
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小鼠血清抗HBs的水平随免疫次数的增加而增加。IL12基因真核表达载体可提高基因疫苗诱导小鼠产生抗HBs，与单纯HBV基因疫苗诱导小鼠产生抗HBs相比较差异显著(P∨0.01,图1)。
2.2IL-12基因真核表达载体对特异性CTL杀伤活性的影响IL12基因真核表达载体可明显提高小鼠脾细胞HBsAg特异性CTL的杀伤活性。与对照组相比较具有显著性差异(P∨0.01，图2)。
图1IL12真核表达载体对HBV基因疫苗诱导小鼠抗
HBs的影响
图2IL12真核表达载体对HBV基因疫苗诱导CTL杀伤活性的影响
, 百拇医药
3 讨论
基因疫苗在许多疾病的防治中显示出广泛的应用前景〔3〕。1998年，MacGregor〔5〕首次报道了基因疫苗治疗HIV-1感染者的人体实验结果。但不同的疫苗相差悬殊，有些疫苗甚至在大剂量长期使用时仍很难诱发有效的免疫应答〔6〕。
本实验以含有HBVS区的DNA疫苗与编码IL12的真核表达载体共同免疫小鼠，结果显示，IL12真核表达载体可明显提高基因疫苗诱导的免疫应答，联合免疫小鼠血清抗HBs抗体在任何时间点上，均较单纯HBV基因疫苗免疫组明显增高。体外杀伤实验证实，IL-12真核表达载体可明显提高DNA疫苗诱导的CTL的杀伤活性，与对照组相比较差异显著(P∨0.05)。用抗CD8+mAb处理效应细胞后，CTL的杀伤效应明显降低；而用抗CD4+mAb对CTL的杀伤效应无明显影响，表明CTL的杀伤作用由CD8+T淋巴细胞介导，与国外文献报道〔7〕一致。但也有报道〔8〕，在原始的MLC中加入IL-12，可使CD8+/CD4+T细胞的比率下降50%，并可抑制继发性IFN-γ的产生。IL-12是如何提高CTL的杀伤活性？尚待进一步阐明。
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HBV基因组中的S区是唯一能够刺激机体产生保护性抗体的区域。此外，HBsAg蛋白的28～39多肽还能诱导特异性的TCL反应〔2〕，表明以S区基因刺激机体可能产生针对同一病毒感染的细胞免疫及体液免疫应答。Davis〔9〕等用HBVDNA疫苗免疫HBsAg转基因小鼠，发现DNA疫苗可使对HBsAg无应答的转基因小鼠产生免疫应答。Chow〔10〕等发现，注射编码不同细胞因子的真核表达载体可提高和调节机体对疫苗的免疫应答。IL-12是一种重要的抗病毒细胞因子，其独特的、最重要的生物学活性是，调节Th1与Th2细胞之间的平衡及诱导内源性IFN-γ的产生。而IFNγ又可促进IL-12的产生,二者形成正反馈途径，共同调节T细胞亚群的分化，使CD4+Th0向Th1分化，刺激细胞分化增殖，从而促进细胞免疫应答。以上表明，DNA疫苗具有预防作用及治疗作用。另外，IL12能使小鼠产生的IgG2a，IgG2b及IgG3的产生增加10～100倍，此免疫球蛋白亚类与Th1活化有关〔11〕。IL-12真核表达载体主要起免疫佐剂的作用，这种作用依赖于两种质粒的共注射，若分别注射两种质粒对免疫应答无影响，说明该细胞因子只有与抗原注射于同一部位才能发挥其佐剂作用〔10〕。
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鉴于HBV感染目前尚无理想的治疗措施，因此，本研究关于细胞因子对DNA疫苗诱导的免疫应答具有促进作用的结果，为临床防治HBV感染提供了有效的实验依据。■
基金项目：国家自然科学基金资助,No.69770665
作者简介：杜德伟，男，32岁，主治医师，讲师，硕士生西安市新寺路1号， Tel.(029)3577595
参考文献 ：
〔1〕 Geissler M, Tokashige K, wakita T, et al. Differential cellular and humoral immunization using chimeric constructs〔J〕 . Vaccine， 1998; 16(8)： 857- 867.
〔2〕 Schirmbeck R, Bohm W, Ando K, et al. Nucleic acid vaccination primes hepatitisB virus surface antigen specific cytotoxic T lymphocytes in nonresponder mice〔J〕 . J Virol, 1995, 69： 5929- 5934.
, 百拇医药
〔3〕 李 文 波 ， 姚 志 强 ， 周 永 兴 ， 等 . HBV基 因 疫 苗 联 合 抗 原 蛋 白 免 疫 小 鼠 的 研 究 〔J〕 . 世 界 华 人 消 化 杂 志 . 1999； 7(3):188- 190.
〔4〕 Rakhmilevich AL, Turner J, Ford MJ, et al. Gene gun mediated skin transfection with interleukin 12 gene results in regression of established primary andmetastatic murine turmors〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA, 1996； 93 : 6291- 6295.
〔5〕 Robinson HL, Torres CAT. DNA vaccine〔J〕 . Seminars in Immunol, 1997； 9: 271- 284.
, 百拇医药
〔6〕 MacGregor RR, Boyer JD, Ugen KE, et al. First human trial of a DNA basedvaccine for treatment of human immunodeficiency virus type 1 infection: safety and host response〔J〕 . J infect Dis, 1998； 178(1): 92- 100.
〔7〕 Saito T, Sherman GJ, Kurohchi K, et al. Plasmid DNA based immunization for hepatitis C virus structural proteins: immune responses in mice〔J〕 . Gastroenterology, 1997； 112 :1321- 1330.
〔8〕 Okamoto I, Kohno K, tanimoto T, et al. Development of CD8+ effector T cell in differentially regulated by IL 18 and IL 12〔J〕 . J Immunol , 1999； 162: 3202- 3222.
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〔9〕 Davis HL, Brazolot Millan CL, Mancini M, et al. DNA based immunization against hepatitis B surface antigen(HBsAg) in normal and HBsAg transgentic mice〔J〕 . Vaccine,1997； 16(8):849- 852.
〔10〕 Chow YH, Chiang BL , LEE YL, et al. Development of Th1 and Th2 populations and the nature of Immune responses to hepatitis B virus vaccine can be modulated by codelivery of various cytokine genes〔J〕 . J immunol， 1998； 160:1320- 1322.
〔11〕 Germann T， Bongartz M， Dlugonska H， et al. Interleukin 12 profoundly up regulates the synthesis of antigen specific complement fixing IgG2a, IgG2b and IgG3 antibody subclasses in vivo〔J〕 . Eur J Immunol， 1995 ； 25(3): 823- 829.
收稿日期：1999-12-02
修回日期：1999-01-10, http://www.100md.com
单位：杜德伟(第四军医大学唐都医院感染病防治中心，陕西西安 710038)；周永兴(第四军医大学唐都医院感染病防治中心，陕西西安 710038)；冯志华(第四军医大学唐都医院感染病防治中心，陕西西安 710038)；姚志强(第四军医大学唐都医院感染病防治中心，陕西西安 710038)
关键词：基因疫苗；乙型肝炎表面抗原；小鼠；IL-12；真核表达载体
细胞与分子免疫学杂志000309
中图号:R：512.6 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)03-0211-02▲
病毒感染严重危害人类身体健康,清除病毒感染主要依靠细胞免疫或细胞因子的作用。细胞免疫是通过特异性CTL识别、杀伤破坏病毒感染的细胞，以清除感染细胞内的病毒。大量资料表明，慢性乙型肝炎及其病毒携带者的细胞免疫功能明显低下〔1〕。基因疫苗(核酸疫苗和DNA疫苗)是指含有编码某种蛋白抗原基因的真核表达质粒，直接接种体内后，可被体细胞摄取并表达相应抗原，进而激发保护性免疫应答，包括特异性CTL应答及特异性抗体的产生〔2〕。IL-12是目前发现的对体内免疫活性细胞诱导和调节作用最强、范围最广的细胞因子。我们将HBVDNA疫苗(pCR3.1-S)〔3〕与编码鼠IL-12的真核表达载体〔4〕pWRG3169(下简称IL-12)共同免疫小鼠后，观察其对小鼠免疫应答的影响。
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1 材料和方法
1.1材料雌性Balb/c小鼠,5～8wk龄,体重15～20g,购自本校实验动物中心。P815小鼠肥大细胞瘤细胞系由本室保存，含有HBVS抗原的真核表达质粒pCR3.1S，系姚志强教授在比利时鲁汶大学构建。编码鼠IL12p35，p40的真核表达载体pWRG3169由美国Rakhmilevich博士惠赠。脂质体为美国Gibco公司产品；G418，RPMI1640细胞培养基为美国Sigma公司产品；小牛血清为杭州四季青公司产品；抗HBsELISA检测试剂盒及异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG，购于华美西安公司。小鼠抗HBs、抗小鼠CD4+，CD8+单克隆抗体(mAb)，购于武汉博士德公司。
1.2方法
1.2.1质粒转染P815细胞及表达产物的检测用碱裂解法大量提取质粒，并经聚乙二醇(PEG)沉淀法纯化。采用脂质体转染技术将纯化后的pCR3.1S质粒转染P815细胞，用含G418(350mg/L)的细胞培养基筛选。当对照细胞大部分死亡后，换含G418(150mg/L)的细胞培养基培养约2wk，以间接免疫荧光法检测转染细胞内HBsAg的表达。表达HBsAg的细胞作为杀伤实验中的靶细胞。
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1.2.2质粒免疫及抗HBs的检测将15只小鼠随机分为3组，每组5只，以5g/L布比卡因和10g/L对羟基苯甲酸甲酯处理小鼠股四头肌，24h后，于同一部位注射质粒。第1组：注射100μgpCR3.1空载体，第2组：注射pCR3.1和pCR3.1S各50μg，第3组：注射pCR3.1S和IL12各50μg，每2wk1次，连续8wk。免疫后，剪尾采血100μL取上清，用间接ELISA检测试剂盒测定血清抗HBs，操作按照说明书进行。
1.2.3小鼠特异性CTL杀伤活性测定小鼠免疫8wk后，拉颈处死，无菌取其脾脏，研磨过滤制成单细胞悬液，用4h51Cr释放法测定CTL的杀伤效应，效应细胞∶靶细胞(E∶T)为100∶1。其计算公式：
2 结果
2.1IL-12基因真核表达载体对抗HBs产生的影响
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小鼠血清抗HBs的水平随免疫次数的增加而增加。IL12基因真核表达载体可提高基因疫苗诱导小鼠产生抗HBs，与单纯HBV基因疫苗诱导小鼠产生抗HBs相比较差异显著(P∨0.01,图1)。
2.2IL-12基因真核表达载体对特异性CTL杀伤活性的影响IL12基因真核表达载体可明显提高小鼠脾细胞HBsAg特异性CTL的杀伤活性。与对照组相比较具有显著性差异(P∨0.01，图2)。
图1IL12真核表达载体对HBV基因疫苗诱导小鼠抗
HBs的影响
图2IL12真核表达载体对HBV基因疫苗诱导CTL杀伤活性的影响
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3 讨论
基因疫苗在许多疾病的防治中显示出广泛的应用前景〔3〕。1998年，MacGregor〔5〕首次报道了基因疫苗治疗HIV-1感染者的人体实验结果。但不同的疫苗相差悬殊，有些疫苗甚至在大剂量长期使用时仍很难诱发有效的免疫应答〔6〕。
本实验以含有HBVS区的DNA疫苗与编码IL12的真核表达载体共同免疫小鼠，结果显示，IL12真核表达载体可明显提高基因疫苗诱导的免疫应答，联合免疫小鼠血清抗HBs抗体在任何时间点上，均较单纯HBV基因疫苗免疫组明显增高。体外杀伤实验证实，IL-12真核表达载体可明显提高DNA疫苗诱导的CTL的杀伤活性，与对照组相比较差异显著(P∨0.05)。用抗CD8+mAb处理效应细胞后，CTL的杀伤效应明显降低；而用抗CD4+mAb对CTL的杀伤效应无明显影响，表明CTL的杀伤作用由CD8+T淋巴细胞介导，与国外文献报道〔7〕一致。但也有报道〔8〕，在原始的MLC中加入IL-12，可使CD8+/CD4+T细胞的比率下降50%，并可抑制继发性IFN-γ的产生。IL-12是如何提高CTL的杀伤活性？尚待进一步阐明。
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HBV基因组中的S区是唯一能够刺激机体产生保护性抗体的区域。此外，HBsAg蛋白的28～39多肽还能诱导特异性的TCL反应〔2〕，表明以S区基因刺激机体可能产生针对同一病毒感染的细胞免疫及体液免疫应答。Davis〔9〕等用HBVDNA疫苗免疫HBsAg转基因小鼠，发现DNA疫苗可使对HBsAg无应答的转基因小鼠产生免疫应答。Chow〔10〕等发现，注射编码不同细胞因子的真核表达载体可提高和调节机体对疫苗的免疫应答。IL-12是一种重要的抗病毒细胞因子，其独特的、最重要的生物学活性是，调节Th1与Th2细胞之间的平衡及诱导内源性IFN-γ的产生。而IFNγ又可促进IL-12的产生,二者形成正反馈途径，共同调节T细胞亚群的分化，使CD4+Th0向Th1分化，刺激细胞分化增殖，从而促进细胞免疫应答。以上表明，DNA疫苗具有预防作用及治疗作用。另外，IL12能使小鼠产生的IgG2a，IgG2b及IgG3的产生增加10～100倍，此免疫球蛋白亚类与Th1活化有关〔11〕。IL-12真核表达载体主要起免疫佐剂的作用，这种作用依赖于两种质粒的共注射，若分别注射两种质粒对免疫应答无影响，说明该细胞因子只有与抗原注射于同一部位才能发挥其佐剂作用〔10〕。
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鉴于HBV感染目前尚无理想的治疗措施，因此，本研究关于细胞因子对DNA疫苗诱导的免疫应答具有促进作用的结果，为临床防治HBV感染提供了有效的实验依据。■
基金项目：国家自然科学基金资助,No.69770665
作者简介：杜德伟，男，32岁，主治医师，讲师，硕士生西安市新寺路1号， Tel.(029)3577595
参考文献 ：
〔1〕 Geissler M, Tokashige K, wakita T, et al. Differential cellular and humoral immunization using chimeric constructs〔J〕 . Vaccine， 1998; 16(8)： 857- 867.
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〔3〕 李 文 波 ， 姚 志 强 ， 周 永 兴 ， 等 . HBV基 因 疫 苗 联 合 抗 原 蛋 白 免 疫 小 鼠 的 研 究 〔J〕 . 世 界 华 人 消 化 杂 志 . 1999； 7(3):188- 190.
〔4〕 Rakhmilevich AL, Turner J, Ford MJ, et al. Gene gun mediated skin transfection with interleukin 12 gene results in regression of established primary andmetastatic murine turmors〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA, 1996； 93 : 6291- 6295.
〔5〕 Robinson HL, Torres CAT. DNA vaccine〔J〕 . Seminars in Immunol, 1997； 9: 271- 284.
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〔6〕 MacGregor RR, Boyer JD, Ugen KE, et al. First human trial of a DNA basedvaccine for treatment of human immunodeficiency virus type 1 infection: safety and host response〔J〕 . J infect Dis, 1998； 178(1): 92- 100.
〔7〕 Saito T, Sherman GJ, Kurohchi K, et al. Plasmid DNA based immunization for hepatitis C virus structural proteins: immune responses in mice〔J〕 . Gastroenterology, 1997； 112 :1321- 1330.
〔8〕 Okamoto I, Kohno K, tanimoto T, et al. Development of CD8+ effector T cell in differentially regulated by IL 18 and IL 12〔J〕 . J Immunol , 1999； 162: 3202- 3222.
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〔9〕 Davis HL, Brazolot Millan CL, Mancini M, et al. DNA based immunization against hepatitis B surface antigen(HBsAg) in normal and HBsAg transgentic mice〔J〕 . Vaccine,1997； 16(8):849- 852.
〔10〕 Chow YH, Chiang BL , LEE YL, et al. Development of Th1 and Th2 populations and the nature of Immune responses to hepatitis B virus vaccine can be modulated by codelivery of various cytokine genes〔J〕 . J immunol， 1998； 160:1320- 1322.
〔11〕 Germann T， Bongartz M， Dlugonska H， et al. Interleukin 12 profoundly up regulates the synthesis of antigen specific complement fixing IgG2a, IgG2b and IgG3 antibody subclasses in vivo〔J〕 . Eur J Immunol， 1995 ； 25(3): 823- 829.
收稿日期：1999-12-02
修回日期：1999-01-10, http://www.100md.com