真皮替代物培养模型的建立
作者：伍津津 刘荣卿 叶庆佾 唐书谦 钟白玉
单位：400038重庆，第三军医大学西南医院皮肤科[伍津津(现在第三军医大学大坪医院野战外科研究所皮肤科) 刘荣卿 叶庆佾 唐书谦 钟白玉]
关键词：
中华皮肤科杂志/980423 真皮替代物和活性皮肤替代物的三维培养模型，对研究细胞的生长、分化、增生及真表皮间的相互作用有重要意义，也是研制大面积创面覆盖物——复合皮的一条重要途径[1]。
一、材料与方法
1.胶原：实验所用胶原为酸溶性鼠尾胶原，参照文献[2]的方法稍有改良进行提取，并用751紫外分光光度计测蛋白浓度为1.0～1.5mg/ml。
, http://www.100md.com 2.包皮成纤维细胞培养：应用组织块培养法进行正常包皮成纤维细胞原代培养。培养基为10%新生牛血清DMEM，每3天换液1次。3～4周后原代培养细胞生长成细胞单层，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3的比例分种细胞传代培养，每3天用含10%新生牛血清的DMEM换液1次。实验用第5～12代细胞。
3.细胞胶原凝胶的制作：
①将第5～12代处于指数生长期的包皮成纤维细胞分别用0.25%胰蛋白酶消化后制成悬液，计数，调整细胞悬液浓度为1.5×105个细胞/ml，取4ml细胞悬液离心，弃培养基，加入新生牛血清0.5ml。
②吸4ml鼠尾胶原溶液放入冰浴中的青霉素小瓶中，加入0.5ml浓缩10倍的DMEM培养基，及时混匀，平衡温度后加入0.1ml 1N NaOH以中和醋酸，快速混匀，确定pH为7.4左右后立即加入新生牛血清细胞悬液，快速混合，然后吸到24孔板中，每孔加0.8ml，共6孔；静置10分钟内便很快形成细胞凝胶，加入10%新生牛血清DMEM培养基进行培养，每周换液2次。试验重复3次。每日观察细胞
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的形态和收缩情况。
4.组织学检查：细胞凝胶块培养1～3周后进行组织学检查，用Bouin液固定24小时，常规组织切片，切片4μm厚，HE染色，镜下观察。
二、结果
(一)细胞的形态与分布：成纤维细胞胶原凝胶形成后呈半透明状态，随着细胞密度的增加，透明度稍降低，其质地与颜色近似真皮组织，有一定的弹性和抗拉性，不易碎，因此凝胶可以被握持搬动。当凝胶与培养皿壁分离后则凝胶块收缩如圆盘状飘浮在培养基的液面下，在倒置显微镜下可清楚地看到凝胶中各个层次的细胞及形态。接种后成纤维细胞在凝胶中的位置是相对固定的，并不象在普通培养基中那样迅速贴壁，说明此时成纤维细胞已经粘附在胶原支架上，约2小时后经胰酶消化后呈圆形的成纤维细胞表面逐渐伸展延长，形成2个以上的胞质突起，有的似星状，表明成纤维细胞已存活生长，开始与胶原发生粘着。随着培养天数的增加，这些突起在细胞的两极逐渐伸展延长，但突起数目逐渐减少，最后在细胞的两极形成两个较长的突起而成梭形。而且随着细胞凝胶的收缩，平行排列的细胞变得愈加致密，有时互相交织呈网络状。当细胞密度达到其极限后(大约培养2～3周后)，成纤维细胞可以象组织块中的成纤维细胞一样从胶原凝胶中迁出，导致细胞凝胶的贴壁生长。而细胞凝胶块可以一直培养3个月以上。
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(二)组织切片：培养2周后细胞凝胶做组织切片观察发现胶原呈较均一的淡红色，而成纤维细胞均匀地分布于胶原中，呈梭形，大多数细胞有的两极为两个较长的突起，极少数细胞有较多的突起，细胞较小，胞核呈椭圆形，胞浆少。
三、讨论
鼠尾胶原在结构和抗原性方面与人体组织的Ⅰ型胶原基本相同，它来源广泛，成分较为单一，制备比较方便，所以我们选用它作培养支架。我们的研究结果显示成纤维细胞在该胶原基质中能较长时间地保持活力，表明Ⅰ型胶原对这类成纤维细胞的生存具有良好的支持作用。
培养好的细胞凝胶称之为真皮替代物或类似物，是进行皮肤器官型培养和制作复合皮的关键与基础，因而操作者除了有过硬的无菌技术外，还要有灵巧的操作技术，我们的体会是：①真皮成纤维细胞、胶原和NaOH的比例一定要合适。NaOH中和胶原中的醋酸，使其达到正确的pH值(7.4)左右，细胞才不致于死亡，并有很好的生长活力。②胶原溶液应预置于0℃冰浴中。在常温下NaOH中和胶原醋酸溶液后在2分钟内便形成了凝胶，给混合细胞带来了困难，而预置于冰浴中便能显著延缓凝胶的形成时间。一般先将胶原溶液预置于冰浴中，加十倍浓缩培养基混合，然后去离心细胞，加新生牛血清混悬，再用NaOH快速中和混匀胶原，最后加入成纤维细胞悬液，这样便可将细胞均匀地混合于胶原凝胶中。③成纤维细胞的增生能力要强，应选择传代次数较少的处于指数生长期的细胞，而老化的细胞增生能力低，其收缩力差，制出的凝胶结构不紧密。④渗透压要在正常范围内，否则细胞不能存活。⑤胶原浓度不能过低，一般应在1mg/ml以上较好，形成的凝胶厚度较厚，有利于以后接种表皮细胞。
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参 考 文 献
1 Limat A, Breitkreutz D, Hunziker T, et al. Restoration of the epidermal phenotype by follicular outer root sheath cells in recombinant culture with dermal fibroblasts. Exp Cell Res, 1991,194∶218-227.
2 鄂征主编. 组织培养技术. 第二版. 北京: 人民卫生出版社, 1988.
国家自然科学基金资助项目(39500131)
(收稿：1997-08-20 修回：1998-01-19), 百拇医药
单位：400038重庆，第三军医大学西南医院皮肤科[伍津津(现在第三军医大学大坪医院野战外科研究所皮肤科) 刘荣卿 叶庆佾 唐书谦 钟白玉]
关键词：
中华皮肤科杂志/980423 真皮替代物和活性皮肤替代物的三维培养模型，对研究细胞的生长、分化、增生及真表皮间的相互作用有重要意义，也是研制大面积创面覆盖物——复合皮的一条重要途径[1]。
一、材料与方法
1.胶原：实验所用胶原为酸溶性鼠尾胶原，参照文献[2]的方法稍有改良进行提取，并用751紫外分光光度计测蛋白浓度为1.0～1.5mg/ml。
, http://www.100md.com 2.包皮成纤维细胞培养：应用组织块培养法进行正常包皮成纤维细胞原代培养。培养基为10%新生牛血清DMEM，每3天换液1次。3～4周后原代培养细胞生长成细胞单层，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3的比例分种细胞传代培养，每3天用含10%新生牛血清的DMEM换液1次。实验用第5～12代细胞。
3.细胞胶原凝胶的制作：
①将第5～12代处于指数生长期的包皮成纤维细胞分别用0.25%胰蛋白酶消化后制成悬液，计数，调整细胞悬液浓度为1.5×105个细胞/ml，取4ml细胞悬液离心，弃培养基，加入新生牛血清0.5ml。
②吸4ml鼠尾胶原溶液放入冰浴中的青霉素小瓶中，加入0.5ml浓缩10倍的DMEM培养基，及时混匀，平衡温度后加入0.1ml 1N NaOH以中和醋酸，快速混匀，确定pH为7.4左右后立即加入新生牛血清细胞悬液，快速混合，然后吸到24孔板中，每孔加0.8ml，共6孔；静置10分钟内便很快形成细胞凝胶，加入10%新生牛血清DMEM培养基进行培养，每周换液2次。试验重复3次。每日观察细胞
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的形态和收缩情况。
4.组织学检查：细胞凝胶块培养1～3周后进行组织学检查，用Bouin液固定24小时，常规组织切片，切片4μm厚，HE染色，镜下观察。
二、结果
(一)细胞的形态与分布：成纤维细胞胶原凝胶形成后呈半透明状态，随着细胞密度的增加，透明度稍降低，其质地与颜色近似真皮组织，有一定的弹性和抗拉性，不易碎，因此凝胶可以被握持搬动。当凝胶与培养皿壁分离后则凝胶块收缩如圆盘状飘浮在培养基的液面下，在倒置显微镜下可清楚地看到凝胶中各个层次的细胞及形态。接种后成纤维细胞在凝胶中的位置是相对固定的，并不象在普通培养基中那样迅速贴壁，说明此时成纤维细胞已经粘附在胶原支架上，约2小时后经胰酶消化后呈圆形的成纤维细胞表面逐渐伸展延长，形成2个以上的胞质突起，有的似星状，表明成纤维细胞已存活生长，开始与胶原发生粘着。随着培养天数的增加，这些突起在细胞的两极逐渐伸展延长，但突起数目逐渐减少，最后在细胞的两极形成两个较长的突起而成梭形。而且随着细胞凝胶的收缩，平行排列的细胞变得愈加致密，有时互相交织呈网络状。当细胞密度达到其极限后(大约培养2～3周后)，成纤维细胞可以象组织块中的成纤维细胞一样从胶原凝胶中迁出，导致细胞凝胶的贴壁生长。而细胞凝胶块可以一直培养3个月以上。
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(二)组织切片：培养2周后细胞凝胶做组织切片观察发现胶原呈较均一的淡红色，而成纤维细胞均匀地分布于胶原中，呈梭形，大多数细胞有的两极为两个较长的突起，极少数细胞有较多的突起，细胞较小，胞核呈椭圆形，胞浆少。
三、讨论
鼠尾胶原在结构和抗原性方面与人体组织的Ⅰ型胶原基本相同，它来源广泛，成分较为单一，制备比较方便，所以我们选用它作培养支架。我们的研究结果显示成纤维细胞在该胶原基质中能较长时间地保持活力，表明Ⅰ型胶原对这类成纤维细胞的生存具有良好的支持作用。
培养好的细胞凝胶称之为真皮替代物或类似物，是进行皮肤器官型培养和制作复合皮的关键与基础，因而操作者除了有过硬的无菌技术外，还要有灵巧的操作技术，我们的体会是：①真皮成纤维细胞、胶原和NaOH的比例一定要合适。NaOH中和胶原中的醋酸，使其达到正确的pH值(7.4)左右，细胞才不致于死亡，并有很好的生长活力。②胶原溶液应预置于0℃冰浴中。在常温下NaOH中和胶原醋酸溶液后在2分钟内便形成了凝胶，给混合细胞带来了困难，而预置于冰浴中便能显著延缓凝胶的形成时间。一般先将胶原溶液预置于冰浴中，加十倍浓缩培养基混合，然后去离心细胞，加新生牛血清混悬，再用NaOH快速中和混匀胶原，最后加入成纤维细胞悬液，这样便可将细胞均匀地混合于胶原凝胶中。③成纤维细胞的增生能力要强，应选择传代次数较少的处于指数生长期的细胞，而老化的细胞增生能力低，其收缩力差，制出的凝胶结构不紧密。④渗透压要在正常范围内，否则细胞不能存活。⑤胶原浓度不能过低，一般应在1mg/ml以上较好，形成的凝胶厚度较厚，有利于以后接种表皮细胞。
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参 考 文 献
1 Limat A, Breitkreutz D, Hunziker T, et al. Restoration of the epidermal phenotype by follicular outer root sheath cells in recombinant culture with dermal fibroblasts. Exp Cell Res, 1991,194∶218-227.
2 鄂征主编. 组织培养技术. 第二版. 北京: 人民卫生出版社, 1988.
国家自然科学基金资助项目(39500131)
(收稿：1997-08-20 修回：1998-01-19), 百拇医药