培养人角朊细胞中白介素15的基因表达
作者：韩钢文 岩月氏 马圣清 金子史男
单位：100034 北京医科大学第一医院皮肤科(韩钢文 马圣清)；日本福岛医科大学皮肤科(岩月氏 金子史男)
关键词：角蛋白细胞；白细胞介素15；印迹法，RNA
中华皮肤科杂志/980410 【摘要】 目的 为了探讨白介素15(IL-15)在表皮角朊细胞中的表达及调节。方法 应用RT-PCR及Northern杂交方法分析了IL-15在培养的人角朊细胞及鳞状细胞癌细胞系(HSC-5)中的表达，并观察了地塞米松对角朊细胞表达IL-15的影响。结果 正常角朊细胞及鳞状细胞癌细胞系细胞均有IL-15 mRNA的表达，10-6mol/L地塞米松处理培养的角朊细胞后，IL-15 mRNA表达水平明显降低。结论 表皮细胞来源的IL-15可能介入某些炎症性皮肤病的发病过程。
, 百拇医药 The Expression of IL-15 mRNA in Cultured Human Keratinocytes Han Gangwen, Keiji Iwatsuki, Ma Shengqing, et al. Department of Dermatology, First Teaching Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To study the expression and regulation ofinterleukin-15 (IL-15) in epidermal keratinocytes. Methods The expressionof IL-15 mRNA in cultured normal human keratinocytes (NHKs) and human squamouscell carcinoma cell line (HSC-5) was analysed, and the effect of dexamethasone on IL-15 mRNA expression was studied by using RT-PCR and Northern blotting technique. Results The results showed that both NHKs andHSC-5 expressed IL-15 constitutively. The level of IL-15 mRNA was significantly decreased after the cells were cultured with 10-6M dexamethasone. Conclusion It is suggested that keratinocyte-derived IL-15 might be involved in the development of certain inflammatory skin diseases.
, 百拇医药
【Key Words】 Keratinocytes Interleukin-15 Blotting, Northern
白介素15(IL-15)是1994年由Grabstein等[1]命名的细胞因子，分子量为14 000。多种组织和细胞可产生IL-15，包括骨骼肌、胎盘、肝脏、肾脏及单核巨噬细胞、纤维细胞系及人嗜T淋巴细胞病毒-Ⅰ型(HTLV-Ⅰ)感染的T淋巴细胞，但目前认为活化的正常外周血T淋巴细胞不产生IL-15[1，2]。IL-15的作用系通过结合于IL-2受体(IL-2R)的β及γ亚单位而介导的，因而IL-15的主要生物学功能类似于IL-2，如促进活化T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、肿瘤区浸润的T细胞及B细胞的生长与分化[1，3～5]。最近有报道表皮细胞可产生IL-15，而表皮内T淋巴细胞浸润是许多炎症性皮肤病及皮肤T细胞淋巴瘤的重要特征，尤其是近年来研究发现表皮内浸润的T淋巴细胞及其衍生的细胞因子可能在某些皮肤病如银屑病等的发病机制中占有重要作用，因而设想皮肤内IL-15可能通过T细胞作用而介入某些皮肤病的发病。为了探讨IL-15在表皮角朊细胞中的表达及调节，我们应用RT-PCR及Northern杂交方法对IL-15在培养正常人角朊细胞及鳞状细胞癌细胞系细胞中的表达及地塞米松对IL-15表达的影响进行了初步探讨。
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材料和方法
一、细胞培养
正常人角朊细胞：取正常成人或流产胎儿前臂屈侧皮肤，参照Mohamadzadeh等[6]的方法进行正常人角朊细胞制备与培养。培养基选用角朊细胞生长培养基(KGM, Clonetics Co, USA)，第三、四代细胞用于本试验。
人鳞状细胞癌细胞系：HSC-5(日本山形医科大学皮肤科赠送)，维持培养在5%胎牛血清的DMEM培养基中。
地塞米松处理：处于融合状态的培养细胞，HSC-5及正常人角朊细胞，PBS洗涤2次，分别再培养于含有或不含有10-6mol/L地塞米松的DMEM(不含胎牛血清)或KGM中24小时，收集细胞并保存于-80℃。
二、RT-PCR及探针制备
, 百拇医药
mRNA提取及cDNA制备分别应用美国Invitrogen公司生产的试剂盒进行。常规方法扩增IL-15及β-肌动蛋白。50μl反应体系含10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.1mg/ml明胶，dATP、dGTP、dTTP及dCTP各200μmol/L，正、反义引物各50pmol/L，1.25单位Taq DNA聚合酶，cDNA 1μl。PCR反应条件：预变性94℃ 5分钟，继之进入35个反应循环，包括62℃ 45秒、72℃ 90秒及94℃ 45秒。以PCR产物为模板或直接从cDNA，应用聚合酶链反应Dig-dUTP掺入法制备IL-15及β-肌动蛋白探针[7]。PCR产物及探针经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。实验所用引物序列：IL-15：sense5′CAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAG3′，antisense 5′TTCTAAGAGTTCATCTGATCCAAGG3′，β-肌动蛋白：sense 5′TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCT
, 百拇医药
A3′，antisense 5′CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGA
TGGAGGG3′。
三、Northern杂交
采用异硫氰酸胍-酚-氯仿法从约107细胞中提取总RNA，进一步应用Oligotex-30(Roche Co，日本)制备出mRNA。2μg mRNA或20μg总RNA进行1%琼脂糖凝胶甲醛变性电泳，总RNA条带从凝胶上切下，1%溴化乙锭溶液浸泡一小时，紫外灯下标记28s及18s rRNA泳动位置。剩余部分凝胶在20×SSC条件下将RNA转移至尼龙膜上(20小时)，120℃烤膜30分钟。杂交及信号显示按先前的报道进行[7]。简言之：尼龙膜预杂交4小时后，加入1μl/ml PCR法制备的Dig标记IL-15探针，42℃过夜，膜经1%脱脂奶封闭后，与1∶10 000羊抗Dig-碱性磷酸酶结合物反应30分钟，化学发光法显示杂交信号。杂交后的转移膜经洗去IL-15探针重新用于β-肌动蛋白mRNA的分析。其方法为：首先将膜用蒸馏水浸湿，然后浸泡于含50%二甲基甲酰胺，1% SDS及50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液中68℃ 30分钟，共两次，分别用水及2×SSC洗涤后，从预杂交步骤开始进行β-肌动蛋白mRNA分析。
, 百拇医药
结 果
一、正常人角朊细胞和HSC-5中IL-15 mRNA的表达
以培养正常人角朊细胞或HSC-5为来源制备的cDNA，PCR均能扩增出一357bp片段产物，与来源于正常人外周血粘附单核细胞及HTLV-1感染的成人T细胞白血病细胞系细胞的扩增片段一致(图1)。mRNA与Dig标记的IL-15探针进行Northern杂交，在略小于18s rRNA位置处显示一清晰条带(图2)。
二、地塞米松对表皮角朊细胞IL-15 mRNA表达的影响
为观察地塞米松是否影响表皮细胞IL-15的表达，处于融合状态的正常人角朊细胞和HSC-5细胞与含10-6mol/L地塞米松的培养基培养24小时后，分别用Northern杂交检测同一样本来源的IL-15及β-肌动蛋白mRNA，并与未经地塞米松处理的细胞中IL-15 mRNA的表达进行比较，结果显示：在正常人角朊细胞中IL-15的表达水平明显降低，而HSC-5中IL-15 mRNA表达几乎完全被抑制(图3)。
, 百拇医药
图1 RT-PCR产物及探针2%琼脂糖凝胶电泳结果
图2 Northern杂交结果
图3 地塞米松对正常人角朊细胞(A)及HSC-5(B)表达
IL-15 mRNA的影响
讨 论
表皮角朊细胞不表达IL-2，但是否产生IL-15文献曾有不同报道。Blauvelt等[8]应用RT-PCR方法分别检测了分离纯化的表皮皮片、郎格罕细胞、培养的正常人角朊细胞及角朊细胞系(HaCaT细胞)中IL-15 mRNA的表达，结果表明IL-15 mRNA存在于所有的受检标本中。进一步应用PCR产物与IL-15探针进行液相杂交、电泳、半定量分析IL-15 mRNA的表达水平，发现B波紫外线(UVB)照射可抑制培养正常人角朊细胞中IL-15的表达。然而Mohamadzadeh等[6]的结果与此相反，认为正常表皮不表达IL-15而UVB可诱导其产生。目前尚难对此作出合理的解释。本实验RT-PCR及Northern杂交结果均证明正常人角朊细胞及HSC-5在无任何刺激的条件下表达IL-15。Sorel等[9]应用免疫组化及原位杂交技术检测到正常皮肤表皮中有IL-15蛋白及mRNA的表达，因而我们认为IL-15为存在于正常皮肤角朊细胞中的细胞因子之一。
, 百拇医药
皮质类固醇激素是治疗免疫及炎症性皮肤病的有效药物，可抑制角朊细胞中的IL-1及IL-6的产生，这曾被认为是皮质类固醇激素(尤其局部应用时)的抗炎机制之一。另外，McInnes等[10]研究认为IL-15通过选择性的趋化及活化T淋巴细胞(而非单核细胞及B细胞)而在类风湿性关节炎的发病中具有一定作用。本实验显示药理剂量(10-5～10-7mol/L)的地塞米松可抑制表皮细胞IL-15 mRNA的表达，间接提示角朊细胞来源的IL-15可能是与某些炎症性皮肤病发病机制相关的一种细胞因子。进一步直接验证这一假说将是很有意义的研究课题。
参 考 文 献
1 Grabstein KH, Eisenman J, Shanebeck K, et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the β chain of the interleukin-2 receptor. Science, 1994,264∶965-968.
, 百拇医药
2 Bamford RN, Battiata AP, Borton JD, et al. Interleukin (IL)15/IL-T productionby the adult T-cell leukemia cell line HuT-102 is associated with a human T-cell lymphotrophic virus type ⅠR region/IL-15 fusion message that lacks many upstream AUGs that normally attenuate IL-15 mRNA translation. Proc Natl Acad SciUSA, 1996,93∶2897-2902.
3 Carson WE, Giri JG, Lindemann MJ, et al. Interleukin (IL)15 isa novel cytokinethat activates human natural killer cells via components of the IL-2 receptor.J Exp Med, 1994,180∶1395-1403.
, http://www.100md.com
4 Lewko WM, Smith TL, Bowman DJ, et al. Interleukin-15 and the growth oftumor-dervied activated T-cells. Cancer Biother, 1995,10∶13-20.
5 Armitage RJ, MacDuff BM, Eisenman J, et al. IL-15 has stimulatory activity forthe induction of B cell proliferation and differentiation. J Immunol, 1995,154∶483-490.
6 Mohamadzadeh M, Takashima A, Dougherty I, et al. Ultraviolet Bradiation up-regulates the expression of IL-15 in human skin. J Immunol, 1995,155∶4492-4496.
, 百拇医药
7 韩钢文, 周立军, 马圣清, 等. 聚合酶链反应Dig-dUTP掺入法制备桥粒芯蛋白1、3型探针. 中华皮肤科杂志, 1997,30∶248-250.
8 Blauvelt A, Asada H, Klaus-Kovtun V, et al. Interleukin-15 mRNA is expressedby human keratinocytes, Langerhans cells, and blood-derived dendritic cells andis downregulated by ultraviolet B radiation. J Invest Dermatol, 1996,106∶1047-1052.
9 Sorel M, Cherel M, Dreno B, et al. Production of interleukin-15 by human keratinocytes. Eur J Dermatol, 1996,6∶209-212.
10 McInnes IB, Al-Mughales J, Field M, et al. The role of interleukin-15 in T-cell migration and activation in rheumatoid arthritis. Nat Med, 1996,2∶175-182.
(收稿：1997-08-19 修回：1997-12-19), 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一医院皮肤科(韩钢文 马圣清)；日本福岛医科大学皮肤科(岩月氏 金子史男)
关键词：角蛋白细胞；白细胞介素15；印迹法，RNA
中华皮肤科杂志/980410 【摘要】 目的 为了探讨白介素15(IL-15)在表皮角朊细胞中的表达及调节。方法 应用RT-PCR及Northern杂交方法分析了IL-15在培养的人角朊细胞及鳞状细胞癌细胞系(HSC-5)中的表达，并观察了地塞米松对角朊细胞表达IL-15的影响。结果 正常角朊细胞及鳞状细胞癌细胞系细胞均有IL-15 mRNA的表达，10-6mol/L地塞米松处理培养的角朊细胞后，IL-15 mRNA表达水平明显降低。结论 表皮细胞来源的IL-15可能介入某些炎症性皮肤病的发病过程。
, 百拇医药 The Expression of IL-15 mRNA in Cultured Human Keratinocytes Han Gangwen, Keiji Iwatsuki, Ma Shengqing, et al. Department of Dermatology, First Teaching Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To study the expression and regulation ofinterleukin-15 (IL-15) in epidermal keratinocytes. Methods The expressionof IL-15 mRNA in cultured normal human keratinocytes (NHKs) and human squamouscell carcinoma cell line (HSC-5) was analysed, and the effect of dexamethasone on IL-15 mRNA expression was studied by using RT-PCR and Northern blotting technique. Results The results showed that both NHKs andHSC-5 expressed IL-15 constitutively. The level of IL-15 mRNA was significantly decreased after the cells were cultured with 10-6M dexamethasone. Conclusion It is suggested that keratinocyte-derived IL-15 might be involved in the development of certain inflammatory skin diseases.
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【Key Words】 Keratinocytes Interleukin-15 Blotting, Northern
白介素15(IL-15)是1994年由Grabstein等[1]命名的细胞因子，分子量为14 000。多种组织和细胞可产生IL-15，包括骨骼肌、胎盘、肝脏、肾脏及单核巨噬细胞、纤维细胞系及人嗜T淋巴细胞病毒-Ⅰ型(HTLV-Ⅰ)感染的T淋巴细胞，但目前认为活化的正常外周血T淋巴细胞不产生IL-15[1，2]。IL-15的作用系通过结合于IL-2受体(IL-2R)的β及γ亚单位而介导的，因而IL-15的主要生物学功能类似于IL-2，如促进活化T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、肿瘤区浸润的T细胞及B细胞的生长与分化[1，3～5]。最近有报道表皮细胞可产生IL-15，而表皮内T淋巴细胞浸润是许多炎症性皮肤病及皮肤T细胞淋巴瘤的重要特征，尤其是近年来研究发现表皮内浸润的T淋巴细胞及其衍生的细胞因子可能在某些皮肤病如银屑病等的发病机制中占有重要作用，因而设想皮肤内IL-15可能通过T细胞作用而介入某些皮肤病的发病。为了探讨IL-15在表皮角朊细胞中的表达及调节，我们应用RT-PCR及Northern杂交方法对IL-15在培养正常人角朊细胞及鳞状细胞癌细胞系细胞中的表达及地塞米松对IL-15表达的影响进行了初步探讨。
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材料和方法
一、细胞培养
正常人角朊细胞：取正常成人或流产胎儿前臂屈侧皮肤，参照Mohamadzadeh等[6]的方法进行正常人角朊细胞制备与培养。培养基选用角朊细胞生长培养基(KGM, Clonetics Co, USA)，第三、四代细胞用于本试验。
人鳞状细胞癌细胞系：HSC-5(日本山形医科大学皮肤科赠送)，维持培养在5%胎牛血清的DMEM培养基中。
地塞米松处理：处于融合状态的培养细胞，HSC-5及正常人角朊细胞，PBS洗涤2次，分别再培养于含有或不含有10-6mol/L地塞米松的DMEM(不含胎牛血清)或KGM中24小时，收集细胞并保存于-80℃。
二、RT-PCR及探针制备
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mRNA提取及cDNA制备分别应用美国Invitrogen公司生产的试剂盒进行。常规方法扩增IL-15及β-肌动蛋白。50μl反应体系含10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.1mg/ml明胶，dATP、dGTP、dTTP及dCTP各200μmol/L，正、反义引物各50pmol/L，1.25单位Taq DNA聚合酶，cDNA 1μl。PCR反应条件：预变性94℃ 5分钟，继之进入35个反应循环，包括62℃ 45秒、72℃ 90秒及94℃ 45秒。以PCR产物为模板或直接从cDNA，应用聚合酶链反应Dig-dUTP掺入法制备IL-15及β-肌动蛋白探针[7]。PCR产物及探针经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。实验所用引物序列：IL-15：sense5′CAAGTTATTTCACTTGAGTCCGGAG3′，antisense 5′TTCTAAGAGTTCATCTGATCCAAGG3′，β-肌动蛋白：sense 5′TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCT
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A3′，antisense 5′CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGA
TGGAGGG3′。
三、Northern杂交
采用异硫氰酸胍-酚-氯仿法从约107细胞中提取总RNA，进一步应用Oligotex-30(Roche Co，日本)制备出mRNA。2μg mRNA或20μg总RNA进行1%琼脂糖凝胶甲醛变性电泳，总RNA条带从凝胶上切下，1%溴化乙锭溶液浸泡一小时，紫外灯下标记28s及18s rRNA泳动位置。剩余部分凝胶在20×SSC条件下将RNA转移至尼龙膜上(20小时)，120℃烤膜30分钟。杂交及信号显示按先前的报道进行[7]。简言之：尼龙膜预杂交4小时后，加入1μl/ml PCR法制备的Dig标记IL-15探针，42℃过夜，膜经1%脱脂奶封闭后，与1∶10 000羊抗Dig-碱性磷酸酶结合物反应30分钟，化学发光法显示杂交信号。杂交后的转移膜经洗去IL-15探针重新用于β-肌动蛋白mRNA的分析。其方法为：首先将膜用蒸馏水浸湿，然后浸泡于含50%二甲基甲酰胺，1% SDS及50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液中68℃ 30分钟，共两次，分别用水及2×SSC洗涤后，从预杂交步骤开始进行β-肌动蛋白mRNA分析。
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结 果
一、正常人角朊细胞和HSC-5中IL-15 mRNA的表达
以培养正常人角朊细胞或HSC-5为来源制备的cDNA，PCR均能扩增出一357bp片段产物，与来源于正常人外周血粘附单核细胞及HTLV-1感染的成人T细胞白血病细胞系细胞的扩增片段一致(图1)。mRNA与Dig标记的IL-15探针进行Northern杂交，在略小于18s rRNA位置处显示一清晰条带(图2)。
二、地塞米松对表皮角朊细胞IL-15 mRNA表达的影响
为观察地塞米松是否影响表皮细胞IL-15的表达，处于融合状态的正常人角朊细胞和HSC-5细胞与含10-6mol/L地塞米松的培养基培养24小时后，分别用Northern杂交检测同一样本来源的IL-15及β-肌动蛋白mRNA，并与未经地塞米松处理的细胞中IL-15 mRNA的表达进行比较，结果显示：在正常人角朊细胞中IL-15的表达水平明显降低，而HSC-5中IL-15 mRNA表达几乎完全被抑制(图3)。
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图1 RT-PCR产物及探针2%琼脂糖凝胶电泳结果
图2 Northern杂交结果
图3 地塞米松对正常人角朊细胞(A)及HSC-5(B)表达
IL-15 mRNA的影响
讨 论
表皮角朊细胞不表达IL-2，但是否产生IL-15文献曾有不同报道。Blauvelt等[8]应用RT-PCR方法分别检测了分离纯化的表皮皮片、郎格罕细胞、培养的正常人角朊细胞及角朊细胞系(HaCaT细胞)中IL-15 mRNA的表达，结果表明IL-15 mRNA存在于所有的受检标本中。进一步应用PCR产物与IL-15探针进行液相杂交、电泳、半定量分析IL-15 mRNA的表达水平，发现B波紫外线(UVB)照射可抑制培养正常人角朊细胞中IL-15的表达。然而Mohamadzadeh等[6]的结果与此相反，认为正常表皮不表达IL-15而UVB可诱导其产生。目前尚难对此作出合理的解释。本实验RT-PCR及Northern杂交结果均证明正常人角朊细胞及HSC-5在无任何刺激的条件下表达IL-15。Sorel等[9]应用免疫组化及原位杂交技术检测到正常皮肤表皮中有IL-15蛋白及mRNA的表达，因而我们认为IL-15为存在于正常皮肤角朊细胞中的细胞因子之一。
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皮质类固醇激素是治疗免疫及炎症性皮肤病的有效药物，可抑制角朊细胞中的IL-1及IL-6的产生，这曾被认为是皮质类固醇激素(尤其局部应用时)的抗炎机制之一。另外，McInnes等[10]研究认为IL-15通过选择性的趋化及活化T淋巴细胞(而非单核细胞及B细胞)而在类风湿性关节炎的发病中具有一定作用。本实验显示药理剂量(10-5～10-7mol/L)的地塞米松可抑制表皮细胞IL-15 mRNA的表达，间接提示角朊细胞来源的IL-15可能是与某些炎症性皮肤病发病机制相关的一种细胞因子。进一步直接验证这一假说将是很有意义的研究课题。
参 考 文 献
1 Grabstein KH, Eisenman J, Shanebeck K, et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the β chain of the interleukin-2 receptor. Science, 1994,264∶965-968.
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2 Bamford RN, Battiata AP, Borton JD, et al. Interleukin (IL)15/IL-T productionby the adult T-cell leukemia cell line HuT-102 is associated with a human T-cell lymphotrophic virus type ⅠR region/IL-15 fusion message that lacks many upstream AUGs that normally attenuate IL-15 mRNA translation. Proc Natl Acad SciUSA, 1996,93∶2897-2902.
3 Carson WE, Giri JG, Lindemann MJ, et al. Interleukin (IL)15 isa novel cytokinethat activates human natural killer cells via components of the IL-2 receptor.J Exp Med, 1994,180∶1395-1403.
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4 Lewko WM, Smith TL, Bowman DJ, et al. Interleukin-15 and the growth oftumor-dervied activated T-cells. Cancer Biother, 1995,10∶13-20.
5 Armitage RJ, MacDuff BM, Eisenman J, et al. IL-15 has stimulatory activity forthe induction of B cell proliferation and differentiation. J Immunol, 1995,154∶483-490.
6 Mohamadzadeh M, Takashima A, Dougherty I, et al. Ultraviolet Bradiation up-regulates the expression of IL-15 in human skin. J Immunol, 1995,155∶4492-4496.
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7 韩钢文, 周立军, 马圣清, 等. 聚合酶链反应Dig-dUTP掺入法制备桥粒芯蛋白1、3型探针. 中华皮肤科杂志, 1997,30∶248-250.
8 Blauvelt A, Asada H, Klaus-Kovtun V, et al. Interleukin-15 mRNA is expressedby human keratinocytes, Langerhans cells, and blood-derived dendritic cells andis downregulated by ultraviolet B radiation. J Invest Dermatol, 1996,106∶1047-1052.
9 Sorel M, Cherel M, Dreno B, et al. Production of interleukin-15 by human keratinocytes. Eur J Dermatol, 1996,6∶209-212.
10 McInnes IB, Al-Mughales J, Field M, et al. The role of interleukin-15 in T-cell migration and activation in rheumatoid arthritis. Nat Med, 1996,2∶175-182.
(收稿：1997-08-19 修回：1997-12-19), 百拇医药