白癜风患者血清抗黑素瘤细胞抗体的检测
作者：兰风华 陈苏民 高磊 刘玉峰 范雪莉
单位：710032 西安，第四军医大学生物化学教研室(兰风华 陈苏民 高磊)，西京医院皮肤科(刘玉峰 范雪莉)
关键词：
中华皮肤科杂志/980414 已经证明，在很大一部分白癜风患者血清中存在着抗正常黑素细胞自身抗体[1，2]。该类抗体可介导对黑素细胞的免疫损害[3]，并在实验动物上诱发与白癜风类似的病变[4]。我们采用免疫组化方法，对白癜风患者、非白癜风患者和健康人血清抗黑素瘤细胞抗体进行了检测。
一、材料和方法
(一)试剂：小牛血清购自华美生物工程公司，羊抗人IgG(γ链)-辣根过氧化物酶(HRP)结合物(二抗)，为Sigma产品。HRP底物3,3′-二氨基联苯胺(DAB)，为Serva进口分装产品。
, http://www.100md.com
(二)黑素瘤细胞：来源于恶性黑素瘤患者，细胞株名Libr，由本校免疫教研室金伯泉教授提供。对照细胞为食道癌细胞(Eca109)。
(三)血清：取自20例白癜风患者、31例非白癜风住院患者(本校西京医院)和23例正常人(体检健康者)。其中白癜风患者均为活动期非节段型门诊患者，未合并其他疾病，男8例，女12例，平均年龄31岁。非白癜风住院患者中，各类肿瘤18例，自身免疫性疾病(风湿、类风湿和皮肌炎)8例，感染性疾病5例。
(四)细胞涂片的制作：上述细胞经体外培养后，离心收集，并用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤1次。用PBS悬浮，适当调节细胞密度，用微量加样器涂于十二孔载玻片上，每孔约5μl，在室温下自然干燥。载玻片浸于丙酮中固定约10分钟，干燥后密封保存于-20℃或4℃下，备用。
(五)免疫组化：按常规病理方法。细胞涂片先浸于0.3% H2O2-甲醇液约30分钟，除去内源性过氧化物酶活性。用小牛血清封闭后，加1∶5稀释血清，37℃下孵育1小时。洗涤后加适当稀释的HRP-二抗结合物，37℃下作用1小时。最后加DAB底物液显色，约20分钟。按常规方法衬染、透明、封片。
, 百拇医药
二、结果
黑素瘤细胞涂片进行免疫组化染色后，于光镜下观察结果。细胞出现棕褐色者为阳性(图1A)，未见棕褐色染色者为阴性(图1B)。阳性者细胞浆呈均一着色，细胞核不着色。
受检查的20例白癜风患者中，有13例出现阳性结果，阳性率为65%。31例非白癜风住院患者仅有3例阳性，阳性率10%。23例门诊体检健康者无1例出现阳性结果。经χ2检验，白癜风患者组与非白癜风患者组、健康人组间的差异均有非常显著性差异(χ2分别为17.28和21.48，P<0.01)，而非白癜风患者组与健康人组之间的差异无显著性(χ2=2.30，P>0.05)。
用白癜风患者的阳性血清对食道癌细胞(Eca109)进行免疫组化染色，未见细胞出现棕褐色着色(图1C)。非白癜风患者组的三份阳性血清均使对照细胞出现着色。白癜风患者组的部分阳性血清尚经间接免疫荧光检查，结果与免疫组化一致：黑素瘤细胞胞浆呈均一荧光(图1D)。
, 百拇医药
三、讨论
大量的临床观察表明，在黑素瘤患者中，白癜风的发病率远高于普通人群；而恶性黑素瘤继发白癜风的患者往往预后较好。Bystryn[5]认为白癜风是对黑素瘤的一种天然免疫。本研究观察到，20例白癜风患者中有13例患者血清使黑素瘤细胞的免疫组化染色呈阳性，阳性率为65%，证明白癜风患者体内存在着抗黑素瘤细胞抗体。该组抗体与白癜风抗黑素细胞自身抗体是否属同一组抗体，有待进一步研究。
白癜风患者组阳性血清不与食道癌细胞反应，说明它们与黑素瘤细胞的结合是特异的。与此相反，非白癜风患者组的三份阳性血清与黑素瘤细胞的反应是非特异的，因为它们同时也与食道癌细胞反应。本研究观察到的阳性血清均使黑素瘤细胞浆呈比较均一的着色，在间接免疫荧光中使细胞浆呈均一荧光，提示阳性血清所识别的抗原位于黑素瘤细胞胞浆，但不排除同时位于细胞浆和细胞表面的情况。白癜风患者体内存在着能与黑素瘤细胞特异结合的IgG抗体，说明其对黑素瘤具有一定的特异性体液免疫力，支持Bystryn的观点[5]。如何利用这种免疫力以对抗黑素瘤，是值得今后探讨的问题。
, 百拇医药
图1 细胞涂片的免疫组化和
免疫荧光结果(×400)
志谢 本研究在收集血清时得到了西京医院皮肤科关鹏举教授、高天文副教授等的大力协助。病理教研室王伯教授、叶苓博士为免疫组化工作提供了具体指导
参 考 文 献
1 Naughton GK, Eisinger M, Bystryn JC. Detection of antibodies to melanocytes in vitiligo by specific immunoprecipitation. J Invest Dermatol, 1983,81∶540-542.
2 毕志刚, Soltunia K, Saunders J, 等. 白癜风患者血清中抗黑素细胞自身抗体的研究. 中华皮肤科杂志, 1991,24∶154-156.
, 百拇医药
3 Norris DA, Kissinger RM, Naughton GM, et al. Evidence for immunologic mechanisms in human vitiligo: patients′ sera induce damage to human melanocytes invitro by complement-mediated damage and antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Invest Dermatol, 1988,90∶783-789.
4 Gilhar A, Zelickson B, Ulman Y, et al. In vivo destruction of melanocytes by the IgG fraction of serum from patients with vitiligo. J Invest Dermatol, 1995,105∶683-686.
5 Bystryn JJ. Serum antibodies in vitiligo patients. Clin Dermatol, 1989,7∶136-138.
(收稿：1997-09-04 修回：1997-12-08), 百拇医药
单位：710032 西安，第四军医大学生物化学教研室(兰风华 陈苏民 高磊)，西京医院皮肤科(刘玉峰 范雪莉)
关键词：
中华皮肤科杂志/980414 已经证明，在很大一部分白癜风患者血清中存在着抗正常黑素细胞自身抗体[1，2]。该类抗体可介导对黑素细胞的免疫损害[3]，并在实验动物上诱发与白癜风类似的病变[4]。我们采用免疫组化方法，对白癜风患者、非白癜风患者和健康人血清抗黑素瘤细胞抗体进行了检测。
一、材料和方法
(一)试剂：小牛血清购自华美生物工程公司，羊抗人IgG(γ链)-辣根过氧化物酶(HRP)结合物(二抗)，为Sigma产品。HRP底物3,3′-二氨基联苯胺(DAB)，为Serva进口分装产品。
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(二)黑素瘤细胞：来源于恶性黑素瘤患者，细胞株名Libr，由本校免疫教研室金伯泉教授提供。对照细胞为食道癌细胞(Eca109)。
(三)血清：取自20例白癜风患者、31例非白癜风住院患者(本校西京医院)和23例正常人(体检健康者)。其中白癜风患者均为活动期非节段型门诊患者，未合并其他疾病，男8例，女12例，平均年龄31岁。非白癜风住院患者中，各类肿瘤18例，自身免疫性疾病(风湿、类风湿和皮肌炎)8例，感染性疾病5例。
(四)细胞涂片的制作：上述细胞经体外培养后，离心收集，并用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤1次。用PBS悬浮，适当调节细胞密度，用微量加样器涂于十二孔载玻片上，每孔约5μl，在室温下自然干燥。载玻片浸于丙酮中固定约10分钟，干燥后密封保存于-20℃或4℃下，备用。
(五)免疫组化：按常规病理方法。细胞涂片先浸于0.3% H2O2-甲醇液约30分钟，除去内源性过氧化物酶活性。用小牛血清封闭后，加1∶5稀释血清，37℃下孵育1小时。洗涤后加适当稀释的HRP-二抗结合物，37℃下作用1小时。最后加DAB底物液显色，约20分钟。按常规方法衬染、透明、封片。
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二、结果
黑素瘤细胞涂片进行免疫组化染色后，于光镜下观察结果。细胞出现棕褐色者为阳性(图1A)，未见棕褐色染色者为阴性(图1B)。阳性者细胞浆呈均一着色，细胞核不着色。
受检查的20例白癜风患者中，有13例出现阳性结果，阳性率为65%。31例非白癜风住院患者仅有3例阳性，阳性率10%。23例门诊体检健康者无1例出现阳性结果。经χ2检验，白癜风患者组与非白癜风患者组、健康人组间的差异均有非常显著性差异(χ2分别为17.28和21.48，P<0.01)，而非白癜风患者组与健康人组之间的差异无显著性(χ2=2.30，P>0.05)。
用白癜风患者的阳性血清对食道癌细胞(Eca109)进行免疫组化染色，未见细胞出现棕褐色着色(图1C)。非白癜风患者组的三份阳性血清均使对照细胞出现着色。白癜风患者组的部分阳性血清尚经间接免疫荧光检查，结果与免疫组化一致：黑素瘤细胞胞浆呈均一荧光(图1D)。
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三、讨论
大量的临床观察表明，在黑素瘤患者中，白癜风的发病率远高于普通人群；而恶性黑素瘤继发白癜风的患者往往预后较好。Bystryn[5]认为白癜风是对黑素瘤的一种天然免疫。本研究观察到，20例白癜风患者中有13例患者血清使黑素瘤细胞的免疫组化染色呈阳性，阳性率为65%，证明白癜风患者体内存在着抗黑素瘤细胞抗体。该组抗体与白癜风抗黑素细胞自身抗体是否属同一组抗体，有待进一步研究。
白癜风患者组阳性血清不与食道癌细胞反应，说明它们与黑素瘤细胞的结合是特异的。与此相反，非白癜风患者组的三份阳性血清与黑素瘤细胞的反应是非特异的，因为它们同时也与食道癌细胞反应。本研究观察到的阳性血清均使黑素瘤细胞浆呈比较均一的着色，在间接免疫荧光中使细胞浆呈均一荧光，提示阳性血清所识别的抗原位于黑素瘤细胞胞浆，但不排除同时位于细胞浆和细胞表面的情况。白癜风患者体内存在着能与黑素瘤细胞特异结合的IgG抗体，说明其对黑素瘤具有一定的特异性体液免疫力，支持Bystryn的观点[5]。如何利用这种免疫力以对抗黑素瘤，是值得今后探讨的问题。
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图1 细胞涂片的免疫组化和
免疫荧光结果(×400)
志谢 本研究在收集血清时得到了西京医院皮肤科关鹏举教授、高天文副教授等的大力协助。病理教研室王伯教授、叶苓博士为免疫组化工作提供了具体指导
参 考 文 献
1 Naughton GK, Eisinger M, Bystryn JC. Detection of antibodies to melanocytes in vitiligo by specific immunoprecipitation. J Invest Dermatol, 1983,81∶540-542.
2 毕志刚, Soltunia K, Saunders J, 等. 白癜风患者血清中抗黑素细胞自身抗体的研究. 中华皮肤科杂志, 1991,24∶154-156.
, 百拇医药
3 Norris DA, Kissinger RM, Naughton GM, et al. Evidence for immunologic mechanisms in human vitiligo: patients′ sera induce damage to human melanocytes invitro by complement-mediated damage and antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Invest Dermatol, 1988,90∶783-789.
4 Gilhar A, Zelickson B, Ulman Y, et al. In vivo destruction of melanocytes by the IgG fraction of serum from patients with vitiligo. J Invest Dermatol, 1995,105∶683-686.
5 Bystryn JJ. Serum antibodies in vitiligo patients. Clin Dermatol, 1989,7∶136-138.
(收稿：1997-09-04 修回：1997-12-08), 百拇医药