肿瘤坏死因子受体Ⅱ在郎格罕细胞迁移中的作用
作者：蔡钦朝 王秉鹤
单位：230038 合肥，安徽中医学院基础部(蔡钦朝)；南京医科大学第一附属医院(王秉鹤)
关键词：受体Ⅱ；肿瘤坏死因子；郎格罕细胞
中华皮肤科杂志980114
【摘要】 目的 应用肿瘤坏死因子(TNF)受体Ⅰ基因敲除突变型鼠，探讨TNFα介导郎格罕细胞(LC)向局部淋巴结迁移、引发免疫应答过程中，其两种膜受体：TNF受体Ⅰ和TNF受体Ⅱ所起的信号转导作用。方法 以免疫荧光标记及流式细胞分析技术分别观察TNF受体Ⅰ缺失鼠和经抗TNFα中和性抗体预处理以阻断其体内TNFα生物学效应的TNF受体Ⅰ缺失鼠在FITC接触致敏后，LC自皮肤向淋巴结的迁移情况，并与野生型鼠对照。结果 经致敏后，TNF受体Ⅰ缺失鼠淋巴结内出现的FITC携带细胞(证实为LC)数量与野生型鼠无明显差异；而经抗TNFα抗体预处理的TNF受体Ⅰ缺失鼠引流淋巴结内LC数量明显少于未经TNFα抗体预处理的对照组。结论 TNF受体Ⅰ在介导LC迁移中并非必需；在TNF受体Ⅰ缺失情况下，TNF受体Ⅱ的信号转导对LC的迁移可能发挥关键作用。
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Role of TNF Receptor Ⅱ in Migration of Langerhans Cells Cai Qinchao, Wang Binghe.Department of Basic Medical Sciences, Anhui College of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230038
【Abstract】 Objective To elucidate the role of signal transduction TNF receptor I(TNFR1) and TNF receptor Ⅱ (TNFR2) in Langerhans cells (LC) migration inimmuno-responses,TNFR1 gene-knock-out mutant mice were used in this study.Methods The LC migration from skin to regional lymph nodes after FITC sensitizatioonin both the TNFR1-deficient mice and the TNFR1-deficient mice pretreated with neutralizing antibody to TNFα were examined by immunolabelling and FCM, and TNFR1+/+ mice were used as control. Results Following FITC sensitization there was
, 百拇医药
no significant difference between the number of FITC+ cells (LC) found in lymph nodes from TNFR1-deficient mice, and from the wild type (TNFR1+/+) mice, and the number of LC found in the draining lymph nodes from anti-TNFα antibody pretreatment TNFR1-deficient mice was significantly lower than that of the mice not pretreated by anti-TNFα antibody. Conclusion It suggests that TNFR1 is not necessary in mediating LC migration and TNFR2 might be crucial in signal transduction in TNFR1-deficient mice.
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【Key words】 Receptor Ⅱ, Tumor necrosis factor Langerhans cells Signal transduction
表皮郎格罕细胞(LC)是体内重要的抗原提呈细胞，可以捕获、加工由皮肤进入的抗原并送达局部的引流淋巴结(DLN)提呈给TH细胞，引发免疫应答反应。LC的这种迁移与肿瘤坏死因子α(TNFα)等一些细胞因子及粘附分子的介导作用有关。TNFα具有多方面的生物学效应，这些效应都是通过其靶细胞上的膜受体TNF受体Ⅰ(TNFR1, p55)和TNF受体Ⅱ(TNFR2, p75)的信号转导实现的。我们采用TNFR1基因缺失鼠观察TNFR1在LC迁移中的作用；再以TNFα的中和性抗体(因未获得TNFR2基因缺失鼠或TNFR2抗体)阻断TNFR1缺失鼠体内尚存的TNFα的生物学效应，进一步观察LC迁移与TNFR2的信号转导作用的关系。
材料和方法
, 百拇医药
(一)实验动物及试剂：TNFR1基因敲除突变型小鼠(-/-鼠)由加拿大多伦多大学医学院T.W.Mak教授提供[1]。以C57BL/6小鼠为野生型对照(+/+鼠)。各组均由4～6只8～12周龄雌鼠组成。主要试剂有：藻红蛋白(PE)标记链霉亲和素、罗丹明(TRITC)标记亲和素(Sigma公司)，抗Ⅰa单抗、生物素化羊抗鼠IgG、荧光素(FITC)标记链霉亲和素(Cedarlane Laboratories Ltd)，抗Vr3TCR抗体(Pharmingen)及兔抗鼠TNFα中和性抗体(Genzyme Diagnostics)。
(二)实验动物的致敏：以FITC为致敏原[2]，将400μl 0.5% FITC的丙酮/二丁基苯二甲酸混合溶剂(50∶50，v/v)溶液涂抹于TNFR1-/-鼠及+/+鼠剃毛的躯干部、爪及耳廓，24小时取标本检查。
(三)小鼠表皮片免疫标记及LC计数：以原位免疫标记比较TNFR1-/-鼠致敏前、后表皮LC的形态、数量变化并与TNFR1+/+鼠作对照。由于鼠类表皮除LC外还存在另一类树突状细胞，即树突状表皮T细胞(dendritic epidermal T cell, DETC)[3]，它缺乏Ⅰa抗原，但表达Thy-1抗原及TCR，其TCR为γ、δ二聚体，由Vr3、Jr1、Cr1/Vδ1、Dδ2、Jδ2、Cδ组成，故也称Vr3DETC，我们对表皮片做Ia抗原和Vr3TCR两种标记，把Ia+的LC和Vr3DETC区别开。
, 百拇医药
常规制备表皮片并分组分别与抗Ia或抗Vr3TCR单抗室温孵化过夜；冲洗后皆与生物素化二抗37℃作用1小时；再经冲洗把未致敏鼠表皮片及致敏鼠表皮片分别与FITC标记链霉亲和素及TRITC标记亲和素37℃作用1小时，荧光显微镜观察并以网格式测微器计数Ⅰa+及Vr3TCR+细胞，即LC和DETC。
(四)DLN中LC的鉴定和计数：取致敏后24小时鼠腹股沟、腋窝、肩胛下淋巴结细心研碎、过筛制备淋巴结细胞悬液。并对此悬液中FITC+细胞作进一步富集：在14.5%甲基泛影酰胺上作密度梯度离心使FITC+细胞在悬液细胞总数中的百分率由1.5%～4%富集到80%。然后，分两组按上述间接免疫标记法，分别以抗Ⅰa或抗Vr3TCR为一抗、生物素化二抗及TRITC-亲和素复染，行双重荧光标记以备鉴定。
流式细胞分析：将上述淋巴结细胞悬液(未富集前)调整至细胞数1×106/ml，以Coulter EPICS 75L流式细胞仪分类计数FITC+及FITC-细胞，被检细胞不少于50 000个。另将富集后的淋巴结细胞于冰浴中与抗Ⅰa、生物素化二抗、PE-亲和素分别作用45、25、25分钟作双荧光标记以作双荧光流式细胞分析。
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(五)以抗TNFα抗体阻断TNFR1-/-鼠体内TNFα生物学效应：取两组TNFR1-/-鼠于涂抹半抗原FITC前2小时腹腔内分别注射100μl以PBS 1∶5稀释的兔抗鼠TNFα多克隆抗体或正常兔血清，仍按上述步骤致敏、检查DLN中LC。
结 果
(一)TNFR1-/-鼠与+/+鼠相同，致敏后表皮LC减少，详见附表。
(二)TNFR1-/-鼠致敏后LC同样向DLN迁
附表 致敏前后小鼠表皮树突状细胞的
数量对比(
±s)
基 因 型
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LC(细胞数/mm2)
DETC(细胞数/mm2)
致敏前
致敏后
致敏前
致敏后
TNFR1-/-鼠
426±85
177±135
402±69
411±72
TNFR1+/+鼠
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443±78
172±142
415±76
434±87
移：两种基因型小鼠致敏后DLN细胞经荧光显微镜检查结果相同；都含占总数1.5%
～4%的FITC携带细胞，黄绿色荧光颗粒集中在这些细胞的胞浆中(图1)。经富集后
以抗Ⅰa/TRITC标记，双荧光检查可见这些FITC+细胞表面显现红色荧光，即Ⅰa+，证明是LC。未发现FITC+细胞表现Vr3TCR阳性，表明并非DETC。
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图1 黄绿色荧光颗粒集中在FITC携带细胞胞浆中
(三)流式细胞分析显示，TNFR1-/-鼠和+/+鼠致敏后DLN细胞中FITC+细胞所占百分率分别为2.9%和2.2%。双荧光FCM表明此FITC+细胞中99%为Ia+，为来自皮肤的LC。
(四)抗TNFα抗体抑制TNFR1-/-鼠LC的迁移：抗TNFα预处理的TNFR1-/-鼠致敏后DLN中FITC+细胞(0.2%)明显少于以正常兔血清代替抗TNFα作预处理的对照组(2.2%)。
讨 论
郎格罕细胞是皮肤中重要的抗原递呈细胞，它摄取、处理接触性变态反应原，迁移至局部淋巴结递呈给T细胞，起动皮肤的免疫反应。虽已证实LC的迁移是诱导变态反应性接触性皮炎的关键一步，但其迁移的机理尚未搞清。近年来有较多的研究报告，研究表明某些表皮细胞因子如TNF-α能刺激LC的迁移。我们的研究不仅支持此看法，且进一步表明TNF受体Ⅱ在此起重要作用。了解LC迁移的机理不仅具有重要的理论意义，而且有助于开发调节皮肤免疫炎症反应的新治疗途径。如通过TNFR2的抗体来抑制LC迁移从而治疗变态反应性接触性皮炎。
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我们采用TNFR1缺失鼠，经接触致敏后其体内LC自皮肤向DLN迁移情况与同样致敏的野生型鼠无明显差别，TNFR1缺失鼠的这种迁移又可以被抗TNFα抗体所阻断。以上结果表明，TNFα是免疫应答中介导LC迁移的主要因素。在TNFα这项功能中：①TNFR1的信号转导对LC迁移并非必需。②TNFR2和TNFα的结合，与Thoma等的结论不同[4，5]，不仅可以引发细胞对TNFα的应答，在缺乏TNFR1的情况下，TNFR2的信号转导显示出对LC之迁移的关键作用。
参 考 文 献
1 Pfeffer K, Matsuyama T, Kundig TM, et al. Mice deficient for the 55kD tumor necrosisfactor receptor are resistant to endotoxic shock yet succumb to L. monocytogenes infection.Cell, 1993,73∶457-467.
, 百拇医药
2 Thomas WR, Esward AJ, Watkins MC, et al. Distribution of immunogenic cells afterpainting with the contact sensitizers fluorescein isothiocyanate and oxazolone: differentsensitizers form immunogenic complexes with different cell populations. Immunology,1980,39∶21-27.
3 Asarnow DM, Thomas G, LeFrancois L, et al. Distinct antigen receptor of two classes ofmurine epithelium-associated T cells. Nature, 1989,341∶60-62.
4 Thoma B, Grell M, Pfizenmaier K, et al. Identification of a 60kD tumor necrosis factor (TNF) receptor as the major signal transducing componnent in TNF responses. J Exp Med, 1990,172∶1019-1023.
5 Sheehan KCF, Pinckard JK, Arthur CD, et al. Monoclonal antibodies specific for murine p55 and p75 tumor necrosis factor receptors: identification of a novel in vivo role for p75. J Exp Med, 1995,181∶607-617.
(收稿：1997-01-05 修回：1997-08-01), 百拇医药
单位：230038 合肥，安徽中医学院基础部(蔡钦朝)；南京医科大学第一附属医院(王秉鹤)
关键词：受体Ⅱ；肿瘤坏死因子；郎格罕细胞
中华皮肤科杂志980114
【摘要】 目的 应用肿瘤坏死因子(TNF)受体Ⅰ基因敲除突变型鼠，探讨TNFα介导郎格罕细胞(LC)向局部淋巴结迁移、引发免疫应答过程中，其两种膜受体：TNF受体Ⅰ和TNF受体Ⅱ所起的信号转导作用。方法 以免疫荧光标记及流式细胞分析技术分别观察TNF受体Ⅰ缺失鼠和经抗TNFα中和性抗体预处理以阻断其体内TNFα生物学效应的TNF受体Ⅰ缺失鼠在FITC接触致敏后，LC自皮肤向淋巴结的迁移情况，并与野生型鼠对照。结果 经致敏后，TNF受体Ⅰ缺失鼠淋巴结内出现的FITC携带细胞(证实为LC)数量与野生型鼠无明显差异；而经抗TNFα抗体预处理的TNF受体Ⅰ缺失鼠引流淋巴结内LC数量明显少于未经TNFα抗体预处理的对照组。结论 TNF受体Ⅰ在介导LC迁移中并非必需；在TNF受体Ⅰ缺失情况下，TNF受体Ⅱ的信号转导对LC的迁移可能发挥关键作用。
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Role of TNF Receptor Ⅱ in Migration of Langerhans Cells Cai Qinchao, Wang Binghe.Department of Basic Medical Sciences, Anhui College of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230038
【Abstract】 Objective To elucidate the role of signal transduction TNF receptor I(TNFR1) and TNF receptor Ⅱ (TNFR2) in Langerhans cells (LC) migration inimmuno-responses,TNFR1 gene-knock-out mutant mice were used in this study.Methods The LC migration from skin to regional lymph nodes after FITC sensitizatioonin both the TNFR1-deficient mice and the TNFR1-deficient mice pretreated with neutralizing antibody to TNFα were examined by immunolabelling and FCM, and TNFR1+/+ mice were used as control. Results Following FITC sensitization there was
, 百拇医药
no significant difference between the number of FITC+ cells (LC) found in lymph nodes from TNFR1-deficient mice, and from the wild type (TNFR1+/+) mice, and the number of LC found in the draining lymph nodes from anti-TNFα antibody pretreatment TNFR1-deficient mice was significantly lower than that of the mice not pretreated by anti-TNFα antibody. Conclusion It suggests that TNFR1 is not necessary in mediating LC migration and TNFR2 might be crucial in signal transduction in TNFR1-deficient mice.
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【Key words】 Receptor Ⅱ, Tumor necrosis factor Langerhans cells Signal transduction
表皮郎格罕细胞(LC)是体内重要的抗原提呈细胞，可以捕获、加工由皮肤进入的抗原并送达局部的引流淋巴结(DLN)提呈给TH细胞，引发免疫应答反应。LC的这种迁移与肿瘤坏死因子α(TNFα)等一些细胞因子及粘附分子的介导作用有关。TNFα具有多方面的生物学效应，这些效应都是通过其靶细胞上的膜受体TNF受体Ⅰ(TNFR1, p55)和TNF受体Ⅱ(TNFR2, p75)的信号转导实现的。我们采用TNFR1基因缺失鼠观察TNFR1在LC迁移中的作用；再以TNFα的中和性抗体(因未获得TNFR2基因缺失鼠或TNFR2抗体)阻断TNFR1缺失鼠体内尚存的TNFα的生物学效应，进一步观察LC迁移与TNFR2的信号转导作用的关系。
材料和方法
, 百拇医药
(一)实验动物及试剂：TNFR1基因敲除突变型小鼠(-/-鼠)由加拿大多伦多大学医学院T.W.Mak教授提供[1]。以C57BL/6小鼠为野生型对照(+/+鼠)。各组均由4～6只8～12周龄雌鼠组成。主要试剂有：藻红蛋白(PE)标记链霉亲和素、罗丹明(TRITC)标记亲和素(Sigma公司)，抗Ⅰa单抗、生物素化羊抗鼠IgG、荧光素(FITC)标记链霉亲和素(Cedarlane Laboratories Ltd)，抗Vr3TCR抗体(Pharmingen)及兔抗鼠TNFα中和性抗体(Genzyme Diagnostics)。
(二)实验动物的致敏：以FITC为致敏原[2]，将400μl 0.5% FITC的丙酮/二丁基苯二甲酸混合溶剂(50∶50，v/v)溶液涂抹于TNFR1-/-鼠及+/+鼠剃毛的躯干部、爪及耳廓，24小时取标本检查。
(三)小鼠表皮片免疫标记及LC计数：以原位免疫标记比较TNFR1-/-鼠致敏前、后表皮LC的形态、数量变化并与TNFR1+/+鼠作对照。由于鼠类表皮除LC外还存在另一类树突状细胞，即树突状表皮T细胞(dendritic epidermal T cell, DETC)[3]，它缺乏Ⅰa抗原，但表达Thy-1抗原及TCR，其TCR为γ、δ二聚体，由Vr3、Jr1、Cr1/Vδ1、Dδ2、Jδ2、Cδ组成，故也称Vr3DETC，我们对表皮片做Ia抗原和Vr3TCR两种标记，把Ia+的LC和Vr3DETC区别开。
, 百拇医药
常规制备表皮片并分组分别与抗Ia或抗Vr3TCR单抗室温孵化过夜；冲洗后皆与生物素化二抗37℃作用1小时；再经冲洗把未致敏鼠表皮片及致敏鼠表皮片分别与FITC标记链霉亲和素及TRITC标记亲和素37℃作用1小时，荧光显微镜观察并以网格式测微器计数Ⅰa+及Vr3TCR+细胞，即LC和DETC。
(四)DLN中LC的鉴定和计数：取致敏后24小时鼠腹股沟、腋窝、肩胛下淋巴结细心研碎、过筛制备淋巴结细胞悬液。并对此悬液中FITC+细胞作进一步富集：在14.5%甲基泛影酰胺上作密度梯度离心使FITC+细胞在悬液细胞总数中的百分率由1.5%～4%富集到80%。然后，分两组按上述间接免疫标记法，分别以抗Ⅰa或抗Vr3TCR为一抗、生物素化二抗及TRITC-亲和素复染，行双重荧光标记以备鉴定。
流式细胞分析：将上述淋巴结细胞悬液(未富集前)调整至细胞数1×106/ml，以Coulter EPICS 75L流式细胞仪分类计数FITC+及FITC-细胞，被检细胞不少于50 000个。另将富集后的淋巴结细胞于冰浴中与抗Ⅰa、生物素化二抗、PE-亲和素分别作用45、25、25分钟作双荧光标记以作双荧光流式细胞分析。
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(五)以抗TNFα抗体阻断TNFR1-/-鼠体内TNFα生物学效应：取两组TNFR1-/-鼠于涂抹半抗原FITC前2小时腹腔内分别注射100μl以PBS 1∶5稀释的兔抗鼠TNFα多克隆抗体或正常兔血清，仍按上述步骤致敏、检查DLN中LC。
结 果
(一)TNFR1-/-鼠与+/+鼠相同，致敏后表皮LC减少，详见附表。
(二)TNFR1-/-鼠致敏后LC同样向DLN迁
附表 致敏前后小鼠表皮树突状细胞的
数量对比(
±s)基 因 型
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LC(细胞数/mm2)
DETC(细胞数/mm2)
致敏前
致敏后
致敏前
致敏后
TNFR1-/-鼠
426±85
177±135
402±69
411±72
TNFR1+/+鼠
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443±78
172±142
415±76
434±87
移：两种基因型小鼠致敏后DLN细胞经荧光显微镜检查结果相同；都含占总数1.5%
～4%的FITC携带细胞，黄绿色荧光颗粒集中在这些细胞的胞浆中(图1)。经富集后
以抗Ⅰa/TRITC标记，双荧光检查可见这些FITC+细胞表面显现红色荧光，即Ⅰa+，证明是LC。未发现FITC+细胞表现Vr3TCR阳性，表明并非DETC。
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图1 黄绿色荧光颗粒集中在FITC携带细胞胞浆中
(三)流式细胞分析显示，TNFR1-/-鼠和+/+鼠致敏后DLN细胞中FITC+细胞所占百分率分别为2.9%和2.2%。双荧光FCM表明此FITC+细胞中99%为Ia+，为来自皮肤的LC。
(四)抗TNFα抗体抑制TNFR1-/-鼠LC的迁移：抗TNFα预处理的TNFR1-/-鼠致敏后DLN中FITC+细胞(0.2%)明显少于以正常兔血清代替抗TNFα作预处理的对照组(2.2%)。
讨 论
郎格罕细胞是皮肤中重要的抗原递呈细胞，它摄取、处理接触性变态反应原，迁移至局部淋巴结递呈给T细胞，起动皮肤的免疫反应。虽已证实LC的迁移是诱导变态反应性接触性皮炎的关键一步，但其迁移的机理尚未搞清。近年来有较多的研究报告，研究表明某些表皮细胞因子如TNF-α能刺激LC的迁移。我们的研究不仅支持此看法，且进一步表明TNF受体Ⅱ在此起重要作用。了解LC迁移的机理不仅具有重要的理论意义，而且有助于开发调节皮肤免疫炎症反应的新治疗途径。如通过TNFR2的抗体来抑制LC迁移从而治疗变态反应性接触性皮炎。
, http://www.100md.com
我们采用TNFR1缺失鼠，经接触致敏后其体内LC自皮肤向DLN迁移情况与同样致敏的野生型鼠无明显差别，TNFR1缺失鼠的这种迁移又可以被抗TNFα抗体所阻断。以上结果表明，TNFα是免疫应答中介导LC迁移的主要因素。在TNFα这项功能中：①TNFR1的信号转导对LC迁移并非必需。②TNFR2和TNFα的结合，与Thoma等的结论不同[4，5]，不仅可以引发细胞对TNFα的应答，在缺乏TNFR1的情况下，TNFR2的信号转导显示出对LC之迁移的关键作用。
参 考 文 献
1 Pfeffer K, Matsuyama T, Kundig TM, et al. Mice deficient for the 55kD tumor necrosisfactor receptor are resistant to endotoxic shock yet succumb to L. monocytogenes infection.Cell, 1993,73∶457-467.
, 百拇医药
2 Thomas WR, Esward AJ, Watkins MC, et al. Distribution of immunogenic cells afterpainting with the contact sensitizers fluorescein isothiocyanate and oxazolone: differentsensitizers form immunogenic complexes with different cell populations. Immunology,1980,39∶21-27.
3 Asarnow DM, Thomas G, LeFrancois L, et al. Distinct antigen receptor of two classes ofmurine epithelium-associated T cells. Nature, 1989,341∶60-62.
4 Thoma B, Grell M, Pfizenmaier K, et al. Identification of a 60kD tumor necrosis factor (TNF) receptor as the major signal transducing componnent in TNF responses. J Exp Med, 1990,172∶1019-1023.
5 Sheehan KCF, Pinckard JK, Arthur CD, et al. Monoclonal antibodies specific for murine p55 and p75 tumor necrosis factor receptors: identification of a novel in vivo role for p75. J Exp Med, 1995,181∶607-617.
(收稿：1997-01-05 修回：1997-08-01), 百拇医药