人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建及筛选
作者：张建琼 张雪萍 谢维 林陵 单祥年 王琰
单位：张建琼(南京铁道医学院微生物学与免疫学教研室，江苏南京 210009)；张雪萍(南京铁道医学院微生物学与免疫学教研室，江苏南京 210009)；谢维(南京铁道医学院微生物学与免疫学教研室，江苏南京 210009)；林陵(南京铁道医学院微生物学与免疫学教研室，江苏南京 210009)；单祥年(南京铁道医学院微生物学与免疫学教研室，江苏南京 210009)；王琰(北京海军总医院)
关键词：噬菌体抗体库； HCV； 人源单克隆抗体
细胞与分子免疫学杂志000302
摘要：目的构建人丙型肝炎病毒(HCV)特异性噬菌体抗体库，制备人源抗HCV单克隆抗体(mAb)。方法用常规RTPCR法，直接从5例丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中，扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因，与噬菌体载体pComb3连接，构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行5轮吸附-洗脱-扩增的亲和选择后，以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。结果RTPCR可有效地扩增出Fd和κ基因，并以此构建成容量为1.2×107的噬菌体抗体库。经5轮亲和选择可使特异性噬菌体抗体得到高度富集，抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达96%。结论抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCVmAb的制备，为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具。
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中图号：Q782 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)03-0189-04
Construction and screening of human hepatitis C virus-specific phage antibody combinatorial library
ZHANG Jian-qiong ZHANG Xue-ping XIE Wei LIN Ling SHAN Xiang-nian
(Department of Microbiology ＆ Immunology, Nanjing Railway Medical College, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China)
WANG Yan
, 百拇医药
(Navy General Hospital Beijing, China)
Abstract: Aim Human monoclonal antibodies to hepatitis C virus NS4 mosaic antigen were generated from phage antibody combinatorial library. Methods Employing routine RT-PCR, the human Fd and κ light chains genes were amplified in human peripheral blood lymphocytes from patients infected with HCV by sets of oligonucleotide primers. Phage antibody library was constructed with the Fd and κ chain genes using pComb3 as vector. The affinity selection and ELISA were adopted for identification of specific phage antibodies to HCV. Results HCV-specific phage antibody library was constructed using Fd and κ genes and pComb3 vector. The library size was about 1.2× 107. The HCV-specific phage antibodies were highly enriched after five rounds of biopanning against HCV NS4 mosaic antigen and positive clones were detected upto 96% by ELISA. Conclusion HCV-specific antibody library and human monoclonal antibodies to HCV can be very useful as molecular tools for research diagnosis and therapy of HCV infection.
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Keywords: phage antibody library; HCV; human monoclonal antibody ▲
丙型肝炎病毒(HCV)是输血后肝炎和散发性非甲非乙型肝炎的主要病因，至少有50%的HCV感染者发展为慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。HCV是单链正股RNA病毒，基因组约为9.5kb。HCV基因组有高度的变异性，目前HCV已分为11个基因型和70余个亚型〔1〕。由于HCV基因序列的高度异质性，使HCV的血清学检测和疫苗的研制面临重重困难，在被动免疫中应用中和抗体可能性也受到阻碍〔2〕。Farci等〔4〕的实验表明，在HCV慢性感染者体内有特异性中和抗体。病毒的包膜蛋白是宿主免疫系统的攻击目标，抗HCVE2包膜蛋白超变区(HVR1)的特异性抗体，能封闭HCV吸附培养的人成纤维细胞〔3〕，并能与两株不同基因型的HCV发生交叉反应。因此，制备人源性抗HCV抗体，对于HCV的诊断、治疗、制备疫苗及发病机制的研究等均有一定的价值。噬菌体抗体库技术为人源mAb的制备提供了有效的手段〔5〕。我们用常规RT-PCR技术，从丙型肝炎患者外周血淋巴细胞中扩增抗体基因，构建人源性噬菌体抗体库，并从中筛选到多株抗HCVNS4多基因型嵌合抗原的噬菌体抗体。
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1 材料和方法
1.1材料噬菌粒pComb3购于美国Scripps研究所。辅助噬菌体VCSM13和HRP-羊抗M13抗体为Pharmacia公司产品。M-MLV，Trizolreagent为ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(JCellMolImmunol)2000;16(3)
Gibco公司产品。限制性内切酶和T4DNA连接酶均为Promega公司产品。其它有关化学试剂均为国产分析纯。HCVNS4多基因型嵌合蛋白，由美国CDC孟继鸿教授惠赠。SB，SOC和LB培养液按常规方法自配。
1.2方法
1.2.1人外周血淋巴细胞的分离从本院附属医院门诊随机取5例经第2代ELISA试剂检测血清抗HCVIG强阳性，PCR检测HCVRNA阳性的慢性丙型肝炎患者的外周血。每例采血10mL，用淋巴细胞分层液按常规方法制备人外周血淋巴细胞，并用冷PBS洗3次，混合后用倒置显微镜计数，分装(每管5×106细胞)。5例患者经HCV5′端非编码区型特异性引物PCR分型，4例为1b型，1例为3型。
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1.2.2总RNA提取和cDNA第1链的合成以Trizolreagent提取细胞总RNA，按说明书操作。取RNA2μL测A260nm和A280nm值鉴定其浓度和纯度。另取5μLRNA，用6g/L琼脂糖凝胶电泳检查总RNA的完整性。取10μgRNA溶液，加入Olig。(dT)4μL(0.4μg)，于70℃变性8min，冰浴5min。分别加入5×Buffer10μL，2.5mmol/LdNTP10μL，0.1mol/LDTT5μL，RNA酶抑制物40U和M-MLV400U，用DEPC处理水补足体积至50μL，37℃水浴1h，95℃5min，冰浴10min，于-20℃储存。
1.2.3引物设计及扩增Fd和κ基因PCR所用人抗体引物，根据Kang〔6〕的设计加适当改动和简并，由上海生工生物工程公司合成，PAGE纯化。IgG1CH3′端引物为：5′-GCATGTACTAGTTTTGTC-
ACAAGATTTGGG；VH5′端引物P1为：5′-SAGG-TGCAGCTCGAGSAGTCTGG(由VH1a与VH3a简并与)；P2为：5′-SAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG(由VHlf与VH3f简并)；P3为：5′-CAGGTGCAGC-TRCTCGAGTCGGG(由VH与VH4f简并)。
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Cκ3′端引物为：5′-GCGCCGTCTAGAACTAAC-ACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTACGGGCAAG；
Vκ5′端引物为：5′-GAMATYGAGCTCACSCAGTC-TCCA(由Vκ1a与Vκ3a简并)。其中M=A或C，S=C或G，Y=C或T。重链引物中分别含有内切酶XhoI和SpeI的识别序列(下画线部分)；轻链引物中分别含有内切酶SacI和XbaI的识别序列(下画线部分)。每管以5μLcDNA为PCR反应的模板，分别对Fd和κ基因进行扩增。
1.2.4大肠杆菌的电穿孔转化将2.5mL过夜培养的XL1-Blue菌液，接种在400mL含有四环素10mg/L的SB中，37℃培养至A600nm值为0.5。置冰浴中15min，于4℃离心弃上清，用100mL/L冷甘油水将细菌洗涤3次后，悬于4mL100mL/L甘油中即为感受态细胞。分装(每管0.2mL)，于液氮中冻5min后，取出，置-70℃冻存。按Bio-Rad基因脉冲仪说明书中所述方法进行电穿孔转化。
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1.2.5噬菌体抗体库的构建κPCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，以QIAGEN凝胶提取Kit纯化，SacI+XbaI双酶切，再以PCR产物纯化Kit纯化。然后用T4DNA连接酶使之与相应酶切纯化的噬菌粒pComb3连接，电穿孔转化XL1-Blue细胞，扩增转化后的细菌。扩增后提取质粒得到含轻链片段的pComb3。对其进行XhoI+SpeI双酶切，并与用相应酶切的重链FdPCR产物连接，电穿孔转化XL1-Blue。转化后的细菌加2mL预热的SOC，置37℃振荡培养1h后，转移至SOC固体平板(含氨苄青霉素100mg/L，四环素10mg/L)，于37℃培养24h。用SB洗下菌苔，取20μL菌液加入20mL含氨苄青霉素的SB中，37℃培养至A600nm约为0.5。加入约1011pfu的辅助噬菌体VCSM13，37℃培养1h，再加入终浓度为70mg/L的卡那霉素，振荡培养过夜。离心、收集上清，加入PEG6000到40g/L，NaCl到30g/L，置冰浴1h后，于4℃以12000r/min离心。弃上清，以3mLPBS溶解沉淀，再以12000r/min离心5min，弃去不溶物，收集上清即为噬菌体抗体库。
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1.2.6噬菌体抗体库的筛选将HCVNS4嵌合蛋白以每孔100ng包被ELISA板条，用30g/LBSA封闭、PBS洗后，加入噬菌体抗体库100μL(约1012cfu)，37℃温育2h。吸出噬菌体抗体液，以PBST洗1次(第2轮洗5次，第3，4，5轮各洗10次)，PBS洗1次，加入100μL洗脱液(0.1mol/LHCl，以甘氨酸调至pH2.2，并含1g/LBSA)于室温静置10min。将洗脱液稍加吹打后吸出，立即用6μL2mol/LTris中和，并加入2mLXL1-Blue，于37℃静置20min后，再加入20mLSB(含氨苄青霉素和四环素)，取10μL稀释铺盘测定cfu。其余细菌置37℃培养2h后，加入VCSM13和卡那霉素。噬菌体的沉淀和收集均按步骤1.2.5中的程序进行。反复进行“吸附→洗脱→扩增”5次淘洗，以使特异性噬菌体抗体高度富集。
1.2.7单克隆噬菌体抗体的制备及鉴定将经第5轮筛选、洗脱的噬菌体感染XL1-Blue后划平板，过夜培养。随机挑选细菌菌落，接种于4mL含氨苄青霉素和四环素的SB中，置37℃振荡培养过夜。取200μL加到4mL含同样量抗菌素的SB中，再37℃振荡培养2h，加入40μL的VCSM13培养2h后，加卡那霉素至70mg/L，置30℃振荡培养过夜。离心收集上清，即为单克隆噬菌体抗体，置4℃保存。将待检噬菌体抗体与等量10g/LBSA混合后，置室温孵育20min，加到已经HCVNS4嵌合蛋白包被和BSA封闭的ELISA板中，于37℃温育2h。用PBST洗4次、PBS洗2次后，加入HRP-羊抗M13抗体进行结合反应，以TMB显色。实验中采用VCSM13作为阴性对照。
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2 结果
2.1细胞总RNA的提取采用Trizolreagent提取RNA法，每5×106个淋巴细胞可得到6～10μgRNA(A260nm/A280nm=1.5～1.8)。总RNA经琼脂糖凝胶电泳分析，可见28sRNA，18sRNA及5sRNA3条带，其中28sRNA与18sRNA带之间有类似Smear现象，为不同分子量的mRNA(图1)。
图1人外周血淋巴细胞总RNA的分离
Fig1IsolationoftotalRNAfromhumanperipheralblood
lymphocytes
1:TotalRNA;2:TotalRNA.
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2.2Fd基因和κ轻链基因的扩增用Kang设计的3′端及简并后的P1,P2和P33条5′端重链引物，κ链3′端及简并的5′端引物配对后，对5例HC患者混合外周血淋巴细胞的cDNA进行扩增，均可见浓的特异性扩增带。与分子量标准相比较，其DNA片断的大小约为700bp，与推测的抗体重链Fd及κ轻链基因的大小相同〔6〕(图2)。
图2RT-PCR扩增人IgFd和κ轻链基因
Fig2AmplificationofhumanIgFdandκgenesbyRT-PCR
1:XФ174/HaeIIImarker;2:PCRproductofFdgene(5′terminalprimerP1);3:PCRproductofFdgene(5′terminalprimerP2);4:PCRproductofFdgene(5′terminalprimerP3);5:PCRproductofκgene.
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2.3噬菌体抗体库的构建和筛选分别将不同引物扩增的Fd和κ链基因的PCR产物纯化，经酶切、连接、转化，构建成噬菌体抗体库，测定库的容量为1.2×107。随机挑取10个菌落扩增，提取质粒DNA，用XbaI+XhoI双酶切检测，5个克隆切出约2.4kb的带(图3中的第2，4，7，10和11道)，即同时含有Fd段基因和κ链基因；4个克隆切出约1.7kb的片段(第1，3，5和9道)，即仅含有Fd或κ链基因，1个克隆为变异株(第8道)，说明Fab重组率为50%。以固相化的HCVNS4抗原对噬菌体抗体库进行5轮“吸附→洗脱→扩增”的淘筛，尽管淘洗强度逐轮加大，但洗脱下来的噬菌体滴度明显增加，说明携带有抗HCVNS4的特异性抗体的噬菌体得到了高度富集(表1)。
图3噬菌体抗体库的限制内切酶鉴定
Fig3Restrictionenzymeanalysisofphageantibodylibrary
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1，3，5and9:ContainFdorκclones;6：DNAmolecularmarker(kb);2,4,7,10and11:ContainFabclones.
Threearrowsinthefigureseparatelyindicade3.0,2.4and1.7kbfromtoptobottom.
2.4噬菌体抗体的鉴定从第5轮筛选后得到的菌落中，随机挑选30个克隆制备噬菌体抗体，用ELISA测定其抗原结合活性，有29个克隆对HCVNS4嵌合抗原呈阳性反应，而与BSA和HBsAg均不发生交叉反应。
表1亲和选择对噬菌体抗体的富集效应
Tab1Selectiveenrichmentofphageantibodiesfromlibraryby
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HCVNS4biopanning RoundsofClonescontaining
cfu added
cfueluted
panningFabgenes
1
1×1012
-
-
2
1×1012
1.0×106
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-
3
1×1012
3.0×105
8/10
4
1×1012
6.7×105
10/10
5
1×1012
3.0×106
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10/10
3 讨论
mAb已广泛应用于临床诊断和基础研究中，并取得了令人瞩目的成果。但鼠源性mAb易引起人体产生抗鼠抗体，制约了mAb在体内的应用。噬菌体抗体库技术，可在短期内制备人源mAb，使之体内应用展示了良好的前景。我们采用RT-PCR法，成功地扩增出丙型肝炎患者外周血淋巴细胞中的重链Fd基因和κ轻链基因。扩增产物的分子量与文献报道相一致。经自然免疫的人体(如患者或感染者)是目的抗体基因的良好来源。自然免疫的人体内目的抗体基因的mRNA丰度相对较高，有利于所建文库的筛选，并利于克隆出高亲和力的抗体。因此，我们选择抗HCVIgG阳性、国内流行的优势基因型HCV感染者作为采血对象，采血30～50mL即可满足建库所需。关于细胞总RNA的提取，多种方法均强调RNA的纯度，即A260nm/A280nm值应达1.8～2.0，使众多研究者花费了大量时间及经费，一味增加提取步骤，反复沉淀纯化。我们的研究表明，提取步骤应尽量简化，以减少污染RNA酶降解RNA的机会。对于RT-PCR，RNA的纯度固然重要，但RNA的完整性更为重要。因此，可用琼脂糖凝胶电泳检查总RNA的完整性。但是，由于DNA与RNA的电泳迁移速率互不相同(RNA比等长的DNA迁移得快)，故不能用DNA分子量标准参照物对RNA的分子进行测定。检查总RNA的完整性，只需看到RNA的3条带，即可证实提取成功，不需要测定其分子量。我们曾用两种方法，多次提取外周血淋巴细胞总RNA，A260nm/A280nm值=1.1～1.8不等，用不同比值的RNA进行RT-PCR，均可获得满意结果。采用多例携带不同基因型HCV感染患者的外周血淋巴细胞，进行混合分装，并使每个分装(5×106细胞)代表一定的人群范围，以便于每次基因扩增能获得较好的效果。经过优化转化条件，可使抗体库容量达1.2×107，Fab基因的重组率达50%。为了筛选抗HCV特异性噬菌体抗体，经严格的5轮亲和淘筛，可使特异性噬菌体抗体高度富集。在第5轮筛选后，挑选30个克隆用ELISA进行特异性检测，证明有29个克隆可与HCVNS4抗原特异性结合，阳性克隆率为96%。国内外报道，筛选抗体库均为3～4轮，我们在筛选过程中发现，洗涤次数应达10次，才能使阴性对照孔中的VCSM13完全洗去。因此，第1，2轮筛选分别洗涤1次和5次，洗脱出的噬菌体中含有较多的非特异性噬菌体和辅助噬菌体，产出率也较高，但不能代表特异性噬菌体富集。我们也尝试在第1轮筛选时，即洗涤10次，经3轮筛选后，未得到特异性噬菌体抗体，可能是第1轮的强洗涤将极少量的特异性克隆洗去所致，而改用5轮筛洗法后，才获得理想的结果。■
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基金项目：江苏省科技发展基金资助，No. BJ97070
作者简介：张建琼，女，38岁，博士。南京市丁家桥路87号，Tel. (025)3324421 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit@fmmu.edu.cn
参 考 文 献 :
〔1〕 Simmonds P, Holmes EC, Cha TA, et al. Classification of hepatitis C virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 region〔J〕 . J Gen Virol. 1993; 74:2391-2399.
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〔2〕 Choo QL, Kuo G, Ralston R, et al. Vaccination of chimpanzees against infection by the hepatitis C virus〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA,1994; 91:1294-1298.
〔3〕 Farci P, Alter HJ, Wong DC, et al. Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees after antibody-mediated in vitro neutralization〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA, 1994;91:7792-7796.
〔4〕 Zibert A, Schreier E, Roggendorf M. Antibodies in human sera specific to hypervariable region 1 of hepatitis C virus can block virol attachment〔J〕 . Virology, 1995; 208:653.
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〔5〕 McCfferty J, Griffiths AD, Winter G, et al. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains〔J〕 . Nature, 1990; 348:552-554.
〔6〕 Kang AS, Burton DR, Lerner RA, et al. Combinatorial immunoglobulin libraries in phage〔M〕 . Methods: Companion Methods Enzymol, 1991: 2(2):111-118. ISSN 1007-8738 细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志 (J Cell Mol Immunol)2000;16(3)
收稿日期：1999-08-05
修回日期：1999-10-08, 百拇医药
单位：张建琼(南京铁道医学院微生物学与免疫学教研室，江苏南京 210009)；张雪萍(南京铁道医学院微生物学与免疫学教研室，江苏南京 210009)；谢维(南京铁道医学院微生物学与免疫学教研室，江苏南京 210009)；林陵(南京铁道医学院微生物学与免疫学教研室，江苏南京 210009)；单祥年(南京铁道医学院微生物学与免疫学教研室，江苏南京 210009)；王琰(北京海军总医院)
关键词：噬菌体抗体库； HCV； 人源单克隆抗体
细胞与分子免疫学杂志000302
摘要：目的构建人丙型肝炎病毒(HCV)特异性噬菌体抗体库，制备人源抗HCV单克隆抗体(mAb)。方法用常规RTPCR法，直接从5例丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中，扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因，与噬菌体载体pComb3连接，构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行5轮吸附-洗脱-扩增的亲和选择后，以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。结果RTPCR可有效地扩增出Fd和κ基因，并以此构建成容量为1.2×107的噬菌体抗体库。经5轮亲和选择可使特异性噬菌体抗体得到高度富集，抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达96%。结论抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCVmAb的制备，为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具。
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中图号：Q782 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)03-0189-04
Construction and screening of human hepatitis C virus-specific phage antibody combinatorial library
ZHANG Jian-qiong ZHANG Xue-ping XIE Wei LIN Ling SHAN Xiang-nian
(Department of Microbiology ＆ Immunology, Nanjing Railway Medical College, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China)
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(Navy General Hospital Beijing, China)
Abstract: Aim Human monoclonal antibodies to hepatitis C virus NS4 mosaic antigen were generated from phage antibody combinatorial library. Methods Employing routine RT-PCR, the human Fd and κ light chains genes were amplified in human peripheral blood lymphocytes from patients infected with HCV by sets of oligonucleotide primers. Phage antibody library was constructed with the Fd and κ chain genes using pComb3 as vector. The affinity selection and ELISA were adopted for identification of specific phage antibodies to HCV. Results HCV-specific phage antibody library was constructed using Fd and κ genes and pComb3 vector. The library size was about 1.2× 107. The HCV-specific phage antibodies were highly enriched after five rounds of biopanning against HCV NS4 mosaic antigen and positive clones were detected upto 96% by ELISA. Conclusion HCV-specific antibody library and human monoclonal antibodies to HCV can be very useful as molecular tools for research diagnosis and therapy of HCV infection.
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Keywords: phage antibody library; HCV; human monoclonal antibody ▲
丙型肝炎病毒(HCV)是输血后肝炎和散发性非甲非乙型肝炎的主要病因，至少有50%的HCV感染者发展为慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。HCV是单链正股RNA病毒，基因组约为9.5kb。HCV基因组有高度的变异性，目前HCV已分为11个基因型和70余个亚型〔1〕。由于HCV基因序列的高度异质性，使HCV的血清学检测和疫苗的研制面临重重困难，在被动免疫中应用中和抗体可能性也受到阻碍〔2〕。Farci等〔4〕的实验表明，在HCV慢性感染者体内有特异性中和抗体。病毒的包膜蛋白是宿主免疫系统的攻击目标，抗HCVE2包膜蛋白超变区(HVR1)的特异性抗体，能封闭HCV吸附培养的人成纤维细胞〔3〕，并能与两株不同基因型的HCV发生交叉反应。因此，制备人源性抗HCV抗体，对于HCV的诊断、治疗、制备疫苗及发病机制的研究等均有一定的价值。噬菌体抗体库技术为人源mAb的制备提供了有效的手段〔5〕。我们用常规RT-PCR技术，从丙型肝炎患者外周血淋巴细胞中扩增抗体基因，构建人源性噬菌体抗体库，并从中筛选到多株抗HCVNS4多基因型嵌合抗原的噬菌体抗体。
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1 材料和方法
1.1材料噬菌粒pComb3购于美国Scripps研究所。辅助噬菌体VCSM13和HRP-羊抗M13抗体为Pharmacia公司产品。M-MLV，Trizolreagent为ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(JCellMolImmunol)2000;16(3)
Gibco公司产品。限制性内切酶和T4DNA连接酶均为Promega公司产品。其它有关化学试剂均为国产分析纯。HCVNS4多基因型嵌合蛋白，由美国CDC孟继鸿教授惠赠。SB，SOC和LB培养液按常规方法自配。
1.2方法
1.2.1人外周血淋巴细胞的分离从本院附属医院门诊随机取5例经第2代ELISA试剂检测血清抗HCVIG强阳性，PCR检测HCVRNA阳性的慢性丙型肝炎患者的外周血。每例采血10mL，用淋巴细胞分层液按常规方法制备人外周血淋巴细胞，并用冷PBS洗3次，混合后用倒置显微镜计数，分装(每管5×106细胞)。5例患者经HCV5′端非编码区型特异性引物PCR分型，4例为1b型，1例为3型。
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1.2.2总RNA提取和cDNA第1链的合成以Trizolreagent提取细胞总RNA，按说明书操作。取RNA2μL测A260nm和A280nm值鉴定其浓度和纯度。另取5μLRNA，用6g/L琼脂糖凝胶电泳检查总RNA的完整性。取10μgRNA溶液，加入Olig。(dT)4μL(0.4μg)，于70℃变性8min，冰浴5min。分别加入5×Buffer10μL，2.5mmol/LdNTP10μL，0.1mol/LDTT5μL，RNA酶抑制物40U和M-MLV400U，用DEPC处理水补足体积至50μL，37℃水浴1h，95℃5min，冰浴10min，于-20℃储存。
1.2.3引物设计及扩增Fd和κ基因PCR所用人抗体引物，根据Kang〔6〕的设计加适当改动和简并，由上海生工生物工程公司合成，PAGE纯化。IgG1CH3′端引物为：5′-GCATGTACTAGTTTTGTC-
ACAAGATTTGGG；VH5′端引物P1为：5′-SAGG-TGCAGCTCGAGSAGTCTGG(由VH1a与VH3a简并与)；P2为：5′-SAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG(由VHlf与VH3f简并)；P3为：5′-CAGGTGCAGC-TRCTCGAGTCGGG(由VH与VH4f简并)。
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Cκ3′端引物为：5′-GCGCCGTCTAGAACTAAC-ACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTACGGGCAAG；
Vκ5′端引物为：5′-GAMATYGAGCTCACSCAGTC-TCCA(由Vκ1a与Vκ3a简并)。其中M=A或C，S=C或G，Y=C或T。重链引物中分别含有内切酶XhoI和SpeI的识别序列(下画线部分)；轻链引物中分别含有内切酶SacI和XbaI的识别序列(下画线部分)。每管以5μLcDNA为PCR反应的模板，分别对Fd和κ基因进行扩增。
1.2.4大肠杆菌的电穿孔转化将2.5mL过夜培养的XL1-Blue菌液，接种在400mL含有四环素10mg/L的SB中，37℃培养至A600nm值为0.5。置冰浴中15min，于4℃离心弃上清，用100mL/L冷甘油水将细菌洗涤3次后，悬于4mL100mL/L甘油中即为感受态细胞。分装(每管0.2mL)，于液氮中冻5min后，取出，置-70℃冻存。按Bio-Rad基因脉冲仪说明书中所述方法进行电穿孔转化。
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1.2.5噬菌体抗体库的构建κPCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，以QIAGEN凝胶提取Kit纯化，SacI+XbaI双酶切，再以PCR产物纯化Kit纯化。然后用T4DNA连接酶使之与相应酶切纯化的噬菌粒pComb3连接，电穿孔转化XL1-Blue细胞，扩增转化后的细菌。扩增后提取质粒得到含轻链片段的pComb3。对其进行XhoI+SpeI双酶切，并与用相应酶切的重链FdPCR产物连接，电穿孔转化XL1-Blue。转化后的细菌加2mL预热的SOC，置37℃振荡培养1h后，转移至SOC固体平板(含氨苄青霉素100mg/L，四环素10mg/L)，于37℃培养24h。用SB洗下菌苔，取20μL菌液加入20mL含氨苄青霉素的SB中，37℃培养至A600nm约为0.5。加入约1011pfu的辅助噬菌体VCSM13，37℃培养1h，再加入终浓度为70mg/L的卡那霉素，振荡培养过夜。离心、收集上清，加入PEG6000到40g/L，NaCl到30g/L，置冰浴1h后，于4℃以12000r/min离心。弃上清，以3mLPBS溶解沉淀，再以12000r/min离心5min，弃去不溶物，收集上清即为噬菌体抗体库。
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1.2.6噬菌体抗体库的筛选将HCVNS4嵌合蛋白以每孔100ng包被ELISA板条，用30g/LBSA封闭、PBS洗后，加入噬菌体抗体库100μL(约1012cfu)，37℃温育2h。吸出噬菌体抗体液，以PBST洗1次(第2轮洗5次，第3，4，5轮各洗10次)，PBS洗1次，加入100μL洗脱液(0.1mol/LHCl，以甘氨酸调至pH2.2，并含1g/LBSA)于室温静置10min。将洗脱液稍加吹打后吸出，立即用6μL2mol/LTris中和，并加入2mLXL1-Blue，于37℃静置20min后，再加入20mLSB(含氨苄青霉素和四环素)，取10μL稀释铺盘测定cfu。其余细菌置37℃培养2h后，加入VCSM13和卡那霉素。噬菌体的沉淀和收集均按步骤1.2.5中的程序进行。反复进行“吸附→洗脱→扩增”5次淘洗，以使特异性噬菌体抗体高度富集。
1.2.7单克隆噬菌体抗体的制备及鉴定将经第5轮筛选、洗脱的噬菌体感染XL1-Blue后划平板，过夜培养。随机挑选细菌菌落，接种于4mL含氨苄青霉素和四环素的SB中，置37℃振荡培养过夜。取200μL加到4mL含同样量抗菌素的SB中，再37℃振荡培养2h，加入40μL的VCSM13培养2h后，加卡那霉素至70mg/L，置30℃振荡培养过夜。离心收集上清，即为单克隆噬菌体抗体，置4℃保存。将待检噬菌体抗体与等量10g/LBSA混合后，置室温孵育20min，加到已经HCVNS4嵌合蛋白包被和BSA封闭的ELISA板中，于37℃温育2h。用PBST洗4次、PBS洗2次后，加入HRP-羊抗M13抗体进行结合反应，以TMB显色。实验中采用VCSM13作为阴性对照。
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2 结果
2.1细胞总RNA的提取采用Trizolreagent提取RNA法，每5×106个淋巴细胞可得到6～10μgRNA(A260nm/A280nm=1.5～1.8)。总RNA经琼脂糖凝胶电泳分析，可见28sRNA，18sRNA及5sRNA3条带，其中28sRNA与18sRNA带之间有类似Smear现象，为不同分子量的mRNA(图1)。
图1人外周血淋巴细胞总RNA的分离
Fig1IsolationoftotalRNAfromhumanperipheralblood
lymphocytes
1:TotalRNA;2:TotalRNA.
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2.2Fd基因和κ轻链基因的扩增用Kang设计的3′端及简并后的P1,P2和P33条5′端重链引物，κ链3′端及简并的5′端引物配对后，对5例HC患者混合外周血淋巴细胞的cDNA进行扩增，均可见浓的特异性扩增带。与分子量标准相比较，其DNA片断的大小约为700bp，与推测的抗体重链Fd及κ轻链基因的大小相同〔6〕(图2)。
图2RT-PCR扩增人IgFd和κ轻链基因
Fig2AmplificationofhumanIgFdandκgenesbyRT-PCR
1:XФ174/HaeIIImarker;2:PCRproductofFdgene(5′terminalprimerP1);3:PCRproductofFdgene(5′terminalprimerP2);4:PCRproductofFdgene(5′terminalprimerP3);5:PCRproductofκgene.
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2.3噬菌体抗体库的构建和筛选分别将不同引物扩增的Fd和κ链基因的PCR产物纯化，经酶切、连接、转化，构建成噬菌体抗体库，测定库的容量为1.2×107。随机挑取10个菌落扩增，提取质粒DNA，用XbaI+XhoI双酶切检测，5个克隆切出约2.4kb的带(图3中的第2，4，7，10和11道)，即同时含有Fd段基因和κ链基因；4个克隆切出约1.7kb的片段(第1，3，5和9道)，即仅含有Fd或κ链基因，1个克隆为变异株(第8道)，说明Fab重组率为50%。以固相化的HCVNS4抗原对噬菌体抗体库进行5轮“吸附→洗脱→扩增”的淘筛，尽管淘洗强度逐轮加大，但洗脱下来的噬菌体滴度明显增加，说明携带有抗HCVNS4的特异性抗体的噬菌体得到了高度富集(表1)。
图3噬菌体抗体库的限制内切酶鉴定
Fig3Restrictionenzymeanalysisofphageantibodylibrary
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1，3，5and9:ContainFdorκclones;6：DNAmolecularmarker(kb);2,4,7,10and11:ContainFabclones.
Threearrowsinthefigureseparatelyindicade3.0,2.4and1.7kbfromtoptobottom.
2.4噬菌体抗体的鉴定从第5轮筛选后得到的菌落中，随机挑选30个克隆制备噬菌体抗体，用ELISA测定其抗原结合活性，有29个克隆对HCVNS4嵌合抗原呈阳性反应，而与BSA和HBsAg均不发生交叉反应。
表1亲和选择对噬菌体抗体的富集效应
Tab1Selectiveenrichmentofphageantibodiesfromlibraryby
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HCVNS4biopanning RoundsofClonescontaining
cfu added
cfueluted
panningFabgenes
1
1×1012
-
-
2
1×1012
1.0×106
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-
3
1×1012
3.0×105
8/10
4
1×1012
6.7×105
10/10
5
1×1012
3.0×106
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3 讨论
mAb已广泛应用于临床诊断和基础研究中，并取得了令人瞩目的成果。但鼠源性mAb易引起人体产生抗鼠抗体，制约了mAb在体内的应用。噬菌体抗体库技术，可在短期内制备人源mAb，使之体内应用展示了良好的前景。我们采用RT-PCR法，成功地扩增出丙型肝炎患者外周血淋巴细胞中的重链Fd基因和κ轻链基因。扩增产物的分子量与文献报道相一致。经自然免疫的人体(如患者或感染者)是目的抗体基因的良好来源。自然免疫的人体内目的抗体基因的mRNA丰度相对较高，有利于所建文库的筛选，并利于克隆出高亲和力的抗体。因此，我们选择抗HCVIgG阳性、国内流行的优势基因型HCV感染者作为采血对象，采血30～50mL即可满足建库所需。关于细胞总RNA的提取，多种方法均强调RNA的纯度，即A260nm/A280nm值应达1.8～2.0，使众多研究者花费了大量时间及经费，一味增加提取步骤，反复沉淀纯化。我们的研究表明，提取步骤应尽量简化，以减少污染RNA酶降解RNA的机会。对于RT-PCR，RNA的纯度固然重要，但RNA的完整性更为重要。因此，可用琼脂糖凝胶电泳检查总RNA的完整性。但是，由于DNA与RNA的电泳迁移速率互不相同(RNA比等长的DNA迁移得快)，故不能用DNA分子量标准参照物对RNA的分子进行测定。检查总RNA的完整性，只需看到RNA的3条带，即可证实提取成功，不需要测定其分子量。我们曾用两种方法，多次提取外周血淋巴细胞总RNA，A260nm/A280nm值=1.1～1.8不等，用不同比值的RNA进行RT-PCR，均可获得满意结果。采用多例携带不同基因型HCV感染患者的外周血淋巴细胞，进行混合分装，并使每个分装(5×106细胞)代表一定的人群范围，以便于每次基因扩增能获得较好的效果。经过优化转化条件，可使抗体库容量达1.2×107，Fab基因的重组率达50%。为了筛选抗HCV特异性噬菌体抗体，经严格的5轮亲和淘筛，可使特异性噬菌体抗体高度富集。在第5轮筛选后，挑选30个克隆用ELISA进行特异性检测，证明有29个克隆可与HCVNS4抗原特异性结合，阳性克隆率为96%。国内外报道，筛选抗体库均为3～4轮，我们在筛选过程中发现，洗涤次数应达10次，才能使阴性对照孔中的VCSM13完全洗去。因此，第1，2轮筛选分别洗涤1次和5次，洗脱出的噬菌体中含有较多的非特异性噬菌体和辅助噬菌体，产出率也较高，但不能代表特异性噬菌体富集。我们也尝试在第1轮筛选时，即洗涤10次，经3轮筛选后，未得到特异性噬菌体抗体，可能是第1轮的强洗涤将极少量的特异性克隆洗去所致，而改用5轮筛洗法后，才获得理想的结果。■
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基金项目：江苏省科技发展基金资助，No. BJ97070
作者简介：张建琼，女，38岁，博士。南京市丁家桥路87号，Tel. (025)3324421 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit@fmmu.edu.cn
参 考 文 献 :
〔1〕 Simmonds P, Holmes EC, Cha TA, et al. Classification of hepatitis C virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 region〔J〕 . J Gen Virol. 1993; 74:2391-2399.
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〔2〕 Choo QL, Kuo G, Ralston R, et al. Vaccination of chimpanzees against infection by the hepatitis C virus〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA,1994; 91:1294-1298.
〔3〕 Farci P, Alter HJ, Wong DC, et al. Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees after antibody-mediated in vitro neutralization〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA, 1994;91:7792-7796.
〔4〕 Zibert A, Schreier E, Roggendorf M. Antibodies in human sera specific to hypervariable region 1 of hepatitis C virus can block virol attachment〔J〕 . Virology, 1995; 208:653.
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〔5〕 McCfferty J, Griffiths AD, Winter G, et al. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains〔J〕 . Nature, 1990; 348:552-554.
〔6〕 Kang AS, Burton DR, Lerner RA, et al. Combinatorial immunoglobulin libraries in phage〔M〕 . Methods: Companion Methods Enzymol, 1991: 2(2):111-118. ISSN 1007-8738 细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志 (J Cell Mol Immunol)2000;16(3)
收稿日期：1999-08-05
修回日期：1999-10-08, 百拇医药