聚合酶链反应检测Kaposi肉瘤组织中类疱疹病毒DNA
作者：夏建新 占部和敬 堀嘉昭
单位：130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科(夏建新)；日本九州大学医学部皮肤科教室(占部和敬 堀嘉昭)
关键词：
中华皮肤科杂志/980421 近年来，国外许多研究结果认为Kaposi肉瘤与巨细胞病毒、疱疹病毒-6型、乙肝病毒、支原体等感染有关[1]。Chang等[2]发现Kaposi肉瘤患者皮损有类疱疹病毒(HHV-8)，并测定出其碱基排列顺序。为此，我们用一针对HHV-8基因的引物进行扩增，以研究HHV-8感染与Kaposi肉瘤发病的关系。
一、材料和方法
(一)标本来源：日本九州大学医学部皮肤科及病理科近10年明确诊断为Kaposi肉瘤1例(抗HIV抗体阳性)，临床可疑Kaposi肉瘤2例(1例抗HIV抗体阳性，另1例阴性)，血管肉瘤、化脓性肉芽肿各1例。
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(二)实验方法：
1.模板DNA的制备：将标本切成10μm厚度，移至1.5ml的微离心管中，用二甲苯脱蜡、无水乙醇脱二甲苯后真空干燥20分钟，取含200μg/ml蛋白酶K的50mmol/L TE缓冲液100μl加入标本中，37℃过夜，混匀后95℃加热10分钟灭活蛋白酶K，然后15?$000r/min 10分钟，PCR反应时取上清液10μl。
2.寡聚核苷酸引物[2]：引物1：5′AGCCGAAAGGATTCCACCAT3′，引物2：5′TCCGTGTTGTCTACGTCCAG3′，这对引物扩增的片段为233bp。
3.PCR扩增：采用50μl反应体系，其中包括0.5μl Taq DNA聚合酶(5U/L)，4μl dNTPs(每种dNTP 0.2mmol/L)，0.5μl的引物1及引物2(0.4nmol/L)，10μl模板DNA，10×PCR反应缓冲液5μl(含MgCl2、KCl、Tris-Cl、Triton X-100)，无菌双蒸水29.5μl，混匀后其表面覆盖一滴石蜡油，在PCR自动循环仪上按下列条件进行循环：①94℃ 5分钟，58℃ 5分钟，72℃ 2分钟；②94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 1分30秒，共38个循环；③94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 10分钟。反应结束后，在含有0.5μg/ml溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳25分钟，紫外灯下观察结果。
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4.产物特异性鉴定：取纯化的PCR扩增产物2份各10μl，分别加入ApaⅠ及AluⅠ各1.5μl，10×酶解反应缓冲液2μl，灭菌双蒸水6.5μl，37℃温浴2小时，然后94℃加热5分钟终止反应，取消化液在含有0.5μg/ml溴化乙锭的2.5%琼脂糖凝胶中电泳30分钟，紫外灯下观察结果。
二、结果
5例标本中，明确诊断Kaposi肉瘤者为阳性(此患者抗HIV阳性)，临床可疑Kaposi肉瘤2例中抗HIV阴性者为阳性，抗HIV阳性者为阴性，化脓性肉芽肿及血管肉瘤均阴性。阳性扩增产物可被限制性内切酶ApaⅠ及AluⅠ切为142bp、91bp及133bp、100bp的2个小片段，证实扩增产物为预期片段(图1)。
三、讨论
我们利用PCR技术，对可疑Kaposi肉瘤患者的病理标本进行HHV-8的检测，结果临床及病理明确诊断Kaposi肉瘤的1例患者2处皮损均为阳性，此患者抗HIV阳性，为艾滋病相关型。临床可疑Kaposi肉瘤2例中，有1例HHV-8阳性，此患者抗HIV阴性，病理虽无Kaposi肉瘤的典型改变，但也有内皮细胞及血管的增生，考虑为经典型Kaposi肉瘤；另1例HHV-8阴性者，抗HIV阳性，临床虽可疑Kaposi肉瘤，但病理仅见真皮浅层有少许淋巴细胞浸润，无Kaposi肉瘤改变。由此可见，不论经典型或艾滋病相关型，均可检测到HHV-8。由于Kaposi肉瘤的病理改变与血管肉瘤、肉芽肿性疾病不易区分，我们将血管肉瘤、化脓性肉芽肿的病理组织也进行了HHV-8的检测，结果均阴性，证实了HHV-8仅与Kaposi肉瘤有关。
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图1 消化液在琼脂糖凝胶中电泳结果
参 考 文 献
1 Bovenzi P, Mirandola P, Secchiero P, et al. Human herpesvirus 6(variant A) in Kaposi′s sarcoma. Lancet, 1993,1∶1288-1289.
2 Chang Y, Cesarman E, Pessin MS, et al. Identification of herpesvirus-like DNAsequences in AIDS-associated Kaposi′s sarcoma. Science, 1994,266∶1865-1869.
(收稿：1997-08-01 修回：1997-12-16), http://www.100md.com
单位：130041 长春，白求恩医科大学第二临床学院皮肤科(夏建新)；日本九州大学医学部皮肤科教室(占部和敬 堀嘉昭)
关键词：
中华皮肤科杂志/980421 近年来，国外许多研究结果认为Kaposi肉瘤与巨细胞病毒、疱疹病毒-6型、乙肝病毒、支原体等感染有关[1]。Chang等[2]发现Kaposi肉瘤患者皮损有类疱疹病毒(HHV-8)，并测定出其碱基排列顺序。为此，我们用一针对HHV-8基因的引物进行扩增，以研究HHV-8感染与Kaposi肉瘤发病的关系。
一、材料和方法
(一)标本来源：日本九州大学医学部皮肤科及病理科近10年明确诊断为Kaposi肉瘤1例(抗HIV抗体阳性)，临床可疑Kaposi肉瘤2例(1例抗HIV抗体阳性，另1例阴性)，血管肉瘤、化脓性肉芽肿各1例。
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(二)实验方法：
1.模板DNA的制备：将标本切成10μm厚度，移至1.5ml的微离心管中，用二甲苯脱蜡、无水乙醇脱二甲苯后真空干燥20分钟，取含200μg/ml蛋白酶K的50mmol/L TE缓冲液100μl加入标本中，37℃过夜，混匀后95℃加热10分钟灭活蛋白酶K，然后15?$000r/min 10分钟，PCR反应时取上清液10μl。
2.寡聚核苷酸引物[2]：引物1：5′AGCCGAAAGGATTCCACCAT3′，引物2：5′TCCGTGTTGTCTACGTCCAG3′，这对引物扩增的片段为233bp。
3.PCR扩增：采用50μl反应体系，其中包括0.5μl Taq DNA聚合酶(5U/L)，4μl dNTPs(每种dNTP 0.2mmol/L)，0.5μl的引物1及引物2(0.4nmol/L)，10μl模板DNA，10×PCR反应缓冲液5μl(含MgCl2、KCl、Tris-Cl、Triton X-100)，无菌双蒸水29.5μl，混匀后其表面覆盖一滴石蜡油，在PCR自动循环仪上按下列条件进行循环：①94℃ 5分钟，58℃ 5分钟，72℃ 2分钟；②94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 1分30秒，共38个循环；③94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 10分钟。反应结束后，在含有0.5μg/ml溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳25分钟，紫外灯下观察结果。
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4.产物特异性鉴定：取纯化的PCR扩增产物2份各10μl，分别加入ApaⅠ及AluⅠ各1.5μl，10×酶解反应缓冲液2μl，灭菌双蒸水6.5μl，37℃温浴2小时，然后94℃加热5分钟终止反应，取消化液在含有0.5μg/ml溴化乙锭的2.5%琼脂糖凝胶中电泳30分钟，紫外灯下观察结果。
二、结果
5例标本中，明确诊断Kaposi肉瘤者为阳性(此患者抗HIV阳性)，临床可疑Kaposi肉瘤2例中抗HIV阴性者为阳性，抗HIV阳性者为阴性，化脓性肉芽肿及血管肉瘤均阴性。阳性扩增产物可被限制性内切酶ApaⅠ及AluⅠ切为142bp、91bp及133bp、100bp的2个小片段，证实扩增产物为预期片段(图1)。
三、讨论
我们利用PCR技术，对可疑Kaposi肉瘤患者的病理标本进行HHV-8的检测，结果临床及病理明确诊断Kaposi肉瘤的1例患者2处皮损均为阳性，此患者抗HIV阳性，为艾滋病相关型。临床可疑Kaposi肉瘤2例中，有1例HHV-8阳性，此患者抗HIV阴性，病理虽无Kaposi肉瘤的典型改变，但也有内皮细胞及血管的增生，考虑为经典型Kaposi肉瘤；另1例HHV-8阴性者，抗HIV阳性，临床虽可疑Kaposi肉瘤，但病理仅见真皮浅层有少许淋巴细胞浸润，无Kaposi肉瘤改变。由此可见，不论经典型或艾滋病相关型，均可检测到HHV-8。由于Kaposi肉瘤的病理改变与血管肉瘤、肉芽肿性疾病不易区分，我们将血管肉瘤、化脓性肉芽肿的病理组织也进行了HHV-8的检测，结果均阴性，证实了HHV-8仅与Kaposi肉瘤有关。
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图1 消化液在琼脂糖凝胶中电泳结果
参 考 文 献
1 Bovenzi P, Mirandola P, Secchiero P, et al. Human herpesvirus 6(variant A) in Kaposi′s sarcoma. Lancet, 1993,1∶1288-1289.
2 Chang Y, Cesarman E, Pessin MS, et al. Identification of herpesvirus-like DNAsequences in AIDS-associated Kaposi′s sarcoma. Science, 1994,266∶1865-1869.
(收稿：1997-08-01 修回：1997-12-16), http://www.100md.com