系统性红斑狼疮患者淋巴细胞凋亡的研究
作者：石成钢；尹培达；刘亚光；董秀清
单位：510080 广州，中山医科大学附属第一医院风湿内科
关键词：红斑狼疮；系统性；淋巴细胞；细胞凋亡
中华皮肤科杂志980104
【摘要】 目的 研究系统性红斑狼疮患者(SLE)淋巴细胞凋亡情况以及自身抗体产生的关系。方法 通过分离出淋巴细胞，在12孔板内培养0、24、48小时，用吖啶橙染色，于荧光显微镜下观察计数。结果 22例SLE患者的淋巴细胞凋亡率较16例正常对照组在培养24、48小时时有显著增高(P均〈0.01)。SLE患者伴有2种以上自身抗体阳性者，培养24、48小时具有更高的淋巴细胞凋亡率(P〈0.05和P<0.01)。结论 SLE患者淋巴细胞在体外凋亡加速，可能与体内自身抗体产生增多有关，其淋巴细胞凋亡异常在其发病机制中起一定作用。
, http://www.100md.com
Study on Lymphocyte Apoptosis in Patients with Systemic Lupus Erythematosus Shi Chenggang,Yin Peida,Liu Yaguang,et al.Department of Rheumatology ,FirstAffiliated Hospital,Sun Yat-sen University of MedicalSciences,Guangzhou 510080
【Abstract】 Objective To assess the rate of apoptosis of lymphocytes isolatedfrom patients with systemic lupus erythematosus(SLE) and investigate the correlationbetween lymphocyte apoptosis(LA) and autoantibody production. Methods Lymphocytes were isolated by Ficoll-Hypaque gradient, cultured in 12-well plates for0,24,48 hours,and examined by acridine orange(AO) staining under fluorescencemicroscope. Results The rates of LA of 22 SLE patients were sigificantly increasedat t 24(P〈0.01) and t 48(P〈0.01) compared with those of 16 normal controls.The more severe the disease activity,the higher the rate of LA. In the patients with≥ 2 autoantibodies higher levels of LA at t 24 (P〈0.05) and t 48(P〈0.01) wereobserved. Conclusion The results indicate that the in vitro acceleration of LA in SLE
, 百拇医药
patients may be related to the increased production of autoantibodies, and theabnormalities of LA may play a role in the pathogenesis of SLE.
【Key words】 Lupus erythematosus,Systemic Lymphocyte Apoptosis
系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病，是由于多克隆的B细胞激活和T细胞功能异常，产生多种自身抗体，形成免疫复合物而致病。目前已证实：狼疮模型MRL-lpr/lpr小鼠中，由于内源性逆转录病毒早期转座子(early transposon, ETn)插入Fas/Apo-1基因(细胞凋亡诱导基因)，引起该基因突变，诱发细胞凋亡功能丧失，使自身反应性T细胞克隆消除功能缺陷和抗原诱导的成熟的自身反应性B细胞凋亡减少，导致淋巴样增殖(lymphoproliferation, lpr)和系统性淋巴增殖病(generalized lymphoproliferative disease, gld)，大量自身反应性淋巴细胞进入外周淋巴组织，产生多种自身抗体，引发一系列病理改变，如狼疮性肾炎、血管炎、淋巴结增大、皮肤损害等[1，2]。国外已有一些关于SLE患者细胞凋亡异常的研究报道[3，4]，但国内报道较少。本文研究旨在了解SLE患者外周血淋巴细胞凋亡(LA)情况与自身抗体产生的关系，以及使用糖皮质激素和细胞毒药物对LA的影响。
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病例和方法
一、研究对象
1996年6～12月，本院风湿内科住院的22例SLE患者，均符合1982年ARA诊断标准，其活动性指标按SLEDAI[5]；其中女20例，男2例，年龄19～54岁，平均31岁。16例正常人对照组为同期广州市血液中心健康献血者，其中女14例，男2例；年龄19～50岁，平均31岁。
二、淋巴细胞分离和培养
取5ml静脉肝素抗凝血，用淋巴细胞分离液获得淋巴细胞，将其培养于12孔板、含有10%胎牛血清的1640RPMI培养基内，置于37℃温箱中。分别培养0、24、48小时，等量取样作LA检测。
三、LA检测
吖啶橙(acridine orange, AO)染色，荧光显微镜检测[3]，方法简述为：取25μl淋巴细胞，加入1μl AO液(100μg/ml)充分混匀，再加入20μl 1%多聚甲醛固定细胞，24小时内荧光显微镜观察计数。每份标本2人双盲观察计数，计数200个以上细胞，其凋亡细胞确定标准为[3]：①核碎裂有凋亡小体(图1)；②核浓缩，形成新月体状(图2)；③核有空泡(图3)。
, 百拇医药
图1 三个细胞均为凋亡细胞，核碎裂，有凋亡小体(×40)
图2 右为凋亡细胞，核浓缩，形成新月状，旁有一凋亡小体；左为正常细胞(×40)
图3 右上角细胞核有空泡(黑影)，两个小细胞为凋亡细胞，三个大细胞为正常细
胞(×40)
四、临床资料
在取血作LA检测同时，用免疫印迹法检测各种自身抗体(主要包括ANA、抗ds-DNA、抗-Sm、抗RNP、抗Rib、抗SS-A、抗SS-B、抗Jo-1、抗Scl-70、RF)及收集有关资料。
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五、统计学处理
结果中所列数据以
±s表示，均进行方差分析，采用t检验或t′检验。
结 果
一、SLE患者与正常人对照组LA率比较及疾病活动性影响
经培养24、48小时后，SLE患者LA较正常人对照组约有3倍左右增高；活动期SLE，LA率较稳定期明显增高。使用皮质类固醇激素或环磷酰胺组，其LA率在24小时时均较未用药组有明显增高，但48小时时无显著性差异(见表1)。
二、自身抗体产生与LA间的关系
2种以上自身抗体阳性者较1种阳性者，其淋巴细胞随着体外培养时间延长而凋亡显著加速(见表2)。
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表1 SLE患者与正常人对照组不同培养时间
淋巴细胞凋亡率(%)比较(±s)
组 别
例数
培养不同时间淋巴细胞凋亡率
0小时
24小时
48小时
正常人对照组
16
1.22±0.88
, http://www.100md.com
8.66±3.38
15.38±6.32
SLE患者
22
1.65±1.09
26.70±10.83**
44.84±13.66**
稳定期
9
1.50±1.12
20.61±8.48
, http://www.100md.com 37.06±12.79
活动期
13
1.65±1.05
30.85±10.38*
50.23±11.86*
注：SLE患者与正常人对照组间及SLE患者稳定期与活动期间比较*P〈0.05，**P〈0.01
表2 2种以上自身抗体(Ab)阳性与一种或无自身抗体阳性的
SLE患者淋巴细胞凋亡率(%)比较(±s)
, 百拇医药
组 别
例数
培养不同时间淋巴细胞凋亡率
0小时
24小时
48小时
≤1种Ab组
10
2.05±1.14
21.65±9.31
36.45±11.99
≥2种Ab组
, 百拇医药
12
1.21±0.84
30.92±10.50*
52.50±11.54**
*P〈0.05，**P〈0.01
讨 论
本研究将SLE患者外周血淋巴细胞在体外培养，其凋亡较正常健康者显著增高增快，这是因为SLE患者体内淋巴细胞本身可能有凋亡基因表达异常，或过多处于激活状态，出现激活诱导性细胞凋亡(activation-induced cell death)，因而在体外培养后则易进入凋亡[3]。结果还显示：SLE患者自身抗体产生越多者，其LA率就越高，这与目前关于SLE发病机理中的新假说相吻合，即SLE的LA加速、暴露并释放出较多的自身抗原，它们作为隐蔽抗原，激发自身免疫反应，产生更多自身抗体，并与之结合形成免疫复合物而致病[6]。并且，随着疾病活动增加，LA更多，出现更多自身抗原及抗体，亦即疾病愈活动，凋亡改变愈明显
, 百拇医药
[3]。
本研究只是检测SLE患者总体LA情况，说明SLE患者LA在体外加速，与体内自身抗体产生增多可能有关，并在其发病机理中起一定作用。
参 考 文 献
1 Chu JL, Drappa J, Parnassa A, et al. The defect in Fas mRNA expression in MRL/lpr miceis associated with insertion of the retrotransposon, ETn. J Exp Med, 1993,178∶723-730.
2 Wu JG, Zhou T, He J, et al. Autoimmune disease in mice due to integration of anendogenous retrovirus in an apoptosis gene. J Exp Med, 1993,178∶461-468.
, 百拇医药
3 Emlen W, Niebur J, Kadera R. Acclerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patientswith systemic lupus erythematosus. J Immunol, 1994,152∶3685-3692.
4 Mysler E, Bini P, Drappa J, et al. The apoptosis-1/Fas protein in human systemic lupuserythematosus. J Clin Invest, 1994,93∶1029-1034.
5 Bombardier C, Gladman DD, Urowitz MB, et al. Derivation of the SLEDAI: a diseaseactivity index for lupus patients. Arthritis Rheum, 1992,35∶630-640.
6 Mohan C, Datta SK. Lupus: key pathogenic mechanisms and contributing factors. ClinImmunol Immunopathol, 1995,77∶209-220.
(收稿：1997-03-17 修回：1997-09-30), 百拇医药
单位：510080 广州，中山医科大学附属第一医院风湿内科
关键词：红斑狼疮；系统性；淋巴细胞；细胞凋亡
中华皮肤科杂志980104
【摘要】 目的 研究系统性红斑狼疮患者(SLE)淋巴细胞凋亡情况以及自身抗体产生的关系。方法 通过分离出淋巴细胞，在12孔板内培养0、24、48小时，用吖啶橙染色，于荧光显微镜下观察计数。结果 22例SLE患者的淋巴细胞凋亡率较16例正常对照组在培养24、48小时时有显著增高(P均〈0.01)。SLE患者伴有2种以上自身抗体阳性者，培养24、48小时具有更高的淋巴细胞凋亡率(P〈0.05和P<0.01)。结论 SLE患者淋巴细胞在体外凋亡加速，可能与体内自身抗体产生增多有关，其淋巴细胞凋亡异常在其发病机制中起一定作用。
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Study on Lymphocyte Apoptosis in Patients with Systemic Lupus Erythematosus Shi Chenggang,Yin Peida,Liu Yaguang,et al.Department of Rheumatology ,FirstAffiliated Hospital,Sun Yat-sen University of MedicalSciences,Guangzhou 510080
【Abstract】 Objective To assess the rate of apoptosis of lymphocytes isolatedfrom patients with systemic lupus erythematosus(SLE) and investigate the correlationbetween lymphocyte apoptosis(LA) and autoantibody production. Methods Lymphocytes were isolated by Ficoll-Hypaque gradient, cultured in 12-well plates for0,24,48 hours,and examined by acridine orange(AO) staining under fluorescencemicroscope. Results The rates of LA of 22 SLE patients were sigificantly increasedat t 24(P〈0.01) and t 48(P〈0.01) compared with those of 16 normal controls.The more severe the disease activity,the higher the rate of LA. In the patients with≥ 2 autoantibodies higher levels of LA at t 24 (P〈0.05) and t 48(P〈0.01) wereobserved. Conclusion The results indicate that the in vitro acceleration of LA in SLE
, 百拇医药
patients may be related to the increased production of autoantibodies, and theabnormalities of LA may play a role in the pathogenesis of SLE.
【Key words】 Lupus erythematosus,Systemic Lymphocyte Apoptosis
系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病，是由于多克隆的B细胞激活和T细胞功能异常，产生多种自身抗体，形成免疫复合物而致病。目前已证实：狼疮模型MRL-lpr/lpr小鼠中，由于内源性逆转录病毒早期转座子(early transposon, ETn)插入Fas/Apo-1基因(细胞凋亡诱导基因)，引起该基因突变，诱发细胞凋亡功能丧失，使自身反应性T细胞克隆消除功能缺陷和抗原诱导的成熟的自身反应性B细胞凋亡减少，导致淋巴样增殖(lymphoproliferation, lpr)和系统性淋巴增殖病(generalized lymphoproliferative disease, gld)，大量自身反应性淋巴细胞进入外周淋巴组织，产生多种自身抗体，引发一系列病理改变，如狼疮性肾炎、血管炎、淋巴结增大、皮肤损害等[1，2]。国外已有一些关于SLE患者细胞凋亡异常的研究报道[3，4]，但国内报道较少。本文研究旨在了解SLE患者外周血淋巴细胞凋亡(LA)情况与自身抗体产生的关系，以及使用糖皮质激素和细胞毒药物对LA的影响。
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病例和方法
一、研究对象
1996年6～12月，本院风湿内科住院的22例SLE患者，均符合1982年ARA诊断标准，其活动性指标按SLEDAI[5]；其中女20例，男2例，年龄19～54岁，平均31岁。16例正常人对照组为同期广州市血液中心健康献血者，其中女14例，男2例；年龄19～50岁，平均31岁。
二、淋巴细胞分离和培养
取5ml静脉肝素抗凝血，用淋巴细胞分离液获得淋巴细胞，将其培养于12孔板、含有10%胎牛血清的1640RPMI培养基内，置于37℃温箱中。分别培养0、24、48小时，等量取样作LA检测。
三、LA检测
吖啶橙(acridine orange, AO)染色，荧光显微镜检测[3]，方法简述为：取25μl淋巴细胞，加入1μl AO液(100μg/ml)充分混匀，再加入20μl 1%多聚甲醛固定细胞，24小时内荧光显微镜观察计数。每份标本2人双盲观察计数，计数200个以上细胞，其凋亡细胞确定标准为[3]：①核碎裂有凋亡小体(图1)；②核浓缩，形成新月体状(图2)；③核有空泡(图3)。
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图1 三个细胞均为凋亡细胞，核碎裂，有凋亡小体(×40)
图2 右为凋亡细胞，核浓缩，形成新月状，旁有一凋亡小体；左为正常细胞(×40)
图3 右上角细胞核有空泡(黑影)，两个小细胞为凋亡细胞，三个大细胞为正常细
胞(×40)
四、临床资料
在取血作LA检测同时，用免疫印迹法检测各种自身抗体(主要包括ANA、抗ds-DNA、抗-Sm、抗RNP、抗Rib、抗SS-A、抗SS-B、抗Jo-1、抗Scl-70、RF)及收集有关资料。
, http://www.100md.com
五、统计学处理
结果中所列数据以
±s表示，均进行方差分析，采用t检验或t′检验。结 果
一、SLE患者与正常人对照组LA率比较及疾病活动性影响
经培养24、48小时后，SLE患者LA较正常人对照组约有3倍左右增高；活动期SLE，LA率较稳定期明显增高。使用皮质类固醇激素或环磷酰胺组，其LA率在24小时时均较未用药组有明显增高，但48小时时无显著性差异(见表1)。
二、自身抗体产生与LA间的关系
2种以上自身抗体阳性者较1种阳性者，其淋巴细胞随着体外培养时间延长而凋亡显著加速(见表2)。
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表1 SLE患者与正常人对照组不同培养时间
淋巴细胞凋亡率(%)比较(
±s)组 别
例数
培养不同时间淋巴细胞凋亡率
0小时
24小时
48小时
正常人对照组
16
1.22±0.88
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8.66±3.38
15.38±6.32
SLE患者
22
1.65±1.09
26.70±10.83**
44.84±13.66**
稳定期
9
1.50±1.12
20.61±8.48
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活动期
13
1.65±1.05
30.85±10.38*
50.23±11.86*
注：SLE患者与正常人对照组间及SLE患者稳定期与活动期间比较*P〈0.05，**P〈0.01
表2 2种以上自身抗体(Ab)阳性与一种或无自身抗体阳性的
SLE患者淋巴细胞凋亡率(%)比较(
±s), 百拇医药
组 别
例数
培养不同时间淋巴细胞凋亡率
0小时
24小时
48小时
≤1种Ab组
10
2.05±1.14
21.65±9.31
36.45±11.99
≥2种Ab组
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12
1.21±0.84
30.92±10.50*
52.50±11.54**
*P〈0.05，**P〈0.01
讨 论
本研究将SLE患者外周血淋巴细胞在体外培养，其凋亡较正常健康者显著增高增快，这是因为SLE患者体内淋巴细胞本身可能有凋亡基因表达异常，或过多处于激活状态，出现激活诱导性细胞凋亡(activation-induced cell death)，因而在体外培养后则易进入凋亡[3]。结果还显示：SLE患者自身抗体产生越多者，其LA率就越高，这与目前关于SLE发病机理中的新假说相吻合，即SLE的LA加速、暴露并释放出较多的自身抗原，它们作为隐蔽抗原，激发自身免疫反应，产生更多自身抗体，并与之结合形成免疫复合物而致病[6]。并且，随着疾病活动增加，LA更多，出现更多自身抗原及抗体，亦即疾病愈活动，凋亡改变愈明显
, 百拇医药
[3]。
本研究只是检测SLE患者总体LA情况，说明SLE患者LA在体外加速，与体内自身抗体产生增多可能有关，并在其发病机理中起一定作用。
参 考 文 献
1 Chu JL, Drappa J, Parnassa A, et al. The defect in Fas mRNA expression in MRL/lpr miceis associated with insertion of the retrotransposon, ETn. J Exp Med, 1993,178∶723-730.
2 Wu JG, Zhou T, He J, et al. Autoimmune disease in mice due to integration of anendogenous retrovirus in an apoptosis gene. J Exp Med, 1993,178∶461-468.
, 百拇医药
3 Emlen W, Niebur J, Kadera R. Acclerated in vitro apoptosis of lymphocytes from patientswith systemic lupus erythematosus. J Immunol, 1994,152∶3685-3692.
4 Mysler E, Bini P, Drappa J, et al. The apoptosis-1/Fas protein in human systemic lupuserythematosus. J Clin Invest, 1994,93∶1029-1034.
5 Bombardier C, Gladman DD, Urowitz MB, et al. Derivation of the SLEDAI: a diseaseactivity index for lupus patients. Arthritis Rheum, 1992,35∶630-640.
6 Mohan C, Datta SK. Lupus: key pathogenic mechanisms and contributing factors. ClinImmunol Immunopathol, 1995,77∶209-220.
(收稿：1997-03-17 修回：1997-09-30), 百拇医药