抗HCVNS3抗原单克隆抗体的研制与初步鉴定
作者：郭满盈 李谋深 李越希 李保仝 杨毓华
单位：郭满盈(解放军第89医院检验科,浙江湖州313000)；李谋深(解放军第89医院检验科,浙江湖州313000)；李越希(南京军区军事医学研究所)；李保仝(南京军区南京总医院全军医学检验中心,南京210002)；杨毓华(南京军区南京总医院全军医学检验中心,南京210002)
关键词：丙型肝炎；NS3；单克隆抗
细胞与分子免疫学杂志000330
中图号：R392.11 文献标识码：B 文章编号：1007-8738(2000)03-0273-02▲
丙型肝炎病毒(HCV)是一种单链正链RNA病毒，可通过输血等方式传播,引起急、慢性肝炎。目前,HCV的常规诊断方法主要有抗HCVIgG，抗HCVIgM及HCVRNA的RTPCR检测。对HCV抗原的检测文献报道较少。我们利用基因工程表达的HCVNS3蛋白作为免疫原,研制其单克隆抗体(mAb),试图用于HCV抗原诊断的研究。
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1 材料和方法
1.1材料Balb/c小鼠,由南京军区实验动物中心提供。Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞,从解放军302医院引进,液氮保存。HCVNS3蛋白及CP9，CP10抗原，由南京军区军事医学研究所惠赠。NS4，NS5和C33肽由第二军医大学微生物学教研室惠赠。小鼠Ig亚类测定试剂盒为Sigma的公司产品。
1.2方法
1.2.1抗HCVNS3蛋白mAb的制备免疫小鼠按文献〔1〕的方法，将HCVNS3蛋白通过N羟基琥珀酰亚胺基3(2吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)与小鼠血清白蛋白(MSA)交联，以常规方法免疫Balb/c小鼠。末次免疫3d后，取小鼠脾细胞供融合用。细胞融合、筛选、克隆化及腹水制备，均按实验室常规方法进行。
1.2.2mAb的特性鉴定(1)交叉反应试验:取腹水型mAb分别与HCV的NS3，NS4，NS5，C33肽，CP9和CP10进行间接ELISA。(2)阻断试验:采用竞争ELISA法。用抗HCV检测试剂盒中的抗原包被板条(包被抗原包括：NS3,NS4和核心蛋白等),在反应孔中加入抗NS3蛋白mAb，41℃作用40min后，依次加入抗HCVIgG阳性血清和HRP抗人IgG(加入试剂后的孵育温度和时间同前)。显色后，于450nm处测定光吸收(A)值。抑制率计算公式为:
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(3)Ig亚类测定:按文献〔2〕方法进行。(4)稳定性测定:①pH稳定性:分别用pH2.2的0.05mol/L甘氨酸HCL缓冲液，pH9.6的0.05mol/L碳酸缓冲液和pH7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，将mAb腹水稀释1000倍,于4℃放置0，12和24h后,再分别与HCVNS3进行间接ELISA,测定mAb在不同时间、不同pH条件下的稳定性。②热稳定性:用pH7.2，0.01mol/LPBS将mAb腹水稀释1000倍,放置56℃,同法测定其对热稳的定性。试验中用同一样品放置4℃作为对照。
2 结果
2.1抗NS3蛋白mAb杂交瘤细胞株的建立3次融合共获得6株分泌抗NS3蛋白mAb的杂交瘤细胞。其中2B8和6D6两株mAb(均为IgG2a)的腹水效价较高(分别为10-6和10-5)。
2.2抗NS3蛋白mAb的特异性(1)交叉反应试验:取腹水型mAb分别与HCV的NS3，NS4，NS5，C33肽，CP9和CP10进行间接ELISA。结果表明，抗NS3mAb2B8和6D6仅与HCV的NS3起反应(A450值分别为0.92和0.84)；与NS4，NS5，C33肽，CP9和CP10均不起反应(A450值均∧0.17)。(2)阻断试验：用竞争ELISA做阻断试验，检测抗NS3mAb的竞争抑制活性。结果表明，两株mAb2B8和6D6对抗HCVIgG滴度较低的阳性血清有较好的抑制作用。其中mAb2B8的抑制率较高，对1，3，4号血清标本的抑制率均∧50%，最高达59%(3号标本)；mAb6D6对1，3，4号标本的抑制率依次为：40.0%，49.3%和46.4%，均不超过50%；两株mAb对抗HCVIgG滴度较高的阳性血清标本(2,5,6,7,8号)的抑制率较低，均不超过40%。
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2.3mAb的稳定性分别用不同pH的缓冲液处理mAb，检测不同pH条件下、不同处理时间mAb的稳定性及对热的稳定性。结果表明，mAb对热的稳定性良好，于56℃放置24h，mAb2B8和6D6的A450值与阴性对照A450值的比值(分别为19.30和15.92)同在4℃放置24h二者的比值(分别为18.42和16.33)无明显差别(P∧0.05)。但以pH2.2和pH9.6条件处理48h后，mAb2B8和6D6的A450值与阴性对照的A450值之比值：前者为6.26(pH2.2)和5.35(pH9.6)；后者为2.24(pH2.2)和9.02(pH9.6)，均明显小于pH7.2时的值(前者为18.24，后者为16.12)，表明pH对mAb的稳定性影响较大。
3 讨论
我们在1996年制备了抗HCV核心C33肽的mAb，并进行了初步鉴定，现已用于肝炎抗原的检测〔3〕。NS3区在HCV复制周期中起着重要的作用，在感染早期就出现了抗NS3区的抗体，通常早于或与核心抗体同时出现〔4〕。制备的抗NS3蛋白mAb可用于建立检测NS3抗原的方法，作为对HCV检测方法的补充，对提高检出阳性率及了解HCV在体内的活动，特别是感染早期的情况有所帮助。
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从交叉反应试验结果可看出，两株mAb2B8和6D6同NS3蛋白均有较强的反应性，表明它们是针对NS3蛋白的。竞争ELISA试验结果表明，两株mAb对抗HCVIgG滴度较低的阳性血清有较好的抑制作用(最高达59.1%)；而对抗HCVIgG滴度高的阳性标本抑制率较低，有的甚至无抑制作用，这可能与试剂盒中的包被抗原除非结构区外，还有结构区抗原。另外，还可能与强阳性标本中的抗HCVIgG不仅滴度高，而且反应能力强有关。目前，我们正将2株mAb适当组合，建立双抗体夹心ELISA法，进行循环中HCV抗原检测的研究。■
作者简介：郭满盈，男，28岁，技师浙江省湖州市车站路9号，Tel.(0572)20235712071
参考文献：
〔1〕 武 建 国 ， 王 毓 三 .检 验 医 师 必 读 〔M〕 .南 京 :南 京 师 范 大 学 出 版 社 ， 1995:310～ 311.
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〔2〕 杨 毓 华 ， 李 保 仝 ， 何 孔 旺 ， 等 .A组 轮 状 病 毒 单 克 隆 抗 体 特 性 鉴 定 及 临 床 初 步 应 用 〔J〕 .单 克 隆 抗 体 通 讯 ， 1990;6(4):19.
〔3〕 李 保 仝 ， 杨 毓 华 ， 马 勇 等 .抗 HCV核 心 抗 原 C33肽 单 克 隆 抗 体 的 研 制 与 初 步 鉴 定 〔J〕 .细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志 ， 1996;12(1):35～ 38.
〔4〕 Mario UM， Antonella C， Piet B， et al. Significace of the immune response to a major， conformation B cell epitope on the hepatitis C virus NS3 region defined by a human monoclonal antibody〔J〕 . J Virol. 1994;68(8):4829～ 4836.
收稿日期：1999-08-30
修回日期：1999-10-30, http://www.100md.com
单位：郭满盈(解放军第89医院检验科,浙江湖州313000)；李谋深(解放军第89医院检验科,浙江湖州313000)；李越希(南京军区军事医学研究所)；李保仝(南京军区南京总医院全军医学检验中心,南京210002)；杨毓华(南京军区南京总医院全军医学检验中心,南京210002)
关键词：丙型肝炎；NS3；单克隆抗
细胞与分子免疫学杂志000330
中图号：R392.11 文献标识码：B 文章编号：1007-8738(2000)03-0273-02▲
丙型肝炎病毒(HCV)是一种单链正链RNA病毒，可通过输血等方式传播,引起急、慢性肝炎。目前,HCV的常规诊断方法主要有抗HCVIgG，抗HCVIgM及HCVRNA的RTPCR检测。对HCV抗原的检测文献报道较少。我们利用基因工程表达的HCVNS3蛋白作为免疫原,研制其单克隆抗体(mAb),试图用于HCV抗原诊断的研究。
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1 材料和方法
1.1材料Balb/c小鼠,由南京军区实验动物中心提供。Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞,从解放军302医院引进,液氮保存。HCVNS3蛋白及CP9，CP10抗原，由南京军区军事医学研究所惠赠。NS4，NS5和C33肽由第二军医大学微生物学教研室惠赠。小鼠Ig亚类测定试剂盒为Sigma的公司产品。
1.2方法
1.2.1抗HCVNS3蛋白mAb的制备免疫小鼠按文献〔1〕的方法，将HCVNS3蛋白通过N羟基琥珀酰亚胺基3(2吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)与小鼠血清白蛋白(MSA)交联，以常规方法免疫Balb/c小鼠。末次免疫3d后，取小鼠脾细胞供融合用。细胞融合、筛选、克隆化及腹水制备，均按实验室常规方法进行。
1.2.2mAb的特性鉴定(1)交叉反应试验:取腹水型mAb分别与HCV的NS3，NS4，NS5，C33肽，CP9和CP10进行间接ELISA。(2)阻断试验:采用竞争ELISA法。用抗HCV检测试剂盒中的抗原包被板条(包被抗原包括：NS3,NS4和核心蛋白等),在反应孔中加入抗NS3蛋白mAb，41℃作用40min后，依次加入抗HCVIgG阳性血清和HRP抗人IgG(加入试剂后的孵育温度和时间同前)。显色后，于450nm处测定光吸收(A)值。抑制率计算公式为:
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(3)Ig亚类测定:按文献〔2〕方法进行。(4)稳定性测定:①pH稳定性:分别用pH2.2的0.05mol/L甘氨酸HCL缓冲液，pH9.6的0.05mol/L碳酸缓冲液和pH7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，将mAb腹水稀释1000倍,于4℃放置0，12和24h后,再分别与HCVNS3进行间接ELISA,测定mAb在不同时间、不同pH条件下的稳定性。②热稳定性:用pH7.2，0.01mol/LPBS将mAb腹水稀释1000倍,放置56℃,同法测定其对热稳的定性。试验中用同一样品放置4℃作为对照。
2 结果
2.1抗NS3蛋白mAb杂交瘤细胞株的建立3次融合共获得6株分泌抗NS3蛋白mAb的杂交瘤细胞。其中2B8和6D6两株mAb(均为IgG2a)的腹水效价较高(分别为10-6和10-5)。
2.2抗NS3蛋白mAb的特异性(1)交叉反应试验:取腹水型mAb分别与HCV的NS3，NS4，NS5，C33肽，CP9和CP10进行间接ELISA。结果表明，抗NS3mAb2B8和6D6仅与HCV的NS3起反应(A450值分别为0.92和0.84)；与NS4，NS5，C33肽，CP9和CP10均不起反应(A450值均∧0.17)。(2)阻断试验：用竞争ELISA做阻断试验，检测抗NS3mAb的竞争抑制活性。结果表明，两株mAb2B8和6D6对抗HCVIgG滴度较低的阳性血清有较好的抑制作用。其中mAb2B8的抑制率较高，对1，3，4号血清标本的抑制率均∧50%，最高达59%(3号标本)；mAb6D6对1，3，4号标本的抑制率依次为：40.0%，49.3%和46.4%，均不超过50%；两株mAb对抗HCVIgG滴度较高的阳性血清标本(2,5,6,7,8号)的抑制率较低，均不超过40%。
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2.3mAb的稳定性分别用不同pH的缓冲液处理mAb，检测不同pH条件下、不同处理时间mAb的稳定性及对热的稳定性。结果表明，mAb对热的稳定性良好，于56℃放置24h，mAb2B8和6D6的A450值与阴性对照A450值的比值(分别为19.30和15.92)同在4℃放置24h二者的比值(分别为18.42和16.33)无明显差别(P∧0.05)。但以pH2.2和pH9.6条件处理48h后，mAb2B8和6D6的A450值与阴性对照的A450值之比值：前者为6.26(pH2.2)和5.35(pH9.6)；后者为2.24(pH2.2)和9.02(pH9.6)，均明显小于pH7.2时的值(前者为18.24，后者为16.12)，表明pH对mAb的稳定性影响较大。
3 讨论
我们在1996年制备了抗HCV核心C33肽的mAb，并进行了初步鉴定，现已用于肝炎抗原的检测〔3〕。NS3区在HCV复制周期中起着重要的作用，在感染早期就出现了抗NS3区的抗体，通常早于或与核心抗体同时出现〔4〕。制备的抗NS3蛋白mAb可用于建立检测NS3抗原的方法，作为对HCV检测方法的补充，对提高检出阳性率及了解HCV在体内的活动，特别是感染早期的情况有所帮助。
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从交叉反应试验结果可看出，两株mAb2B8和6D6同NS3蛋白均有较强的反应性，表明它们是针对NS3蛋白的。竞争ELISA试验结果表明，两株mAb对抗HCVIgG滴度较低的阳性血清有较好的抑制作用(最高达59.1%)；而对抗HCVIgG滴度高的阳性标本抑制率较低，有的甚至无抑制作用，这可能与试剂盒中的包被抗原除非结构区外，还有结构区抗原。另外，还可能与强阳性标本中的抗HCVIgG不仅滴度高，而且反应能力强有关。目前，我们正将2株mAb适当组合，建立双抗体夹心ELISA法，进行循环中HCV抗原检测的研究。■
作者简介：郭满盈，男，28岁，技师浙江省湖州市车站路9号，Tel.(0572)20235712071
参考文献：
〔1〕 武 建 国 ， 王 毓 三 .检 验 医 师 必 读 〔M〕 .南 京 :南 京 师 范 大 学 出 版 社 ， 1995:310～ 311.
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〔2〕 杨 毓 华 ， 李 保 仝 ， 何 孔 旺 ， 等 .A组 轮 状 病 毒 单 克 隆 抗 体 特 性 鉴 定 及 临 床 初 步 应 用 〔J〕 .单 克 隆 抗 体 通 讯 ， 1990;6(4):19.
〔3〕 李 保 仝 ， 杨 毓 华 ， 马 勇 等 .抗 HCV核 心 抗 原 C33肽 单 克 隆 抗 体 的 研 制 与 初 步 鉴 定 〔J〕 .细 胞 与 分 子 免 疫 学 杂 志 ， 1996;12(1):35～ 38.
〔4〕 Mario UM， Antonella C， Piet B， et al. Significace of the immune response to a major， conformation B cell epitope on the hepatitis C virus NS3 region defined by a human monoclonal antibody〔J〕 . J Virol. 1994;68(8):4829～ 4836.
收稿日期：1999-08-30
修回日期：1999-10-30, http://www.100md.com