免疫印迹技术检测天疱疮患者血清结合的天疱疮抗原
作者：顾富祥 曾珍 孙火宝
单位：210008 南京鼓楼医院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志980127 随着分子生物学技术的发展，应用免疫沉淀技术已测出表皮角朊细胞膜上寻常性天疱疮(PV)抗原和落叶性天疱疮(PF)抗原的结构[1，2]，应用免疫印迹(Western blotting)则已进一步测出PV抗原的分子量为130 000，PF抗原为160 000[3～5]。近年来国外学者已成功地应用免疫印迹对天疱疮进行诊断和鉴别诊断[5]。我们应用免疫印迹，以正常表皮提取物为抗原，检查18例天疱疮患者血清。
一、材料和方法
(一)血清：18例患者的血清，均来自1994～1996年在我科就诊的天疱疮患者，其中4例PV、4例疱疹样天疱疮(PH)、1例PF和9例红斑性天疱疮(PE)。所有患者皮损周围皮肤DIF都显示IgG表皮细胞间呈鱼网状沉积，血清IIF检测天疱疮抗体滴度在1∶40～1∶320。对照血清包括8例正常人、2例大疱性类天疱疮、2例获得性大疱性表皮松解症(EBA)、1例疱疹样皮炎和1例大疱性SLE。以上血清均分装贮存于-40℃备用。
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(二)仪器：上海兴华电子仪器厂产XHF-1型高速匀浆器、日本Hitachi公司产707-72型冷冻高速离心机。电泳仪和电泳转移仪均为上海医用分析仪器厂生产的DY型产品。V16垂直电泳槽为上海精益有机玻璃厂生产，电泳转移槽为上海长江有机制品仪器厂出品。
(三)方法：
1.表皮提取物按Hashimoto方法制备[4]。
2.免疫蛋白印迹：SDS-PAGE分离胶浓度为6%，堆集胶浓度为5%。加样后，先于10mA电流下电泳，进入分离胶后，将电流升至30～40mA，一旦溴酚蓝到达分离胶最底端时，即停止电泳。将凝胶移置于硝酸纤维素(NC)薄膜上，在4℃、200mA电泳下将凝胶中的蛋白质转移至NC膜。清洗后按加入的样品剪成条，分别浸入按1∶40稀释的天疱疮血清或对照血清中，4℃孵育过夜，清洗后浸入以1∶100稀释的HRP-兔抗人IgG中孵育(Dako产品)，以新鲜配制的DAB溶液显色，并与标准蛋白对照，计算阳性条带分子量大小。部分血清重复2次。
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二、结果
18例天疱疮患者的临床表现、组织病理和DIF所见均符合天疱疮的诊断标准，这些患者血清与表皮提取物进行免疫印迹的结果如图1和图2所示。18例患者血清中特异性抗体与表皮提取物中蛋白抗原分子结合成条带者12例，阳性率为66.7%。所有4例PV血清都与表皮提取物中130 000分子反应，显示单一的结合带。1例PF和9例PE血清，只有4例与表皮提取物160 000分子显示单一的结合带，其余6例PE血清均未显示任何特异性蛋白结合带。4例PH血清，其中2例与表皮提取物中130 000分子显示单一的结合带；另2例则与表皮提取物中160 000反应，显示特异性的结合带。14例对照血清无1例显示特异性的蛋白结合带。
图1 表皮提取物的免疫印迹结果：3例PV血清(条1～3)和2例PH 血清(条4、5)
, 百拇医药 在分子量130 000呈结合带，1例PF血清(条6)在分子量160 000处呈结合带，对
照血清(条7)无结合带
图2 表皮提取物的免疫印迹结果：3例PE(条血清1～3)和1例PH血清(条4)在
160 000处呈结合，1例PV血清(条5)在130 000处呈结合带
三、讨论
我们的结果显示：4例PV和4例PH中2例血清与表皮提取物中的130 000蛋白反应，10例PF和PE患者中有4例和4例PH中2例血清与表皮提取物中160 000蛋白反应。这与国外学者报道的结果相似[3～5]。这些结果再次表明：免疫印迹技术能准确地测定天疱疮患者血清中自身抗体所对应的自身抗原的分子量，从而准确地诊断天疱疮，并可进一步加以分型。4例PH患者血清，其中2例血清与表皮提取物中130 000的分子呈特异性结合带，另2例血清则与160 000反应。因为PH可以是一个不稳定的临床异型，它既可以转变为PV，也可以转化为PF，这说明免疫印迹对典型的天疱疮能够诊断，对不典型的天疱疮亦能诊断。
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参 考 文 献
1 Korman N, Eyre RW, Klaus-Kovtun V, et al. Demonstration of an adhering-junctionmolecule (plakoglobin) in the autoantigens of pemphigus foliaceus and pemphigus vulgaris.N Engl J Med, 1989,32∶631-635.
2 Karpati S, Amagai M, Prussick R, et al. Pemphigus vulgaris antigen is a desmosomal desmoglein. Dermatology, 1994,189(Suppl 1)∶24-26.
3 Ogawa MM, Hashimoto T, Konohand A, et al. Immunoblot analyses of Brazilian pemphigus foliaceus antigen using different antigen sources. Arch Dermatol Res,1990,282∶84-88.
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4 Hashimoto T, Ogawa MM, Konohand A, et al. Detection of pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus antigens by immunoblot analysis using different antigen sources. J Invest Dermatol, 1990,94∶327-331.
5 Hashimoto T, Konohana A, Nishikawa T. Immunoblot assay as an aid to the diagnosis of unclassified cases of pemphigus. Arch Dermatol, 1991,127∶843-847.
(收稿：1997-01-16 修回：1997-05-03), 百拇医药
单位：210008 南京鼓楼医院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志980127 随着分子生物学技术的发展，应用免疫沉淀技术已测出表皮角朊细胞膜上寻常性天疱疮(PV)抗原和落叶性天疱疮(PF)抗原的结构[1，2]，应用免疫印迹(Western blotting)则已进一步测出PV抗原的分子量为130 000，PF抗原为160 000[3～5]。近年来国外学者已成功地应用免疫印迹对天疱疮进行诊断和鉴别诊断[5]。我们应用免疫印迹，以正常表皮提取物为抗原，检查18例天疱疮患者血清。
一、材料和方法
(一)血清：18例患者的血清，均来自1994～1996年在我科就诊的天疱疮患者，其中4例PV、4例疱疹样天疱疮(PH)、1例PF和9例红斑性天疱疮(PE)。所有患者皮损周围皮肤DIF都显示IgG表皮细胞间呈鱼网状沉积，血清IIF检测天疱疮抗体滴度在1∶40～1∶320。对照血清包括8例正常人、2例大疱性类天疱疮、2例获得性大疱性表皮松解症(EBA)、1例疱疹样皮炎和1例大疱性SLE。以上血清均分装贮存于-40℃备用。
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(二)仪器：上海兴华电子仪器厂产XHF-1型高速匀浆器、日本Hitachi公司产707-72型冷冻高速离心机。电泳仪和电泳转移仪均为上海医用分析仪器厂生产的DY型产品。V16垂直电泳槽为上海精益有机玻璃厂生产，电泳转移槽为上海长江有机制品仪器厂出品。
(三)方法：
1.表皮提取物按Hashimoto方法制备[4]。
2.免疫蛋白印迹：SDS-PAGE分离胶浓度为6%，堆集胶浓度为5%。加样后，先于10mA电流下电泳，进入分离胶后，将电流升至30～40mA，一旦溴酚蓝到达分离胶最底端时，即停止电泳。将凝胶移置于硝酸纤维素(NC)薄膜上，在4℃、200mA电泳下将凝胶中的蛋白质转移至NC膜。清洗后按加入的样品剪成条，分别浸入按1∶40稀释的天疱疮血清或对照血清中，4℃孵育过夜，清洗后浸入以1∶100稀释的HRP-兔抗人IgG中孵育(Dako产品)，以新鲜配制的DAB溶液显色，并与标准蛋白对照，计算阳性条带分子量大小。部分血清重复2次。
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二、结果
18例天疱疮患者的临床表现、组织病理和DIF所见均符合天疱疮的诊断标准，这些患者血清与表皮提取物进行免疫印迹的结果如图1和图2所示。18例患者血清中特异性抗体与表皮提取物中蛋白抗原分子结合成条带者12例，阳性率为66.7%。所有4例PV血清都与表皮提取物中130 000分子反应，显示单一的结合带。1例PF和9例PE血清，只有4例与表皮提取物160 000分子显示单一的结合带，其余6例PE血清均未显示任何特异性蛋白结合带。4例PH血清，其中2例与表皮提取物中130 000分子显示单一的结合带；另2例则与表皮提取物中160 000反应，显示特异性的结合带。14例对照血清无1例显示特异性的蛋白结合带。
图1 表皮提取物的免疫印迹结果：3例PV血清(条1～3)和2例PH 血清(条4、5)
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照血清(条7)无结合带
图2 表皮提取物的免疫印迹结果：3例PE(条血清1～3)和1例PH血清(条4)在
160 000处呈结合，1例PV血清(条5)在130 000处呈结合带
三、讨论
我们的结果显示：4例PV和4例PH中2例血清与表皮提取物中的130 000蛋白反应，10例PF和PE患者中有4例和4例PH中2例血清与表皮提取物中160 000蛋白反应。这与国外学者报道的结果相似[3～5]。这些结果再次表明：免疫印迹技术能准确地测定天疱疮患者血清中自身抗体所对应的自身抗原的分子量，从而准确地诊断天疱疮，并可进一步加以分型。4例PH患者血清，其中2例血清与表皮提取物中130 000的分子呈特异性结合带，另2例血清则与160 000反应。因为PH可以是一个不稳定的临床异型，它既可以转变为PV，也可以转化为PF，这说明免疫印迹对典型的天疱疮能够诊断，对不典型的天疱疮亦能诊断。
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参 考 文 献
1 Korman N, Eyre RW, Klaus-Kovtun V, et al. Demonstration of an adhering-junctionmolecule (plakoglobin) in the autoantigens of pemphigus foliaceus and pemphigus vulgaris.N Engl J Med, 1989,32∶631-635.
2 Karpati S, Amagai M, Prussick R, et al. Pemphigus vulgaris antigen is a desmosomal desmoglein. Dermatology, 1994,189(Suppl 1)∶24-26.
3 Ogawa MM, Hashimoto T, Konohand A, et al. Immunoblot analyses of Brazilian pemphigus foliaceus antigen using different antigen sources. Arch Dermatol Res,1990,282∶84-88.
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4 Hashimoto T, Ogawa MM, Konohand A, et al. Detection of pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus antigens by immunoblot analysis using different antigen sources. J Invest Dermatol, 1990,94∶327-331.
5 Hashimoto T, Konohana A, Nishikawa T. Immunoblot assay as an aid to the diagnosis of unclassified cases of pemphigus. Arch Dermatol, 1991,127∶843-847.
(收稿：1997-01-16 修回：1997-05-03), 百拇医药