二步聚合酶链反应检测皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体基因重排
作者：丁铁钢 邱丙森 Jack Longley
单位：美国耶鲁大学医学院皮肤科(丁铁钢，Jack Longley)；上海医科大学皮肤病学研究所皮肤病理研究室(邱丙森)
关键词：聚合酶链反应；T细胞受体；基因重排；皮肤T细胞淋巴瘤
中华皮肤科杂志/980402 【摘要】 目的 应用二步聚合酶链反应(PCR)检测皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)的T细胞受体(TCR)基因重排，提高其准确性和特异性，并应用已知重排的cDNA序列，推测该病患者的特异肽链顺序，为免疫治疗提供新线索和途径。方法 先用TCR基因重排区域以外的部分为引物，做10～30个循环扩增。取得一定数量的cDNA，作为模板，再经30～40个循环扩增，获得较纯的cDNA。然后将此产物放入质粒，进一步分析DNA序列。按照分析结果，制备出特异的分子探针，对二步PCR扩增产物进行分子杂交，推测出患者的特异性肽链顺序。结果 以Vβ8为特殊引物所显示的反应带明显，用Vβ8顺序制成的分子探针杂交，示明显的特异性结合。特异性分子探针只与CTCL患者的cDNA杂交，与对照组标本不发生交叉反应。结论 二步PCR可准确地检测CTCL的TCR基因重排，其特异性强，并可在此基础上应用已知重排的cDNA序列推测该病患者的特异性肽链，为免疫治疗提供新线索和途径。
, 百拇医药
Two Step Polymerase Chain Reaction Detecting the T-Cell Receptor Gene Rearrangement in Cutaneous T-Cell Lymphoma Ding Tiegang*,Qiu Bingsen, Jack Longley. *Department of Dermatology, Medical College,Yale University, USA
【Abstract】 Objective A two step polymerase chain reaction (PCR) strategy was used to amplify copy DNAs corresponding to the special region of the T-cell receptor (TCR) β-chain. Methods and Results With this technique, a dominant TCR gene rearrangement that used the β8 variable region gene segment was identified in a patient with cuteneous T cell lymphoma and its sequence determined from multiple independently generated subclonal PCR products. An oligonucleotide corresponding to thehighly variable junctional region of the clonally expanded TCR gene rearrangement was synthesized and used for further confirming studies. Finally, from the sequence data obtained, a peptide corresponding to the β-chain junctional regionsequence of the patient′s clonally expanded T-cells was generated. Conclusion Preliminarystudies using this peptide indicate that it is antigenic and may potentially beuseful in developing a patient-specific tumour vaccine.
, 百拇医药
Key Words Polymerase chain reaction T-cell receptor Generearrangement Cutaneous T-cell lymphoma
T细胞在发生肿瘤的过程中，像B细胞的免疫球蛋白基因一样，也发生T细胞受体(TCR)基因重排[1]。研究TCR基因重排，可提供对皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)的起因、发病机理、早期诊断、监视病情和治疗的认识与依据。随着聚合酶链反应(PCR)技术的开展，为CTCL基因重排的研究开拓了新途径，但因标本的来源，特别是自从福尔马林固定、石蜡包埋的切片中提取的RNA或DNA的数量和质量均极受限，若以这样的标本进行PCR扩增，其产物难免不能出现较多、较重的背景反应，结果常难于分析。为此，我们应用二步PCR法检测一例CTCL患者的TCR基因重排，获得满意的效果。兹将结果报道如下。
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材料和方法
, 百拇医药
一、cDNA模板的制备
(一)标本来源：取自经美国耶鲁大学皮肤科组织病理、免疫组化和流式细胞仪测定并结合临床确诊为CTCL的一例男性、55岁、病期5年的患者静脉血，经肝素化后，作密度(Sigma, St Louis Mo)梯度离心，分离出白细胞，经PBS冲洗2次后，将细胞溶解于RNA制备液(4mol/L硫氰酸胍，2.5mmol/L枸橼酸钠，pH=7，0.5%十二烷基肌氨酸钠，0.1mol/L 2-巯基乙醇)中，用2×106～6×102细胞提取RNA[2]。
(二)cDNA的合成：将上述总RNA溶解于40nl cDNA合成液(10mmol/L Tris-HCl, pH=8.3，50mmol/L KCl，5.5mmol/L MgCl2，0.001%明胶，200μmol/L的dATP、dCTP、dGTA和dTTP)中，再加入10μl AMV逆转录酶(Boehringer Mannheim)。然后将标本置于PCR机(购自M.J.Research Inc Watertown, MA)中，在30℃ 30分钟、40℃ 30分钟和95℃ 5分钟条件下反应。最后，将产物置于4℃下备用。
, http://www.100md.com
二、应用二步PCR法扩增cDNA
为避免在PCR扩增时产生非特异性反应，分别选用29对不同的TCR特殊引物[3]，采用二步扩增上述标本(图1)。PCR的液体为：10mmol/L Tris-HCl(pH=8.3)，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.001%明胶，dNTP 200μmol/L。选用β-肌动蛋白引物5′-GTGG
GGCGCCCCAGGCACCA-3′和5′-CTCCTTAATGTCA
CGCACGATTTC-3′作为阳性对照。阴性对照则选用蒸馏水。
三、测定扩增后的cDNA
(一)将40%的PCR产物在95V、1.5%琼脂糖胶中进行电泳分离，然后将电泳后的cDNA转移至尼龙膜(Hylone-N+ 0.45μm核酸转移膜，Amersham公司)，将此膜于80℃下30分钟，再在紫外线下强化连接1分钟。
, 百拇医药
(二)应用图1中所示Cβ10引物为探针，进行3′端地高辛标记(传统系统标记试剂盒，Boehringer Mannheim)。然后将已转移有cDNA的膜进行杂交。其过程为：cDNA膜在预杂交液中[5×SSC，1.0%阻断剂(购自Boehringer Mannheim)，0.1% N-月桂基肌氨酸和0.02% SDS]中，于55℃下孵育6小时。将地高辛标记的Cβ10探针置入预杂交液中，于55℃下杂交9小时，然后用含有0.1% SDS的2×SSC，在室温下冲洗2次，每次15分钟，再在50℃下洗2次，然后经传统缓冲器1、2、3(购自Boehringer Mannheim)处理，曝光于柯达XOMAT胶片。
图1 用UVβ1和Cβ20为引物作第一步扩增，然后再用
不同的Vβ特殊引物作第二步扩增
四、CTCL患者特异性TCR分子探针的制备
, 百拇医药
(一)应用TA克隆系统(San Diego CA)所示的方法和材料，将二步PCR的产物进行克隆化。先将PCR的产物(cDNA)插入载体(vector)，再将含有PCR产物的这种载体转染入大肠杆菌进行增殖，然后提取出增殖的质粒[4]。
(二)将上述获得的含有cDNA质粒应用Version 2.0试剂盒(美国Biochemical Corporation,Cleveland, OH)与2-35S-dATP进行DNA序列分析[5，6]。
(三)按照上述序列分析结果，制备合成出该CTC
L患者特殊DNA顺序的探针。再用该探针对二次PCR扩增产物进行分子杂交，步骤和方法同二及三所述。
结 果
, 百拇医药 以Vβ8为特殊引物所得出的反应带明显。而选用β-肌动蛋白引物作为阳性对照和用蒸馏水作为阴性对照者则显示相应的阳性和阴性。应用Vβ8顺序制成的分子探针杂交，见明显特异的结合。将二步扩增后PCR产物亚克隆后进行DNA序列分析，按照其所读顺序制备出该患者特异的探针，并根据DNA顺序推算出基本氨基酸序列，即可推导出该患者特异的肽链(见图2)。利用此特殊探针再对二步扩增的PCR产物杂交，结果示特异探针只与该患者cDNA杂交而不与正常人和其它CTCL患者的cDNA发生交叉反应。
讨 论
尽管不少人已用PCR对CTCL的TCR Vβ做了多方面的研究[7]，但因单一步骤PCR可非特异性扩增而使得背景较重，致影响研究对象本身的特异性。我们采用二步PCR，即先用TCR基因重排区域以外的部分为引物，进行10～30个循环扩增，取得一定数量的cDNA后，将其作为模板，再经30～40个循环，获得较纯的cDNA。从本研究的结果看，可增加TCR基因重排的准确性和特异性。
, 百拇医药
图2 Vβ处可为Vβ8特异分子探针，AR处为cDNA顺序，经分析后能得出CTCL患者特异探针和按照cDNA推测出氨基酸序列
最近研究发现[3]，CTCL的TCR基因重排可能是随机发生的，可能以Vβ为特异性，也可能以Vα为标记，这就对统一选择CTCL患者的探针带来困难。因此，制备患者本身特异的分子探针则更有意义。利用这种特异的探针，对CTCL的早期诊断、监视病情和探讨发病机制均有价值。通过本研究，我们认为，应用具有抗原性的CTCL患者特异肽链，有潜能用于制作肿瘤特异性疫苗，为免疫治疗CTCL提供新线索和途径。
参 考 文 献
1 Plaza A, Kono DH, Theofilopoulos AN. New human Vβ genesand polymorphic variants. J Immunol, 1991,147∶4360-4365.
, http://www.100md.com
2 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analyt Biochem, 1987,162∶156-159.
3 Longley J, Tyrrell L, Lu SZ, et al. Malignant and normal T cells show random use of T cell receptor alpha chain variable regions in patients with cutaneous T cell lymphoma. J Invest Dermatol, 1995,105∶62-64.
4 Zhou C, Yang Y, Jong AY. Mini plasmid prep in ten minutes. Biotechniques, 1990,8∶172-173.
, http://www.100md.com
5 Kimura N, Toyonaga B, Yoshikai Y, et al. Sequences and repertoire of the human T cellreceptor α and β chain variable region genes in thymocytes. Eur J Immunol, 1987,17∶375-383.
6 Concannon P, Pickering LA, Kung P, et al. Diversity and structure of human T-cell receptor β chain variable region genes. Proc Natl Acad Sci USA, 1986,83∶6598-6602.
7 Choi Y, Kotzin B, Herron L, et al. Interaction of Staphylococcus aureus toxin“superantigens” with human T cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86∶8941-8945.
国家自然科学基金资助项目
(收稿：1997-08-13 修回：1997-12-24), 百拇医药
单位：美国耶鲁大学医学院皮肤科(丁铁钢，Jack Longley)；上海医科大学皮肤病学研究所皮肤病理研究室(邱丙森)
关键词：聚合酶链反应；T细胞受体；基因重排；皮肤T细胞淋巴瘤
中华皮肤科杂志/980402 【摘要】 目的 应用二步聚合酶链反应(PCR)检测皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)的T细胞受体(TCR)基因重排，提高其准确性和特异性，并应用已知重排的cDNA序列，推测该病患者的特异肽链顺序，为免疫治疗提供新线索和途径。方法 先用TCR基因重排区域以外的部分为引物，做10～30个循环扩增。取得一定数量的cDNA，作为模板，再经30～40个循环扩增，获得较纯的cDNA。然后将此产物放入质粒，进一步分析DNA序列。按照分析结果，制备出特异的分子探针，对二步PCR扩增产物进行分子杂交，推测出患者的特异性肽链顺序。结果 以Vβ8为特殊引物所显示的反应带明显，用Vβ8顺序制成的分子探针杂交，示明显的特异性结合。特异性分子探针只与CTCL患者的cDNA杂交，与对照组标本不发生交叉反应。结论 二步PCR可准确地检测CTCL的TCR基因重排，其特异性强，并可在此基础上应用已知重排的cDNA序列推测该病患者的特异性肽链，为免疫治疗提供新线索和途径。
, 百拇医药
Two Step Polymerase Chain Reaction Detecting the T-Cell Receptor Gene Rearrangement in Cutaneous T-Cell Lymphoma Ding Tiegang*,Qiu Bingsen, Jack Longley. *Department of Dermatology, Medical College,Yale University, USA
【Abstract】 Objective A two step polymerase chain reaction (PCR) strategy was used to amplify copy DNAs corresponding to the special region of the T-cell receptor (TCR) β-chain. Methods and Results With this technique, a dominant TCR gene rearrangement that used the β8 variable region gene segment was identified in a patient with cuteneous T cell lymphoma and its sequence determined from multiple independently generated subclonal PCR products. An oligonucleotide corresponding to thehighly variable junctional region of the clonally expanded TCR gene rearrangement was synthesized and used for further confirming studies. Finally, from the sequence data obtained, a peptide corresponding to the β-chain junctional regionsequence of the patient′s clonally expanded T-cells was generated. Conclusion Preliminarystudies using this peptide indicate that it is antigenic and may potentially beuseful in developing a patient-specific tumour vaccine.
, 百拇医药
Key Words Polymerase chain reaction T-cell receptor Generearrangement Cutaneous T-cell lymphoma
T细胞在发生肿瘤的过程中，像B细胞的免疫球蛋白基因一样，也发生T细胞受体(TCR)基因重排[1]。研究TCR基因重排，可提供对皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)的起因、发病机理、早期诊断、监视病情和治疗的认识与依据。随着聚合酶链反应(PCR)技术的开展，为CTCL基因重排的研究开拓了新途径，但因标本的来源，特别是自从福尔马林固定、石蜡包埋的切片中提取的RNA或DNA的数量和质量均极受限，若以这样的标本进行PCR扩增，其产物难免不能出现较多、较重的背景反应，结果常难于分析。为此，我们应用二步PCR法检测一例CTCL患者的TCR基因重排，获得满意的效果。兹将结果报道如下。
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材料和方法
, 百拇医药
一、cDNA模板的制备
(一)标本来源：取自经美国耶鲁大学皮肤科组织病理、免疫组化和流式细胞仪测定并结合临床确诊为CTCL的一例男性、55岁、病期5年的患者静脉血，经肝素化后，作密度(Sigma, St Louis Mo)梯度离心，分离出白细胞，经PBS冲洗2次后，将细胞溶解于RNA制备液(4mol/L硫氰酸胍，2.5mmol/L枸橼酸钠，pH=7，0.5%十二烷基肌氨酸钠，0.1mol/L 2-巯基乙醇)中，用2×106～6×102细胞提取RNA[2]。
(二)cDNA的合成：将上述总RNA溶解于40nl cDNA合成液(10mmol/L Tris-HCl, pH=8.3，50mmol/L KCl，5.5mmol/L MgCl2，0.001%明胶，200μmol/L的dATP、dCTP、dGTA和dTTP)中，再加入10μl AMV逆转录酶(Boehringer Mannheim)。然后将标本置于PCR机(购自M.J.Research Inc Watertown, MA)中，在30℃ 30分钟、40℃ 30分钟和95℃ 5分钟条件下反应。最后，将产物置于4℃下备用。
, http://www.100md.com
二、应用二步PCR法扩增cDNA
为避免在PCR扩增时产生非特异性反应，分别选用29对不同的TCR特殊引物[3]，采用二步扩增上述标本(图1)。PCR的液体为：10mmol/L Tris-HCl(pH=8.3)，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.001%明胶，dNTP 200μmol/L。选用β-肌动蛋白引物5′-GTGG
GGCGCCCCAGGCACCA-3′和5′-CTCCTTAATGTCA
CGCACGATTTC-3′作为阳性对照。阴性对照则选用蒸馏水。
三、测定扩增后的cDNA
(一)将40%的PCR产物在95V、1.5%琼脂糖胶中进行电泳分离，然后将电泳后的cDNA转移至尼龙膜(Hylone-N+ 0.45μm核酸转移膜，Amersham公司)，将此膜于80℃下30分钟，再在紫外线下强化连接1分钟。
, 百拇医药
(二)应用图1中所示Cβ10引物为探针，进行3′端地高辛标记(传统系统标记试剂盒，Boehringer Mannheim)。然后将已转移有cDNA的膜进行杂交。其过程为：cDNA膜在预杂交液中[5×SSC，1.0%阻断剂(购自Boehringer Mannheim)，0.1% N-月桂基肌氨酸和0.02% SDS]中，于55℃下孵育6小时。将地高辛标记的Cβ10探针置入预杂交液中，于55℃下杂交9小时，然后用含有0.1% SDS的2×SSC，在室温下冲洗2次，每次15分钟，再在50℃下洗2次，然后经传统缓冲器1、2、3(购自Boehringer Mannheim)处理，曝光于柯达XOMAT胶片。
图1 用UVβ1和Cβ20为引物作第一步扩增，然后再用
不同的Vβ特殊引物作第二步扩增
四、CTCL患者特异性TCR分子探针的制备
, 百拇医药
(一)应用TA克隆系统(San Diego CA)所示的方法和材料，将二步PCR的产物进行克隆化。先将PCR的产物(cDNA)插入载体(vector)，再将含有PCR产物的这种载体转染入大肠杆菌进行增殖，然后提取出增殖的质粒[4]。
(二)将上述获得的含有cDNA质粒应用Version 2.0试剂盒(美国Biochemical Corporation,Cleveland, OH)与2-35S-dATP进行DNA序列分析[5，6]。
(三)按照上述序列分析结果，制备合成出该CTC
L患者特殊DNA顺序的探针。再用该探针对二次PCR扩增产物进行分子杂交，步骤和方法同二及三所述。
结 果
, 百拇医药 以Vβ8为特殊引物所得出的反应带明显。而选用β-肌动蛋白引物作为阳性对照和用蒸馏水作为阴性对照者则显示相应的阳性和阴性。应用Vβ8顺序制成的分子探针杂交，见明显特异的结合。将二步扩增后PCR产物亚克隆后进行DNA序列分析，按照其所读顺序制备出该患者特异的探针，并根据DNA顺序推算出基本氨基酸序列，即可推导出该患者特异的肽链(见图2)。利用此特殊探针再对二步扩增的PCR产物杂交，结果示特异探针只与该患者cDNA杂交而不与正常人和其它CTCL患者的cDNA发生交叉反应。
讨 论
尽管不少人已用PCR对CTCL的TCR Vβ做了多方面的研究[7]，但因单一步骤PCR可非特异性扩增而使得背景较重，致影响研究对象本身的特异性。我们采用二步PCR，即先用TCR基因重排区域以外的部分为引物，进行10～30个循环扩增，取得一定数量的cDNA后，将其作为模板，再经30～40个循环，获得较纯的cDNA。从本研究的结果看，可增加TCR基因重排的准确性和特异性。
, 百拇医药
图2 Vβ处可为Vβ8特异分子探针，AR处为cDNA顺序，经分析后能得出CTCL患者特异探针和按照cDNA推测出氨基酸序列
最近研究发现[3]，CTCL的TCR基因重排可能是随机发生的，可能以Vβ为特异性，也可能以Vα为标记，这就对统一选择CTCL患者的探针带来困难。因此，制备患者本身特异的分子探针则更有意义。利用这种特异的探针，对CTCL的早期诊断、监视病情和探讨发病机制均有价值。通过本研究，我们认为，应用具有抗原性的CTCL患者特异肽链，有潜能用于制作肿瘤特异性疫苗，为免疫治疗CTCL提供新线索和途径。
参 考 文 献
1 Plaza A, Kono DH, Theofilopoulos AN. New human Vβ genesand polymorphic variants. J Immunol, 1991,147∶4360-4365.
, http://www.100md.com
2 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analyt Biochem, 1987,162∶156-159.
3 Longley J, Tyrrell L, Lu SZ, et al. Malignant and normal T cells show random use of T cell receptor alpha chain variable regions in patients with cutaneous T cell lymphoma. J Invest Dermatol, 1995,105∶62-64.
4 Zhou C, Yang Y, Jong AY. Mini plasmid prep in ten minutes. Biotechniques, 1990,8∶172-173.
, http://www.100md.com
5 Kimura N, Toyonaga B, Yoshikai Y, et al. Sequences and repertoire of the human T cellreceptor α and β chain variable region genes in thymocytes. Eur J Immunol, 1987,17∶375-383.
6 Concannon P, Pickering LA, Kung P, et al. Diversity and structure of human T-cell receptor β chain variable region genes. Proc Natl Acad Sci USA, 1986,83∶6598-6602.
7 Choi Y, Kotzin B, Herron L, et al. Interaction of Staphylococcus aureus toxin“superantigens” with human T cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86∶8941-8945.
国家自然科学基金资助项目
(收稿：1997-08-13 修回：1997-12-24), 百拇医药